Name: 激光诱导冲击波在爆炸性耳蜗损伤研究中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: 了解激光诱导冲击波技术在建立爆炸性耳蜗损伤动物模型中的应用。该方法可避免鼓膜穿孔和全身性损伤，为研究感音神经性听力损失的病理机制及潜在治疗方案提供理想平台。

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本研究得到了日本学术振兴会（JSPS KAKENHI）两项基金的资助（基金编号 21K09573（K.M.）和 23K15901（T.K.））。

所有实验程序均经国防医学院机构动物护理和使用委员会批准（批准号：18050），并依照美国国立卫生研究院及日本文部科学省的指导方针进行。所有努力均旨在尽量减少实验动物数量及其所受痛苦。
1. 动物
<ol>
	<li>使用8周龄的雄性CBA/J小鼠进行本实验方案。实验前，对小鼠进行听力功能检测及鼓膜内窥镜观察，以确认其听力和鼓膜状态正常。</li>
	<li>将27只CBA/J小鼠分为三组：（1）2.0 J/cm2照射组（n = 9只小鼠）；（2）2.25 J/cm2照射组（n = 9只小鼠）；（3）2.5 J/cm2照射组（n = 9只小鼠）。在LISW照射后1个月，取所有小鼠耳组织进行评估。</li>
</ol>
LISW 暴露的实验设置
<ol>
	<li>激光靶标为黑色天然橡胶圆盘，直径10 mm，厚度0.5 mm。为增强LISW冲量，使用丙烯酸树脂焊接胶将一片厚度为1.0 mm的透明聚对苯二甲酸乙二醇酯膜（PET）粘附于靶区顶部。照射532 nm调Q Nd:YAG激光，在靶标后方产生LISW（图1A）。</li>
	<li>使用平凸透镜将激光脉冲聚焦至激光靶标上直径为3.0 mm的光斑。</li>
	<li>利用LISW辐照在两种材料的粘合界面处产生等离子体，并使橡胶汽化（等离子体介导消融），在空腔内留下汽化的橡胶物质。</li>
	<li>使用水听器在水下1.0 mm处测量LISW的压力波，而非在活体组织中测量。将直径0.25 mm的光纤水听器置于黑色橡胶下方、水面以下1.0 mm处，记录LISW压力波形，并通过数字示波器进行测量。 
	注意：压力波形表现出稳定特征，其最大压力和冲量相似，如图1B所示。</li>
	<li>所有动物实验均在全身麻醉下进行，腹腔注射盐酸美托咪啶1 mg/kg和氯胺酮75 mg/kg。对小鼠双眼涂抹眼用软膏以防止干燥，并提供保温支持。</li>
	<li>仔细剃除耳后区域毛发，避免毛发中残留空气。将小鼠固定于平板上，并使耳后区域朝垂直向上的方向置于LISW的焦点区域。</li>
	<li>将黑色橡胶靶标经皮贴附于小鼠耳部耳后区域。为确保声阻抗匹配，在激光靶标与皮肤表面之间使用超声耦合凝胶。</li>
	<li>通过颞骨向耳蜗施加单次LISW脉冲。将激光脉冲输出设定为三种能量密度：2.0 J/cm2、2.25 J/cm2和2.5 J/cm2。</li>
</ol>
3. 耳蜗功能检测
注意：听觉脑干反应（ABR）测试按照先前报道的方法进行14,15。
<ol>
	<li>在LISW暴露前1天以及暴露后1天和1个月进行ABR测量。</li>
	<li>ABR是一种对听觉刺激产生的听觉诱发电位，常用于评估四个频率（12.0 kHz、16.0 kHz、20.0 kHz和24.0 kHz）下的听力阈值。</li>
	<li>通过小型耳机给予刺激声，并使用置于耳机附近的微型麦克风测量小鼠鼓膜附近的声压级。由声源发生器以37 cycles/s输出脉冲刺激，将声压从20 dB声压级（SPL）逐步增加至80 dB SPL，步长为5 dB SPL。</li>
	<li>将不锈钢针电极插入耳道下方及耳部额区用于脑电图记录，并将接地电极插入尾部远端区域。</li>
	<li>通过测量ABR波I（P1）的振幅来评估耳蜗功能。使用ABR峰分析软件，按照先前报道的方法18，自动分析ABR波形的听力阈值和ABR P1振幅。</li>
	<li>通过减去暴露前获得的阈值来计算ABR阈值偏移量。将三个暴露组的ABR阈值偏移量与未暴露的对侧耳（对照组）进行比较。在80 dB SPL刺激期间，利用ABR波形测量ABR振幅。</li>
</ol>
4. 组织学评估
注意：组织学评估按先前所述方法进行14,15。
<ol>
	<li>毛细胞与耳蜗突触
	<ol>
		<li>在LISW暴露后1个月进行耳蜗的病理学检查。</li>
		<li>灌注前通过脚趾夹捏确认麻醉深度。用乳酸林格液进行血液灌注后，以每克体重1 mL的4%多聚甲醛（PFA）进行经心灌注。断头后取出耳蜗，并直接用4% PFA灌注，随后在4 °C下固定过夜。</li>
		<li>固定后，在0.5 mol/L乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中振荡脱钙2天。</li>
		<li>将脱钙后的耳蜗分为四段。每段耳蜗在干冰上冷冻10分钟，随后在室温下用含0.3% Triton X的5%正常马血清封闭1小时，以实现通透化。</li>
		<li>使用抗肌球蛋白7a（Myo7A）、抗C末端结合蛋白（CtBP2）和抗神经丝蛋白（NF）抗体作为一抗，在37 °C孵育过夜。分别使用Myo7A、CtBP2和NF抗体评估毛细胞、突触前带状结构和耳蜗神经纤维。</li>
		<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤5次，每次3分钟，去除未结合的一抗。将样本在37 °C下与适当的二抗孵育2小时。染色后，用PBS洗涤3次，每次5分钟，并将样本置于载玻片上，用水溶性封片剂加盖盖玻片封片。</li>
		<li>为进行评估，在10倍放大倍数下获取整个耳蜗（分为四段）的图像，并使用参考的ImageJ软件插件计算耳蜗频率图，以精确定位12.0 kHz、16.0 kHz、20.0 kHz和24.0 kHz频率对应的特定耳蜗区域。</li>
		<li>计算各频率下的毛细胞存活率及突触数量。
		<ol>
			<li>为计算毛细胞存活率，统计各频率下每200 µm长度内存活和缺失的毛细胞数量，并利用以下公式（1）计算毛细胞存活率： 
			毛细胞存活率 (%) = (存活毛细胞数 / 存活与缺失毛细胞总数) × 100&#160; (1)</li>
			<li>为计算突触数量，使用油浸物镜（63×）、3.1倍数字放大和0.25 µm步长，在共聚焦荧光显微镜下获取内毛细胞区域的高分辨率z轴层扫图像。将图像序列导入ImageJ软件，自动统计每张图像序列中50 µm范围内每个内毛细胞的CtBP2斑点数量。使用公式（2）计算突触带状结构的存活率： 
			&#8203;突触带状结构存活率 (%) = (LISW暴露耳的突触带状结构数量 / 对照耳的突触带状结构数量) × 100&#160; (2)</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对于扫描电子显微镜（SEM）分析，按前述方法取出耳蜗，然后在4 °C下用2% PFA和2.5%戊二醛联合固定过夜。在4 °C下用0.5 mol/L EDTA溶液振荡脱钙7天后，将耳蜗解剖为四段，用于整体封片制备。</li>
		<li>在4 °C下用1%四氧化锇固定组织30分钟，室温下依次用50%、70%、80%、95%和100%乙醇各脱水10分钟，进行锇喷镀，然后在5.0 kV电压下用电子显微镜观察，方法如先前报道14。</li>
		<li>利用SEM图像，通过计算各能量组中外毛细胞（OHC）中受损静纤毛的比例（受损OHC静纤毛数量 / 总OHC静纤毛数量），定量分析静纤毛束的破坏情况14。在16.0 kHz和24.0 kHz区域中心每100 µm统计静纤毛数量。将一个或多个排的OHC纤毛束向侧方弯曲、缠结或缺失基部的情况定义为受损。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>螺旋神经节神经元（SGNs）
	<ol>
		<li>为在LISW暴露后1个月定量评估SGN数量，进行4% PBS经心灌注，断头后取出耳蜗，并在上述相同条件下进行后固定。在0.5 M EDTA中脱钙1周。</li>
		<li>脱钙后，将耳蜗在30%蔗糖中浸泡过夜，包埋于冷冻切片包埋剂中，用液氮冷冻，制备厚度为15 µm的近Rosenthal管区域切片，经苏木精-伊红染色后在光学显微镜下观察14。</li>
		<li>为测量SGN密度，统计Rosenthal管中回转区域的SGN数量，并计算相对于对照组的SGN存活率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 统计分析
<ol>
	<li>使用选定的软件进行统计分析。</li>
	<li>采用双因素重复测量方差分析（ANOVA）[&#34;频率或耳蜗部位（顶回/中回/基底回）&#34; × &#34;动物组别&#34;]，以及双因素方差分析（ANOVA），随后进行事后Tukey多重比较检验，分析ABR阈值偏移、毛细胞（HC）、螺旋神经节神经元（SGN）及突触计数的统计学差异。</li>
	<li>所有数据均以均值 ± 标准误表示，统计学显著性水平设定为 p &#60; 0.05。</li>
</ol>

Characterization of LISW Effects on Cochlear Pathophysiology in Mice

<ol><li>Arun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blast+exposure+causes+long-term+degeneration+of+neuronal+cytoskeletal+elements+in+the+cochlear+nucleus%3A+A+potential+mechanism+for+chronic+auditory+dysfunctions%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurol%22%5BJournal%5D)">Blast exposure causes long-term degeneration of neuronal cytoskeletal elements in the cochlear nucleus: A potential mechanism for chronic auditory dysfunctions.</a> Front Neurol. 12, 652190(2021).</li>
<li>Kurioka, T., Mizutari, K., Satoh, Y., Shiotani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+blast-induced+tympanic+membrane+perforation+with+peripheral+cochlear+synaptopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Correlation of blast-induced tympanic membrane perforation with peripheral cochlear synaptopathy.</a> J Neurotrauma. 39 (13-14), 999-1009 (2022).</li>
<li>Liberman, M. C., Epstein, M. J., Cleveland, S. S., Wang, H., Maison, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+differential+diagnosis+of+hidden+hearing+loss+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Toward a differential diagnosis of hidden hearing loss in humans.</a> PLoS One. 11 (9), e0162726(2016).</li>
<li>Koizumi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Y-27632%2C+a+rock+inhibitor%2C+improved+laser-induced+shock+wave+%28lisw%29-induced+cochlear+synaptopathy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Y-27632, a rock inhibitor, improved laser-induced shock wave (lisw)-induced cochlear synaptopathy in mice.</a> Mol Brain. 14 (1), 105(2021).</li>
<li>Parthasarathy, A., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptopathy+in+the+aging+cochlea%3A+Characterizing+early-neural+deficits+in+auditory+temporal+envelope+processing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptopathy in the aging cochlea: Characterizing early-neural deficits in auditory temporal envelope processing.</a> J Neurosci. 38 (32), 7108-7119 (2018).</li>
<li>Kurioka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+laser-induced+shock+wave+injury+to+the+inner+ear+of+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Characteristics of laser-induced shock wave injury to the inner ear of rats.</a> J Biomed Opt. 19 (12), 125001(2014).</li>
<li>Paik, C. B., Pei, M., Oghalai, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+blast+noise+and+the+auditory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Review of blast noise and the auditory system.</a> Hear Res. 425, 108459(2022).</li>
<li>Bryden, D. W., Tilghman, J. I., Hinds, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blast-related+traumatic+brain+injury%3A+Current+concepts+and+research+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Blast-related traumatic brain injury: Current concepts and research considerations.</a> J Exp Neurosci. 13, 1179069519872213(2019).</li>
<li>Ma, X., Aravind, A., Pfister, B. J., Chandra, N., Haorah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+traumatic+brain+injury+and+assessment+of+injury+severity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Animal models of traumatic brain injury and assessment of injury severity.</a> Mol Neurobiol. 56 (8), 5332-5345 (2019).</li>
<li>Shao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+and+peripheral+auditory+abnormalities+in+chinchilla+animal+model+of+blast-injury%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Central and peripheral auditory abnormalities in chinchilla animal model of blast-injury.</a> Hear Res. 407, 108273(2021).</li>
<li>Ou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+brain+injury+induced+by+exposure+to+blast+overpressure+via+ear+canal%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Traumatic brain injury induced by exposure to blast overpressure via ear canal.</a> Neural Regen Res. 17 (1), 115-121 (2022).</li>
<li>Cho, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+hearing+loss+after+blast+injury+to+the+ear%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of hearing loss after blast injury to the ear.</a> PLoS One. 8 (7), e67618(2013).</li>
<li>Kurioka, T., Mizutari, K., Satoh, Y., Kobayashi, Y., Shiotani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blast-induced+central+auditory+neurodegeneration+affects+tinnitus+development+regardless+of+peripheral+cochlear+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Blast-induced central auditory neurodegeneration affects tinnitus development regardless of peripheral cochlear damage.</a> J Neurotrauma. , (2023).</li>
<li>Niwa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+the+inner+ear+after+blast+injury+caused+by+laser-induced+shock+wave%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of the inner ear after blast injury caused by laser-induced shock wave.</a> Sci Rep. 6, 31754(2016).</li>
<li>Kimura, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+shock+wave+power+spectrum+on+the+inner+ear+pathophysiology+in+blast-induced+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Effect of shock wave power spectrum on the inner ear pathophysiology in blast-induced hearing loss.</a> Sci Rep. 11 (1), 14704(2021).</li>
<li>Satoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+blast+injury+in+mice%3A+A+novel+model+for+studying+blast+injury+in+the+laboratory+using+laser-induced+stress+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Surg+Med%22%5BJournal%5D)">Pulmonary blast injury in mice: A novel model for studying blast injury in the laboratory using laser-induced stress waves.</a> Lasers Surg Med. 42 (4), 313-318 (2010).</li>
<li>Kawauchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+isolated+and+combined+exposure+of+the+brain+and+lungs+to+a+laser-induced+shock+wave%28s%29+on+physiological+and+neurological+responses+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Effects of isolated and combined exposure of the brain and lungs to a laser-induced shock wave(s) on physiological and neurological responses in rats.</a> J Neurotrauma. 39 (21-22), 1533-1546 (2022).</li>
<li>Cassinotti, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+neurotrophin-3+overexpression+at+mid-life+prevents+age-related+inner+hair+cell+synaptopathy+and+slows+age-related+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Cochlear neurotrophin-3 overexpression at mid-life prevents age-related inner hair cell synaptopathy and slows age-related hearing loss.</a> Aging Cell. 21 (10), e13708(2022).</li>
<li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+insult+to+injury%3A+Cochlear+nerve+degeneration+after+%26%2334%3Btemporary%26%2334%3B+noise-induced+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adding insult to injury: Cochlear nerve degeneration after &#34;temporary&#34; noise-induced hearing loss.</a> J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li>
<li>Hickman, T. T., Smalt, C., Bobrow, J., Quatieri, T., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blast-induced+cochlear+synaptopathy+in+chinchillas%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Blast-induced cochlear synaptopathy in chinchillas.</a> Sci Rep. 8 (1), 10740(2018).</li>
<li>Jiang, S., Sanders, S., Gan, R. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+protection+and+damage+mitigation+in+chinchillas+exposed+to+repeated+low-intensity+blasts%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Hearing protection and damage mitigation in chinchillas exposed to repeated low-intensity blasts.</a> Hear Res. 429, 108703(2023).</li>
<li>Nakagawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+primary+blast-induced+traumatic+brain+injury%3A+Insights+from+shock-wave+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of primary blast-induced traumatic brain injury: Insights from shock-wave research.</a> J Neurotrauma. 28 (6), 1101-1119 (2011).</li>
<li>Wu, P. Z., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+stereocilia+pathology+in+the+human+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Age-related stereocilia pathology in the human cochlea.</a> Hear Res. 422, 108551(2022).</li>
<li>Kurabi, A., Keithley, E. M., Housley, G. D., Ryan, A. F., Wong, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+noise-induced+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of noise-induced hearing loss.</a> Hear Res. 349, 129-137 (2017).</li>
<li>Kim, J., Xia, A., Grillet, N., Applegate, B. E., Oghalai, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotic+stabilization+prevents+cochlear+synaptopathy+after+blast+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Osmotic stabilization prevents cochlear synaptopathy after blast trauma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (21), E4853-E4860 (2018).</li>
<li>Hu, N., Rutherford, M. A., Green, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+cochlear+synapses+from+noise-induced+excitotoxic+trauma+by+blockade+of+ca%282%2B%29-permeable+ampa+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Protection of cochlear synapses from noise-induced excitotoxic trauma by blockade of ca(2+)-permeable ampa receptors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (7), 3828-3838 (2020).</li>
<li>Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophin-3+regulates+ribbon+synapse+density+in+the+cochlea+and+induces+synapse+regeneration+after+acoustic+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma.</a> Elife. 3, e03564(2014).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

本研究旨在利用激光诱导冲击波（LISW）验证一种爆炸所致耳蜗损伤的小鼠模型。研究结果表明，通过颞骨施加LISW后，暴露的小鼠耳蜗出现了持续性的病理和生理功能下降，且这种损伤程度随LISW超压的增加而加重。这些结果提示，通过调节LISW输出参数，该小鼠模型适用于复制多种耳蜗病理改变。具体而言，这种由LISW诱导的耳蜗功能障碍小鼠模型因其可控性、可重复性和可量化性，以及能够在受控条件下再现耳蜗的病理生理学衰退过程，有望成为一种良好的耳蜗损伤模型。
我们之前的研究采用大鼠模型，观察到LISW诱导的耳蜗退行性变，包括听阈升高、突触小带丢失以及静纤毛束紊乱14。另一项研究利用两种具有不同特性的冲击波——以低频为主的爆管冲击和以高频为主的LISW——在小鼠中研究了爆炸伤后耳蜗的病理生理学退变过程15。研究确定，冲击波功率谱中的主导频率是决定耳蜗损伤区域的主要因素，这与先前报道一致15。据我们所知，本研究首次详细展示了LISW耳蜗暴露的技术方法，并揭示了能量依赖性和频率依赖性的LISW诱导耳蜗退行性变。
我们利用液相脉冲冲击波（LISW）通过耳后颞骨暴露损伤耳蜗，而非通过外耳道，从而建立一种仅涉及耳蜗损伤、而不伴有鼓膜穿孔（TMP）或听骨链中断的模型。我们的研究结果表明，本研究中所表现出的听力损伤是由于听觉通路中感觉神经成分的退化所致。近期研究表明，鼓膜可作为缓冲结构，通过吸收冲击波能量来保护耳蜗免受损伤2,20,21。由于本LISW模型中的冲击波是直接照射至内耳，而非经由鼓膜传导，因此即使使用高强度LISW也无法诱导鼓膜穿孔。因此，若需分析伴有鼓膜穿孔和感音神经性听力损失（SNHL）的混合性听力损失，采用真实爆炸或冲击管产生的高强度爆炸波更为理想。爆炸类型的选择取决于研究的具体用途或目标。因此，这种基于LISW的动物损伤模型对于阐明单纯由爆炸引起的、不伴有鼓膜穿孔导致传导性听力损失的耳蜗病理生理机制具有重要价值。从另一个角度来看，每次LISW照射需耗时约1小时/只动物，包括设备设置及照射后检查鼓膜状态。因此，若在1天内连续对多只动物进行LISW照射，则难以在单次麻醉下于同一天内完成LISW照射和听性脑干反应（ABR）检测。考虑到增加麻醉剂量可能带来动物死亡风险，本研究决定在照射后的次日进行ABR测量，而非在同一天照射后立即进行。
在爆炸伤中，初级阶段由爆炸产生的物理力和冲击波（SW）的快速传播引起，尤其在组织密度发生显著变化的部位（如组织-空气交界处）更为明显22。因此，大多数爆炸引起的耳蜗损伤被认为源于初级阶段的冲击波作用6，这表明研究冲击波暴露所致的耳蜗损伤对于理解爆炸引起耳蜗功能障碍的机制至关重要。利用高能激光脉冲作用于固体材料产生冲击波的方法称为激光诱导冲击波（LISW）。既往研究已采用LISW建立爆炸所致创伤性脑损伤和肺损伤的动物模型16,17。在爆炸相关研究中使用LISW的优势包括：其造成的损伤模型可重复，并且损伤程度与激光强度相关，同时能够特异性地靶向目标器官，因为LISW不会影响靶区以外的区域。
本研究发现，LISW 会引起耳蜗毛细胞（HC）、螺旋神经节神经元（SGN）及其突触和静纤毛束的病理改变，这些改变与真实爆炸伤所造成的损伤相似12。各种形式的耳蜗损伤（如噪声性听力损失）所导致的损害可归因于两个基本因素：直接的机械应力和继发性代谢紊乱。我们提出，静纤毛束的破坏是由 LISW 的直接机械应力引起的首要病理变化。静纤毛结构紊乱是与年龄相关性听力功能障碍及噪声性听力功能障碍相关的常见病理表现23,24。目前尚未阐明导致静纤毛破坏的确切机制。既往研究表明，在爆炸暴露后 1 周即可观察到静纤毛的破坏12。这种独特形态学改变的可能原因在于，外排静纤毛与中排静纤毛之间的顶端连接（tip links）和侧向连接（side links）发生断裂14。此外，外排静纤毛的根丝结构（由肌动蛋白及 TRIOBP 等成束蛋白组成）也会受到机械性损伤15。
耳蜗受到损伤通常会导致代谢过程进一步紊乱，这种紊乱可能持续数天甚至数月19。特别是负责听觉信号处理的耳蜗突触，对爆炸暴露极为敏感25。我们的动物模型显示，听觉神经元（ANs）功能的退化——表现为听性脑干反应（ABR）P1波幅的下降——是由LISW引起的耳蜗损伤所致。LISW导致耳蜗突触病变的一种可能机制是内毛细胞（IHCs）过度释放谷氨酸，例如谷氨酸耳毒性26。LISW暴露会引起基底膜剧烈振动，导致IHCs过度释放谷氨酸，从而引发听觉神经元退化。LISW可模拟影响耳蜗的谷氨酸毒性类型，导致耳蜗突触病变，并在不损伤毛细胞（HCs）的情况下减少突触数量。另一种可能机制是LISW暴露可能损伤耳蜗支持细胞，而这些细胞通过释放神经营养因子影响听觉神经纤维（ANFs）的存活27。此外，LISW可能直接传递至听觉神经纤维并造成神经损伤。因此，我们建立的LISW诱导耳蜗损伤模型对于爆炸相关研究以及涉及耳蜗突触病变的多种耳蜗退行性病变的研究均具有重要价值。
迫切需要开发治疗干预措施以应对爆炸引起的听力损失，这凸显了针对耳蜗突触病或外毛细胞静纤毛束损伤的治疗策略的重要性。这些方法也可应用于具有类似病理机制的其他类型听力障碍。在我们的爆炸诱导耳蜗功能障碍模型中观察到了耳蜗突触病，提示其可能是一个有前景的治疗靶点。线性冲击波（LISW）可用于构建能够准确模拟爆炸所致耳蜗病理生理变化的小鼠模型，这些模型可用于研究多种类型的耳蜗功能障碍。
本研究存在若干局限性。首先，我们测量了12-24 kHz范围内的ABR阈值。根据先前的研究，LISW引起的耳蜗损伤会导致动物出现高频听力损失，这是由于冲击波的特性以及耳蜗基部的易损性所致。未来还需在更宽的频率范围（&gt;24 kHz）内开展进一步的ABR研究。其次，本研究仅对耳蜗进行了组织学评估，未对中枢听觉通路进行评估。爆震伤所致的听力损伤不仅局限于耳蜗，还涉及脑干和中枢听觉系统的复杂性损伤。未来有必要在LISW暴露的动物模型中对听觉中枢进行评估。

听力损失和耳鸣是最常见的残疾之一，在退伍军人中报告的比例高达62%1。已有研究表明，暴露于爆炸超压的个体可出现多种由爆炸引起的听觉并发症，包括感音神经性听力损失（SNHL）和鼓膜穿孔（TMP）2。此外，针对爆炸暴露人群的研究表明，即使听力阈值处于正常范围，爆炸暴露也常导致听觉时间分辨能力缺陷，这种现象被称为&#34;隐性听力损失（HHL）&#34;3。已有充分证据表明，在与爆炸相关的耳蜗病理中，内毛细胞（IHCs）与听觉神经元（ANs）之间的耳蜗突触存在显著丢失4。突触退化会导致听觉处理功能受损，并是HHL发生的主要因素之一5。因此，听觉器官是包含复杂且高度有序结构的脆弱组织。然而，冲击波在细胞水平上影响内耳的确切机制仍不明确。这主要是由于在实验室环境中难以精确模拟爆炸损伤的临床和力学复杂性，以及爆炸所致耳蜗病理的复杂性所致。
爆炸伤的主要成分为冲击波（SW），其特征是峰值压力迅速且显著升高6。爆炸伤的复杂性已在大量回顾性研究中得到广泛探讨7,8,9。目前存在多种用于产生爆炸的装置，例如压缩气体装置10、冲击管11和小当量炸药12，可在不同压力水平下工作。近年来开发的装置所产生的冲击波压力波形已非常接近真实爆炸的情况。建立爆炸所致感音神经性听力损失动物模型的一个重要原则是尽量减少除听觉损伤以外的并发损伤，以降低动物死亡率。因此，研究人员已开发出微型化冲击管装置，其输出可精确控制，使暴露动物极少死亡。然而，尽管这些动物模型通常会出现鼓膜穿孔（TMP）等并发症，但由于同时存在传导性听力损失，耳蜗功能的评估变得困难2。我们先前曾开展过使用耳塞进行耳部保护的爆炸伤动物研究，结果未发现TMP的发生13。耳塞可部分减轻严重的耳蜗损伤，但无法阻止中枢听觉神经退变或耳鸣的发生。因此，耳塞既能保护耳蜗，也能保护鼓膜。然而，为了研究爆炸伤引起的耳蜗病理生理变化，仍需要建立一种不伴随鼓膜穿孔的纯耳蜗损伤动物模型。
我们先前利用激光诱导冲击波（LISW）建立了大鼠和小鼠内耳的局部爆炸损伤模型14,15。该方法可在标准实验室条件下安全、简便地实施，并已被用于构建肺部和头部爆炸损伤模型16,17。通过改变激光类型和功率，可调节LISW的能量，从而控制耳蜗损伤的程度。LISW诱导的耳蜗损伤模型对于研究爆炸伤所致感音神经性听力损失（SNHL）的机制以及探索潜在治疗方法具有重要价值。在本研究中，我们详细描述了使用LISW建立小鼠爆炸性耳蜗损伤模型的实验方案，并展示了LISW暴露后小鼠耳蜗的退行性变化，包括毛细胞（HCs）、耳蜗突触以及螺旋神经节神经元（SGNs）的丢失，且这些损伤呈能量依赖性。

<table><tbody><tr><td>532 nm 调Q Nd:YAG激光器&amp;nbsp;</td><td>Quantel</td><td>Brilliant b</td><td></td></tr><tr><td>ABR波峰分析软件</td><td>Mass Eye and Ear</td><td>N/A</td><td>EPL 耳蜗功能检测套件</td></tr><tr><td>丙烯酸树脂焊接胶黏剂&amp;nbsp;</td><td>Acrysunday Co., Ltd</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦荧光显微镜技术</td><td>Leica</td><td>TCS SP8</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片包埋剂</td><td>Sakura</td><td>Tissue-Tek O.C.T</td><td></td></tr><tr><td>CtBP2 抗体</td><td>BD 转导</td><td>#612044</td><td></td></tr><tr><td>多层介质镜</td><td>SIGMAKOKI CO.,LTD</td><td>TFMHP-50C08-532</td><td>M1-M3</td></tr><tr><td>数字示波器</td><td>Tektronix</td><td>DPO4104B</td><td></td></tr><tr><td>耳机</td><td>CUI</td><td>CDMG15008-03A</td><td></td></tr><tr><td>水听器</td><td>RP声学有限公司</td><td>FOPH2000</td><td></td></tr><tr><td>Image J 软件插件</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>测量线</td><td>https://myfiles.meei.harvard.edu/xythoswfs/webui/_xy-e693768_1-t_wC4oKeBD</td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Keyence Corporation</td><td>BZ-X700</td><td></td></tr><tr><td>肌球蛋白7A抗体</td><td>Proteus Biosciences</td><td>#25&amp;ndash;6790&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>神经丝抗体</td><td>Sigma</td><td>#AB5539</td><td></td></tr><tr><td>平凸透镜</td><td>SIGMAKOKI CO.,LTD</td><td>SLSQ-30-200PM</td><td></td></tr><tr><td>Prism 软件</td><td>GraphPad</td><td>N/A</td><td>ver.8.2.1</td></tr><tr><td>扫描电子显微镜</td><td>日本电子株式会社</td><td>JSM-6340F</td><td></td></tr><tr><td>小型数字内窥镜</td><td>AVS Co. Ltd</td><td>AE-C1</td><td></td></tr><tr><td>超声耦合剂</td><td>日立阿洛卡医疗</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>可变衰减器</td><td>昭和欧普特龙有限公司</td><td>N/A</td><td>目前可提供的替代型号：KYOCERA SOC Corporation，RWH-532HP II</td></tr><tr><td>水溶性封装材料&amp;nbsp;</td><td>Dako</td><td>#S1964</td><td></td></tr></tbody></table>

激光诱导冲击波在研究爆炸所致耳蜗损伤中的应用

Research Application of Laser-Induced Shock Wave for Studying Blast-Induced Cochlear Injury

耳朵是对爆炸超压最敏感的器官，暴露于爆炸后常发生耳蜗损伤。爆炸暴露可导致感音神经性听力损失（SNHL），这是一种不可逆的听力损失，会严重影响生活质量。既往已有研究详细记录了由爆炸引起的耳蜗病理变化，例如毛细胞丧失、螺旋神经节神经元损伤、耳蜗突触丢失以及静纤毛结构紊乱等。然而，确定爆炸伤后耳蜗感音神经功能的退化具有挑战性，因为暴露于爆炸超压的动物通常会出现鼓膜穿孔（TMP），从而导致同时存在的传导性听力损失。为了评估纯粹的感音神经性耳蜗功能障碍，我们建立了一种基于激光诱导冲击波的爆炸性耳蜗损伤实验动物模型。该方法可避免鼓膜穿孔及伴随的全身性损伤，并能在激光诱导冲击波（LISW）暴露后以能量依赖的方式重现SNHL成分的功能性下降。该动物模型可为阐明爆炸所致耳蜗功能障碍的病理机制及探索潜在治疗方法提供研究平台。

LISW 波形 
在 2.0 J/cm2 条件下，对 LISW 压力波形的可重复性进行了 5 次测量，结果如下。波形总体相似且稳定，表现为快速上升，其时间宽度、峰值压力和冲量分别为 0.43±0.4 µs、92.1 ± 6.8 MPa 和 14.1 ± 1.9 Pa∙s（中位数 ± 标准差），符合冲击波（SW）的特征（图 1B）。LISW 的特征包括快速上升时间、高峰值压力、持续时间短以及以正压为主。当应用于生物组织时，目标组织通过凝胶直接接触活体组织，可认为施加于组织的冲击波与实测的冲击波特性基本一致。暴露于 LISW 后，使用小型数字内窥镜评估鼓膜穿孔（TMP）的发生情况。在 LISW 能量组中，所有小鼠均未出现鼓膜穿孔（图 1C）。
听觉评估 
通过听觉脑干反应（ABR）检查评估听觉功能。ABR 是对听觉通路中声音诱发电位的测量，其中 ABR P1 波代表耳蜗神经中累积的神经活动。激光诱导应力波（LISW）暴露后第 1 天，不同 LISW 组间受暴露耳的 ABR 阈值偏移存在显著差异（双因素方差分析，p < 0.05）。然而，在暴露后第 7 天，各组间的 ABR 阈值偏移无显著差异（双因素方差分析，p > 0.05）。这些结果表明，LISW 暴露引起的听力阈值变化在短期内具有组间差异性，但该效应在 7 天内恢复至无显著差异水平。 &lt; 0.0001; 图2A）。在2.25和2.5 J/cm²剂量组中，ABR阈值偏移的升高在LISW照射后持续达1个月之久2 组别（双因素方差分析，2.25 J/cm²）2, p &lt; 0.0001；2.5 J/cm2，p &lt; 0.0001）。特别是高频区域表现出明显的ABR阈值偏移升高。然而，在2.0 J组中，ABR阈值恢复至与照射前相比无显著差异的水平（双因素方差分析，2.0 J/cm²）2，p = 0.76），表明阈值升高具有能量依赖性。关于ABR P1振幅，所有接受LISW照射的组在照射后1天和1个月时，所有频率下的ABR P1振幅均显著降低（双因素方差分析，p &lt; 0.0001; 图2B）。未暴露耳（对照组；左耳）在LISW暴露后未表现出ABR听觉阈值的明显变化（数据未显示）。
毛细胞与螺旋神经节细胞的存活 
对接受激光诱导冲击波（LISW）处理的耳部进行显微观察，结果显示耳蜗未出现机械性损伤，例如听小骨骨折或脱位、圆窗膜破裂或耳蜗内出血（数据未显示），该结果与先前的研究发现一致6,14。
使用 Myo7A 对毛细胞（HCs）进行荧光免疫染色，使用 CtBP2 对突触带（synaptic ribbons）染色，使用 NF 对耳蜗神经染色的结果如图3A所示。各组均未观察到严重的耳蜗损伤，例如毛细胞或神经纤维的丢失。然而，各组间 Myo7A 阳性外毛细胞（OHCs）存活率的定量评估存在显著差异（双因素方差分析，p = 0.002；图3B）。2.5 J/cm2 组的 OHCs 存活率显著低于对照组，尤其是在高频区域（双因素方差分析，2.5 J/cm2，p = 0.0002）。然而，各组内耳蜗内毛细胞（IHCs）的存活率相近，表明外毛细胞对高能激光诱导应力波（LISW）更为敏感（双因素方差分析，p = 0.76）。突触带存活率的定量评估结果如图3C所示。与对照组相比，2.25 和 2.5 J/cm2 组的突触带数量均显著减少（双因素方差分析，2.25 J/cm2，p &lt; 0.0001；2.5 J/cm2，p &lt; 0.0001），且高频区域下降趋势更为明显，这与听觉脑干反应（ABR）阈值偏移和外毛细胞存活率的变化趋势相似。
接下来，评估了螺旋神经节神经元（SGN）的密度，如图3D所示。各组之间的SGN密度存在显著差异（双因素方差分析，p = 0.76），其中2.5 J/cm2组的SGN存活率显著低于对照组（双因素方差分析，2.5 J/cm2，p = 0.007）。然而，2.0 和 2.25 J/cm2组的SGN存活率与对照组相比无明显差异。该结果表明，耳蜗退行性变和听力功能障碍的严重程度取决于LISW的能量暴露剂量，这与ABR和毛细胞存活结果一致。
静纤毛束 
在2.25和2.5 J/cm2剂量组中，我们观察到听觉脑干反应（ABR）阈值在20 kHz以上频率出现约30 dB的显著升高，且这种升高在LISW照射后持续达1个月（如图2A所示）。然而，我们观察到的30 dB阈值偏移不能完全归因于外毛细胞（OHCs）的丢失、耳蜗突触的退变或螺旋神经节细胞（SGCs）数量的减少（图3）。先前的研究表明，当突触小带数量减少50%时，ABR阈值偏移仍较小19。因此，我们采用扫描电镜（SEM）进一步探究ABR阈值升高的原因。在LISW照射强度为2.5 J/cm2后，部分OHCs的静纤毛束出现结构紊乱，尤其在高频区域更为明显（图4A），这可能是LISW照射后ABR阈值升高的原因之一。对静纤毛束紊乱的定量评估显示，其紊乱比例在高频区域呈能量依赖性升高趋势（图4B）。
<img alt="激光诱导等离子体装置；介电镜，压力图；LISW，激波管；时间分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66396/66396fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：LISW的实验设置及压力分布图。（A）在动物体内产生LISW的实验装置。（B）设定为2.0 J/cm2时LISW压力波形的特征。（C）鼓膜的代表性图像。在所有接受LISW暴露的耳朵中均未观察到鼓膜穿孔（TMP）。作为对照，使用激波管展示了典型的爆炸所致鼓膜穿孔（黄色箭头）。缩略语：LISW = laser-induced shock wave（激光诱导激波）；PET = polyethylene terephthalate（聚对苯二甲酸乙二醇酯）；TMP = tympanic membrane perforation（鼓膜穿孔）；YAG = yttrium aluminum garnet（钇铝石榴石）；SHG = second harmonic generation（二次谐波产生）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66396/66396fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="ABR 阈值和振幅频率响应图；听觉研究，暴露后 1 天及 1 个月结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66396/66396fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：暴露于激光诱导冲击波（LISW）后的听觉脑干反应（ABR）结果。（A）暴露于 LISW 后第 1 天，所有组均观察到显著的 ABR 阈值偏移。2.25 和 2.5 J/cm2 组的 ABR 阈值偏移在暴露后 1 个月内仍显著升高。（B）暴露于 LISW 后第 1 天和第 1 个月，所有组的 ABR P1 振幅均显著降低。星号表示各组与暴露前数值相比具有显著差异（**p &lt; 0.001，****p &lt; 0.0001）。误差线表示均值的标准误。缩略语：ABR = 听觉脑干反应；LISW = 激光诱导冲击波；P1 = 第 1 波峰；SPL = 声压级。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66396/66396fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="毛细胞荧光、细胞存活率图表、突触带图示、听觉细胞组织学分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66396/66396fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：LISW 暴露后的耳蜗病理变化。 （A）暴露于激光诱导冲击波（LISW）后，耳蜗 20 kHz 区域 Corti 器经 Myo7A（蓝色）、CtBP2（红色）和 NF（绿色）染色的共聚焦荧光图像。（B）各组存活毛细胞的平均百分比显示在细胞耳蜗图中。定量评估显示，在 2.5 J/cm2 剂量下外毛细胞（OHC）显著丢失，但各组间内毛细胞（IHC）存活率无显著差异。（C）与暴露前相比，2.25 和 2.5 J/cm2 组的突触前带存活率显著降低。（D）LISW 暴露后 1 个月，各组螺旋神经节神经元（SGN）的代表性显微照片。在 2.5 J/cm2 剂量下，SGN 存活率显著下降。星号表示与暴露前值相比具有显著差异（**p &lt; 0.001，****p &lt; 0.0001）。误差线表示均值的标准误。比例尺 = 5 µm（A），100 µm（D）。缩写：LISW = laser-induced shock wave；IHC = inner hair cell；NF = neurofilament；OHC = outer hair cell；SGN = spiral ganglion neuron。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66396/66396fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="毛细胞静纤毛破坏分析；电镜图像及破坏率柱状图；显示暴露效应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66396/66396fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图 4：外毛细胞（OHC）的表面结构。 （A）暴露于激光诱导冲击波（LISW）一个月后，耳蜗柯蒂器官16 kHz和24 kHz区域外毛细胞静纤毛的代表性扫描电镜图像。在2.5 J/cm2组（24 kHz区域）方框区域的放大图像中可见静纤毛破坏。比例尺 = 2 µm。（B）随着LISW超压的增加，静纤毛破坏率升高。缩写：LISW = laser-induced shock wave；OHC = outer hair cells。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66396/66396fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

本文描述了利用激光诱导冲击波（LISW）建立爆炸所致耳蜗损伤动物模型的实验方案。将颞骨暴露于LISW可重现爆炸引起的耳蜗病理生理变化。该动物模型可为阐明耳蜗病变机制及探索爆炸伤潜在治疗方法提供研究平台。

耳朵是对爆炸超压最敏感的器官，暴露于爆炸后常发生耳蜗损伤。爆炸暴露可导致……

为了评估由爆炸暴露引起的纯感觉性神经性耳蜗功能障碍（继发于鼓膜穿孔），我们利用Razor产生的冲击波建立了一种实验性动物模型，用于研究爆炸所致的耳蜗损伤。该方法可避免鼓膜穿孔及伴随的全身性损伤，并能在直接暴露后以能量依赖的方式再现感觉神经性听力损失的功能下降。该动物模型可为研究爆炸引起耳蜗功能障碍的病理机制及探索潜在治疗方法提供理想的平台。首先，制备一个激光诱导冲击波（LISW）暴露装置。使用532纳米的Q开关Nd:YAG激光器照射该暴露装置，以在靶标后方产生LISW。通过平凸透镜将激光脉冲聚焦到靶标上，形成直径为3毫米的光斑。使用LISW辐照在两种材料的结合界面处产生等离子体，并使橡胶汽化，从而在空腔内留下汽化的橡胶。仔细剃除麻醉小鼠耳后的毛发，以避免毛发中滞留空气。将小鼠固定在平板上，使其耳后区域朝上，对准LISW的焦点区域。为了确保声阻抗匹配，在激光靶标与皮肤表面之间使用超声传导凝胶。将黑色橡胶靶标经皮固定于小鼠耳后区域。通过颞骨，以三种能量密度向耳蜗施加单次激光诱导冲击波脉冲。将接地电极插入尾部尾侧区域下方。然后将不锈钢针电极插入外耳道及耳部额区下方，用于记录脑电图。通过小型耳机给予刺激声，并在小鼠鼓膜附近测量声压水平。使用声源发生器产生37个周期的爆发性刺激声，并将声压级从20分贝逐步增加至80分贝，每步增加5分贝。通过测量听觉脑干反应（ABR）的P1波幅来评估耳蜗功能。随后，ABR波形分析软件将自动分析ABR波形，以确定听阈和ABR P1波幅。在LISW暴露后使用ABR进行听觉功能评估，结果显示，在较高能量水平下，ABR阈值在暴露后一天出现显著偏移，并持续一个月。每平方厘米两焦耳组的ABR阈值恢复至暴露前水平，表明存在能量依赖性效应。在LISW暴露后一天和一个月时，所有LISW辐照组在各频率下的ABR P1波幅均出现显著下降。在LASW暴露一个月后，对小鼠耳蜗进行病理学检查。首先用乳酸林格液进行血液灌注，随后通过心脏灌注4%多聚甲醛。小鼠断头后，取出耳蜗，并在4°C条件下用4%多聚甲醛直接灌注过夜。在获取耳蜗的完整图像后，使用 ImageJ 软件计算耳蜗频率图，以精确定位不同频率下的特定耳蜗区域。根据给定公式，计算各频率下毛细胞的存活率。在获取内毛细胞的高分辨率 Z 轴层扫图像后，计算突触数量。观察苏木精和伊红染色的耳蜗切片，并计数Rosenthal管中回螺旋神经节神经元的数量，以计算每例对照组的螺旋神经节神经元存活率。与对照组相比，荧光免疫染色显示所有实验组的耳蜗结构完整，毛细胞和神经纤维均无明显丢失。然而，定量评估结果表明，2.5 焦耳/平方厘米组的外毛细胞存活率显著降低。与此同时，各组之间的内毛细胞存活率保持一致。在较高频率组中，突触带状体数量显著减少。这与2.5焦耳每平方厘米组中螺旋神经节神经元密度的下降相一致，表明耳蜗的退变程度取决于LISW能量的暴露水平。

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科研

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