Name: 制备热塑性微流体通道 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-03T23:56:00.000+00:00
Duration: 16 min
Description: 学习使用微热压印和热键合技术制备热塑性微流控芯片，并通过固相萃取法分离核酸。该方法可用于PCR扩增和诊断检测，为生物医学工程研究提供高效平台。

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微流控通道由环状聚烯烃材料（Zeonex® 690R，Zeon Chemical Inc.，Louisville，KY）制成。Zeonex 的玻璃化转变温度（Tg）为 136°C，且具有紫外透明性，这对于多孔整体材料形成过程中所采用的光导向化学反应至关重要。微通道通过微热压印技术制备，使用的是具有微流控平台负形（逆向结构）特征的镍钴电铸主模具。热压印过程操作如下：
<ol>
<li>将模具和聚合物基底置于两个平行的金属压板之间。</li>
<li>将压板加热至压印温度（166°C），该温度高于Zeonex玻璃化转变温度（Tg）30ºC。</li>
<li>随后将压板压合约5分钟，并保持压力为250 psi。</li>
<li>将模具和基底从加热的压板中取出，冷却1-2分钟后，手动将其彼此分离。</li>
<li>在通道末端钻出直径为1.5 mm的孔，用于样品引入和收集。</li>
<li>将压印后的塑料基底与另一片Zeonex通过热键合形成封闭的微流控通道。在热键合前，可对压印基底和盖片进行紫外-臭氧或等离子体处理，以提高密封效率并确保封闭通道结构的保真度（Bhattacharyya和Klapperich，2007）。</li>
</ol>
在塑料微流控通道内制备固相萃取（SPE）柱
固相的制备是一个两步过程。首先，对制备好的微通道进行表面修饰，以增强SPE柱与塑料装置之间的粘附性。通过表面光聚合的方法对聚合物微通道的内壁进行功能化修饰。
嫁接操作步骤如下：
<ol>
<li>微通道中填充由乙二醇二丙烯酸酯（EDA）和甲基丙烯酸甲酯（MMA）按1:1比例混合的溶液，其中含3%的二苯甲酮（一种氢提取型光引发剂）。EDA、MMA和二苯甲酮均购自美国密苏里州圣路易斯市的Sigma-Aldrich公司。</li>
<li>将芯片置于紫外曝光仪（CL-1000 UV Crosslinker，UPV Inc.，美国加利福尼亚州Upland）中，在254 nm波长、200 mJ/cm2能量条件下进行10分钟紫外照射。接枝反应通过氢提取聚合机制进行，形成表面锚定的聚合物链，这些聚合物链将被整合到第二步单一体制备所用的聚合混合物中。</li>
<li>通过使用真空抽吸，以15 μL甲醇冲洗通道，去除未反应的过量单体。</li>
</ol>
光接枝反应后，微通道内形成一种微孔聚合物整体柱，可截留用于DNA提取的二氧化硅颗粒。 多孔整体柱 已制备 原位 如下所示：
<ol>
<li>将表面修饰的通道填充单体前驱体混合物，该混合物由BuMA（15% 质量分数）、EDMA（10% 质量分数）、1-十二醇（52.5% 质量分数）、环己醇（22.5% 质量分数）、DMPAP（占单体总质量的1%）以及0.7 μm二氧化硅颗粒（占预聚物混合物体积的15%）组成。二氧化硅微球购自Polysciences, Inc.（Warrington, PA），单体和致孔溶剂购自Sigma-Aldrich, St. Louis, MO。</li>
<li>将芯片置于紫外交联仪中，在200 mJ/cm2条件下照射1.1分钟以引发聚合反应，随后使用真空抽吸法以15 μL甲醇冲洗通道以去除未反应的单体。</li>
<li>然后将流体连接件（NanoPortsTM连接件，Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA）安装至微流控通道的进样口和收集口。</li>
<li>再使用注射泵以100 mL/小时的流速，用甲醇对多孔整体柱进行至少30分钟的冲洗。</li>
</ol>
在塑料微流控通道内制备碳纳米管裂解整体柱
CNT（碳纳米管）裂解整体柱的制备分为两个步骤。首先，将制备好的微通道以与塑料装置中固相萃取柱相同的方式进行表面修饰（接枝）。
光接枝反应完成后，微通道内形成了一种含有多壁碳纳米管的微孔聚合物整体柱。 多孔整体柱 已制备 原位 如下所示：
<ol>
<li>将多壁纳米管在环己醇中重悬，浓度为 2.27M。使用超声波细胞破碎仪（Branson Ultrasonic，美国丹伯里生产，Sonifier S-250D）在 50% 振幅和 50% 占空比条件下超声处理 30 分钟。该超声处理可有效形成稳定浓度为 0.5M 的碳纳米管悬浮液。碳纳米管购自 Nanolabs（美国马萨诸塞州布莱顿）。</li>
<li>表面改性的通道中填充类似的单体前驱体混合物，但此时使用环己醇 + 碳纳米管的溶液。该单体混合物组成为：BuMA（15% 质量分数）、EDMA（10% 质量分数）、1-十二醇（52.5% 质量分数）和环己醇 + 碳纳米管（22.5% 质量分数）。向该溶液中加入光引发剂 DMPAP（占单体总质量的 1.13%）。单体、致孔溶剂和 DMPAP 均购自 Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。</li>
<li>将芯片置于紫外交联仪中，在 120 mJ/cm2 条件下照射 0.9 分钟以引发聚合反应。随后将装置在交联仪中翻转 180 度，并在 120 mJ/cm2 条件下再次照射 0.9 分钟。通过真空抽吸，用 50 μL 甲醇冲洗通道以去除未反应的单体。</li>
<li>将流体连接件（NanoPortsTM 连接件，Upchurch Scientific，美国华盛顿州奥克港）安装至微流控通道的进样口和收集口。</li>
</ol>
用于CNT裂解整体柱的细菌样品制备
细菌样品的制备需在600 nm处测定光密度，以确保样品浓度不会过高，从而避免堵塞通道。
<ol>
<li>使用分光光度计（Eppendorf BioPhotometer，Eppendorf Scientific, Inc.，Westbury, NY）在600 nm处测定菌液的光密度（OD）。将样品稀释至OD读数在0.18–0.25 A范围内。</li>
<li>将样品以6,500 rpm离心5分钟，弃去上清液。</li>
</ol>
裂解
<ol>
<li>将细菌重悬于 GuSCN* + 0.01% SDS + 4% 蛋白酶 K（0.8 mg/ml）溶液中。短暂涡旋振荡（培养基中的 1 ml 细菌应重悬于 1 ml GuSCN 溶液中）。添加蛋白酶 K 有助于变性与细菌 DNA 结合的蛋白质，并抑制 DNA 酶和 RNA 酶的活性。蛋白酶 K 的另一个优点是还能帮助降解细胞壁蛋白，这是有益的，因为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁均含有大量蛋白质（尽管革兰氏阴性菌通常含有更多的蛋白质）。变性剂缓冲液可辅助蛋白酶 K 变性蛋白质，而表面活性剂则破坏细胞壁。蛋白酶 K 和硫氰酸胍（GuSCN）购自 Qiagen Inc.（Valencia, CA）。SDS（十二烷基硫酸钠）购自 Pierce（Rockford, IL）。</li>
<li>立即将样品装入连接至 PEEK 管路的注射器中。抽吸注射器，确保系统内无空气。将管路连接至纳米端口和通道。</li>
</ol>
使用 KDS100 注射泵（由美国马萨诸塞州霍利斯顿 KD Scientific 公司生产）进行实验，所有步骤的流速均为 450 μL/小时。以 450 μL/小时的流速流经样品裂解通道。
<ol>
<li>采集样本，并通过固相萃取法（SPE）进行DNA提取（参见DNA提取方案）。注意：该细菌样本无需执行上样步骤2，因为其悬浮液为GuSCN*。</li>
</ol>
DNA 提取方案
提取过程包括以下3个步骤：
<ol>
<li>上样。</li>
<li>洗涤。</li>
<li>洗脱。</li>
</ol>
实验中使用 KDS100 注射泵（由美国马萨诸塞州霍利斯顿 KD Scientific 公司生产），所有步骤的流速均为 300 μL/小时。
加载
<ol>
<li>实验开始前，用变性剂缓冲液（GuSCN*，硫氰酸胍）对通道进行1-2分钟的预处理。</li>
<li>将样品与变性剂缓冲液按1:1比例混合。</li>
<li>使样品混合物流经通道3分钟。</li>
</ol>
洗涤
<ol>
<li>用70%乙醇冲洗通道2分钟。</li>
<li>用100%乙醇冲洗通道2分钟。</li>
</ol>
洗脱
<ol>
<li>用 Millipore 水洗脱提取的 DNA，持续 3 分钟。收集 15 μL 纯化后可直接用于 PCR 的 DNA。</li>
</ol>
*使用了Qiagen试剂盒中的硫氰酸胍（Buffer RLT）。
&nbsp;

<ol><li>Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+and+chemical+analysis+of+plasma+and+ultraviolet-ozone+surface+treatments+for+thermal+bonding+of+polymeric+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Mechanical and chemical analysis of plasma and ultraviolet-ozone surface treatments for thermal bonding of polymeric microfluidic devices.</a> Lab Chip. 7, 876-882 (2007).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

热塑性微流控通道的制备

Fabrication of the Thermoplastic Microfluidic Channels

在本实验室中，我们已成功利用聚合物/纳米颗粒复合微尺度裂解与固相萃取柱，直接从微量及亚微升级别人类血液、尿液和粪便样本中分离出核酸。所获得的样品浓度高、体积小，可直接用于PCR扩增，无需额外纯化步骤。本文中，我们演示如何通过热压印和热封接技术制备热塑性微流控芯片；随后演示如何在密封芯片内通过原位光引导表面接枝与聚合反应，形成复合型固相萃取柱。我们展示了碳纳米管/聚合物复合柱用于细菌细胞裂解的接枝与聚合过程；接着展示在芯片上利用二氧化硅/聚合物复合柱对样本进行裂解及后续核酸的固相萃取。附带的实验方案包含制备裂解柱和固相萃取柱的详细操作步骤。

关键词：核酸提取，微流控芯片，热压印，热封接，原位光引导接枝，聚合反应，碳纳米管/聚合物复合材料，二氧化硅/聚合物复合材料，固相萃取，细胞裂解，微量样本，血液，尿液，粪便，PCR

本文演示了如何采用热压印和热封接技术制备热塑性微流控芯片。随后，我们展示了如何通过已封接的芯片进行原位光引导表面接枝与聚合，以形成复合固相柱。

在我们的实验室中，我们已成功地直接从微量及亚微升级别人血液、尿液和粪便样本中分离出核酸，所用方法为……

大家好，我叫Aida Pria，刚刚在波士顿大学Katherine KLAS博士的实验室完成了我的博士学位。今天我将演示如何使用微热压印和热键合技术来制备热塑性微流控装置。随后，我将演示如何利用含有二氧化硅颗粒的固相方法来分离核酸，所提取的核酸可用于PCR扩增检测或任何其他诊断模块。大家好，我叫Dominika Kalinski，是波士顿大学生物医学微器件与微环境实验室的一名研究生。我将介绍在微流控装置中制备碳纳米管裂解整体柱，以及用于DNA提取的固相萃取整体柱的方法。今天我们将演示在热塑性微流控通道内制备和应用微尺度裂解柱与固相萃取柱的实验。这些层析柱可用于细菌细胞裂解及从细胞裂解液中分离核酸。该过程的第一步是微流控装置的制备。在环状聚烯烃中，我们使用一种聚合物，商品名为xx XX six 90 R，其玻璃化转变温度为136摄氏度，且具有紫外透光性。在微流控通道内多孔整体柱的制备过程中，所采用的光导向化学反应对紫外透明性要求非常高。该微流控平台采用微热压印和热键合技术制备。首先，我将演示微热压印过程。首先，我们使用一个母模，该母模是一种镍钴电铸成型模具，其表面具有微流控平台所需结构的负形或反向特征。因此，我们将Zion Nex胶条放置在塑料基底所需结构的上方。随后将模具放入热压机中，加热至高于聚合物玻璃化转变温度30摄氏度的温度。然后用另一块金属板覆盖，并加压至约 50 至 500 PSI 之间的任意压力即可。5 分钟后，可释放压力并取下 PLA。让其稍微冷却，然后手动分离两块金属板，即可将模具从基底上脱模。这是基底的外观。将其从模具中取出后，我们在通道两端钻出1.5毫米的孔，用作样品导入和收集孔。然后将此压印后的基底与另一片平整的塑料材料通过热键合方式结合，从而形成并封闭微流控结构。将两块材料以这种方式粘贴在加热板上。温度降低至聚合物的玻璃化转变温度，即 136 °C。在热键合过程中，再次将金属板放入加热至玻璃化转变温度（即 136 °C）的热压机中，并在 250 PSI 压力下压合两分钟。在玻璃化转变温度下，聚合物开始熔化并融合在一起，从而形成封闭的微流控结构。两分钟后，释放压力。最终的微流控器件即呈现为具有封闭通道以及用于样品引入和收集的接入端口。接下来，我们将为多孔聚合物整体材料的形成准备微通道。该过程的第一步是接枝过程。我们改变微通道和 Xan X six 90 R 平台的表面化学性质。这是为了能够在微通道内实现多孔聚合物整体材料的共价结合。这种表面修饰是一种接枝过程，涉及乙二胺（EDA）与甲基丙烯酸甲酯（MMA）以1:1的比例反应，并使用光引发剂苯偶酰。因此，我在此步骤中将MMA和EDA以1:1的浓度加入溶液中，再添加3%的苯偶酰，以便在通道内实现该整体柱的交联。将接枝溶液混合后，将其注入微通道中，利用毛细作用使溶液充满整个通道。通道充满后，将其放入紫外交联仪中，在200毫焦耳/平方厘米的能量下交联10分钟。经过10分钟的紫外照射后，用甲醇冲洗接枝溶液和微通道，并使用真空抽滤法进行处理。我将在这里使用真空法，将甲醇置于通道的一端，并用甲醇冲洗通道，以去除任何未发生聚合的过量溶液。这是环己醇、乙醇和环己烯的对比结果，三者均含有浓度为 2.27 mol/L 的碳纳米管。将对含有碳纳米管的环糊精进行涡旋处理，以实现碳纳米管在溶液中的均匀分散。经过接枝过程后，表面化学性质已发生改变，现已准备好在微通道内牢固固定整体柱。接下来我将描述碳纳米管VICIS整体柱的形成过程。该体系由基因成分、溶剂和单体组成。参与此过程的四种组分分别为丙烯酸烯丙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）、甲基丙烯酸丁酯和乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）。此外，我们加入一种光引发剂，以便通过紫外光聚合在原位形成整体柱。我将制备100微升的样品。用移液器吸取52.5微升的ecol。由于ecol具有黏性，此步骤需缓慢进行。完成 ecol 后，我们将加入带有环醇的碳纳米管。需要剧烈涡旋振荡几分钟，以确保充分分散。同样，我们必须缓慢移取环醇和碳纳米管，因为这是 Abicus 溶液。然后加入15 µL的甲基丙烯酸丁酯，最后加入10 µL的EDMA。短暂涡旋混匀后，加入光引发剂，随后进行超声处理。我们向裂解整体柱中添加的光引发剂是 DM PAP。该光引发剂以 1.13 的浓度加入到此 100 µL 溶液的总体积中。加入后，由于这是光引发剂，我们需要遮盖住整体柱溶液，以确保在超声处理过程中不发生光照暴露。此样品将在50%振幅和50%占空比条件下超声处理30分钟。采用50%占空比是为了避免溶液过热。超声处理后，必须立即取出溶液并迅速操作。这是因为我们需要确保溶液中的碳纳米管均匀分散，因为接下来要将溶液移液至微通道中。这里是裂解溶液。在超声处理后，迅速操作，利用毛细作用将液体吸入微通道，溶液便会流入通道内。我们将此样品放入交联仪中，在120 mJ/cm²的能量水平下处理0.9分钟。经过0.9分钟后，我们翻转该装置。这种翻转操作主要是为了实现更均匀的聚合反应，并使通道中的碳纳米管分布更加均匀。单体聚合并用甲醇冲洗后，单体溶液中的整体柱将不再透明，而是呈现明显的白色，其中会分布有微小的黑色斑点，这些即为整体柱中的碳纳米管。固相萃取整体柱的制备方法与含碳纳米管的裂解整体柱类似。这是细菌和液体培养物，此处为我们培养基的样品。样品稀释后，将其用移液器转移至离心管中并进行离心。随后倾倒上清液，注意不要扰动附着在离心管壁上的细菌沉淀。接着将细菌沉淀重悬于含有异硫氰酸胍、二乙胺、硫氰酸钠、SDS 和蛋白酶 K 的溶液中。所加入的异硫氰酸胍溶液体积与之前悬浮细菌的体积相同。此处，细菌悬浮于 1 mL 溶液中，因此我将用 1 mL 的硫氰酸胍溶液重新悬浮细菌。接下来加入蛋白酶 K，我将加入 45 µL 的 RNAs。最后加入的溶液是 SDS。此后，将溶液进行涡旋振荡。涡旋振荡后，我们将用移液器将细菌样品转移至一次性注射器中。此处我们使用的是3毫升的Excel一次性注射器。该装置配有接头，可连接至峰流管路，并通过纳米接口与我们的设备相连。接下来，我将把溶液移液至一次性注射器中。我们需要进行抽吸，以确保系统中无空气存在。您需要持续操作，直到另一端有一滴或两滴液体流出为止。现在，我们的溶液已准备好连接到设备，我们将一次性注射器安装到KDS注射泵上，并将接头的一端连接到我们的许可设备，该设备两端带有纳米接口，我们已在每端进行了固定。这样可确保与设备形成牢固的连接。这些是螺纹接头，通常我们会用胶带将装置固定，以确保其不会翻转。此处我们将流速设定为每小时四到五毫升。这是一种位移泵，会将溶液通过注射器、经由管路压入此连接通道中。我们将通过此出口纳米端口收集样品。可以使用移液器收集污染物，该污染物将进入下一阶段，即固相萃取过程，以分离细菌DNA，用于核酸的提取。含有二氧化硅颗粒的固相需用含有裂解缓冲液的胍硫氰酸盐进行预处理。通过将裂解缓冲液注入注射器并将其连接至注射泵，以每小时300微升的流速将缓冲液流经通道来完成此步骤。随后进行样品加载。此处的样品是我们从先前裂解步骤中获得的细菌细胞裂解液。再次上样，此样品在每小时 300 微升的流速下加载 3 分钟。随后，以每小时 300 微升的相同流速，用 70% 乙醇冲洗通道。此洗涤步骤可去除所有吸附的蛋白质和污染物，废液从收集端收集。洗涤步骤后，使用移液器吸取液体，该步骤可去除所有污染物。结合在二氧化硅上的DNA随后被洗脱到水中。因此，这是一个含有纯水的注射器。将其连接到芯片上，再次以每小时300微升的流速通水，并在另一端收集样品。此过程持续三分钟，收集到15微升的洗脱液，该洗脱液仅为溶于水的纯DNA，可直接用于PCR，并适用于热塑性器件的制备。最大的挑战在于热键合环节，因为键合需在高温下进行，通常处于或接近聚合物的玻璃化转变温度，在施加一定压力的情况下，压力或温度的微小波动都可能导致微通道完全破坏，或在两个塑料部件之间形成不良密封。因此，保持最佳的温度和压力非常重要，但也具有一定的挑战性。该过程中具有挑战性的关键因素在于，如何在单体溶液中实现碳纳米管的均匀分布，该溶液随后将进行原位紫外光聚合。这与在用于固相萃取的多孔聚合物整体柱中实现二氧化硅颗粒的均匀分散所面临的挑战类似。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

制备热塑性微流体通道

来源：Kurz, D. L., 等。用于研究多孔介质中生物堵塞的微流控平台。J. Vis. Exp.

一种用于生物膜形成过程中实时成像与压力追踪的微流控装置

一种微通道芯片平台通过结合光刻可重铸光刻胶技术、软光刻技术和微流控技术而开发。该内皮化微通道平台可模拟三维（3D）几何结构 体内...

多深度圆形截面血管内皮化微通道芯片的制备方法

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预设计尺寸与形状的聚合物及生物杂化纤维的微流控制备

本文描述了一种用于制备具有透明观察窗的塑料微流控器件的方案，该器件适用于可见光和红外光成像。...

一种用于制备对可见光和红外光透明观察窗的塑料微流控器件的软光刻工艺

具有可变形侧壁的微流控通道可在使用过程中实现流量控制、颗粒操控、通道尺寸定制及其他可重构功能。本文描述了一种制备微流控通道的方法，其侧壁由一组针状结构阵列构成，可实现侧壁形状的改变。...

具有离散化销钉侧壁的可重构微流控通道

目前已有多种方法可用于在聚二甲基硅氧烷微流控器件中制备具有非矩形截面的通道。大多数方法涉及多步制造过程和复杂的对准操作。本文报道了一种通过聚二甲基硅氧烷顺序湿法刻蚀实现不同几何横截面微流控通道制备的单步方法。...

通过连续湿法刻蚀工艺一步法制备不同几何截面的聚二甲基硅氧烷微流控通道

本方案描述了使用MY133-V2000制备微流控装置的方法，以消除由于微通道结构与水溶液之间折射率不匹配而常在微通道中产生的伪影。本方案采用丙烯酸支架压缩封装后的装置，从而在化学和机械层面增强粘附性。...

用于生物医学微流控的折射率匹配器件的制备

本文介绍了一种以最少的资金和时间投入设计和制备定制化微流控装置的实验方案。其目的是促进微流控技术在生物医学研究实验室及教育环境中的应用。...

用于科研与教学应用的定制微流控器件的快速制备

微流控技术是开发诊断检测方法的有力工具。然而，该技术通常需要昂贵的设备和材料，以及繁琐的制备和操作步骤。本文详细描述了一种丙烯酸微流控装置的制备方案，可用于低成本且易于使用的磁性微纳米粒子免疫分析。...

用于磁性纳米颗粒免疫分析的阶梯式微流控丙烯酸装置的计算机数控微铣削

本方案描述了一种微流控平台，通过结合高分辨率显微成像与同步压力差测量，用于研究生物膜在准-二维多孔介质中的发育过程。该平台可量化多孔介质中孔隙尺寸和流体流速对生物堵塞的影响。...

一种用于研究多孔介质中生物堵塞的微流控平台

学习使用微热压印和热键合技术制备热塑性微流控芯片，并通过固相萃取法分离核酸。该方法可用于PCR扩增和诊断检测，为生物医学工程研究提供高效平台。

热塑性微流控通道的制备

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