通过测量细菌清除率定量秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的食物摄入量

我的研究重点是解析药物诱导摄食行为变化背后的转录与代谢通路。我致力于鉴定能够减少摄食量并延长寿命的药物，这表明其可能激活了有益的禁食相关通路。通过我们建立的细菌清除实验，我们鉴定了两种不同的通路，分别调控5-羟色胺诱导的摄食行为和抗精神病药物诱导的摄食行为。

我目前正在研究这些通路如何与摄食行为及长寿突变体相关联。本实验方案使研究人员能够探究摄食与寿命之间的关系。摄食速率通常通过咽部泵动来表征。

然而，秀丽隐杆线虫（C. elegans）的泵动速率并不一定与摄食量成正比。将本方案与之前的检测方法结合使用，可提供每单位线虫群体摄食量的定量数据。我们的检测方法使我们能够利用小分子对摄食进行定量调控，并同时确定所诱导的摄食变化如何影响寿命。

首先，将一个OP50菌落接种到含有氨苄青霉素和两性霉素B的5毫升LB培养基中，在37摄氏度的细菌摇床中培养约6小时。当培养物变浑浊后，将OP50预接种培养物按1:2,000的比例稀释至含有氨苄青霉素和甘油的250毫升TB培养基中。然后将OP50液体培养物转移至无菌离心管中。

在4°C条件下，将离心管于台式离心机中以3,100 ×g离心15分钟。弃去上清液，将OP50菌体沉淀重悬于无菌水中，随后再次离心。第二次洗涤后，弃去上清液，将OP50菌体沉淀重悬于50毫升无菌水中。

将其转移至已预称重的50毫升锥形离心管中，离心20分钟以沉淀OP50。离心结束后，小心移除所有上清液，确保管内无残留水分。通过从含有沉淀的离心管重量中减去空离心管的重量，计算沉淀物的重量。

将OP50菌体沉淀物充分重悬于S-Complete缓冲液中，使其浓度达到100毫克/毫升。将OP50悬液涂布于琼脂平板上，检测是否存在污染。将OP50悬液溶于S-Complete缓冲液中，于4°C保存。

首先，选择一个含有饥饿状态L1期秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）幼虫的线虫生长培养基（NGM）平板。用1毫升无菌水轻轻冲洗平板上的线虫。将约300微升的线虫悬液分装到接种了浓缩OP50大肠杆菌的NGM平板上。

使用平板干燥器或本生灯将平板晾干，随后在20摄氏度下培养，直至大量个体发育为怀卵成虫。收集线虫时，用最多10毫升无菌水冲洗平板表面，将线虫与水的混合液转移至15毫升锥形管中。静置约四分钟，依靠重力使线虫沉降至管底。

使用小型移液器吸头，小心吸出上清液并弃去。然后加入最多15毫升无菌水。最后一次洗涤后，移除上清液，并加入5毫升 freshly prepared 的次氯酸钠和氢氧化钠溶液。

将线虫在室温下孵育5分钟，每隔1分钟涡旋振荡至少10秒。使用解剖显微镜监测反应进程。当所有成虫完全裂解或溶解后，加入M9缓冲液以中和反应，最终体积调至15毫升。

然后在1,300 × g条件下离心试管2分钟。通过离心，用13毫升M9缓冲液再洗涤卵子两次，随后用15毫升S-Complete缓冲液洗涤一次。然后在1,300 × g条件下离心卵子2分钟。

离心后，吸除上清液，并加入10毫升S-Complete缓冲液。使用摇床或类似装置，在室温下轻轻旋转过夜。利用解剖显微镜观察，判断线虫是否已孵化。

在显微镜下计数 S 缓冲液中 10 微升液滴内的线虫。用含有羧苄青霉素、两性霉素 B 和 OP50 的 S-Complete 培养基制备液体线虫混合液，浓度为每毫升 60 条线虫。将含线虫的培养基 120 微升加入 A 至 G 行，不含线虫的培养基加入 H 行。然后用封板膜密封培养板，防止污染和蒸发。

将密封的培养板在20摄氏度下孵育约65小时，直至动物发育为L4期幼虫。向每孔加入30微升0.6毫摩尔的氟代脱氧尿苷储备液，以在L4阶段使动物绝育。使用封板膜重新密封培养板，并在微孔板振荡器上以800转/分钟振荡20分钟。

将培养皿放回20 °C的培养箱中。次日，向第1天的线虫培养物中加入目标药物。用封口膜重新密封培养皿，并在板式摇床中以800 ×g振荡20分钟。

然后，打开盖子和密封膜后，使用酶标仪测量第1天的OD600。重新密封后，将培养板放回20摄氏度的培养箱中。使用倒置显微镜（最好配备2倍物镜），对每个孔中的线虫数量进行计数，并将数据记录在电子表格中。

计数后，将培养皿放回 20 摄氏度的培养箱中。摄食量变化倍数随血清素浓度变化的剂量反应曲线显示，N2 品系能够以剂量依赖的方式过度进食。daf-16 mu86 突变体的基础摄食量高于 N2，但其无法像 N2 品系一样以剂量依赖的方式对血清素产生反应。

在用洛沙平处理但分别喂食经X射线、γ射线或甲醛固定杀死的细菌的线虫中，其摄食量存在显著差异。一系列遗传品系的摄食量比较显示，exc-4和cgr-1突变体摄食较少，而srp-6突变体摄食较多。