基于生物发光共振能量转移（BRET）的活细胞内CRAF与14-3-3蛋白相互作用检测方法

本研究的主要目标是通过研究与罕见疾病相关的RAS-MAPK信号通路中的突变，揭示该通路中的新弱点。我们近期开发了一种基于BRET的检测方法，用于在活细胞中测量RAF激酶的自抑制活性。重要的是，该方法对于表征一组位于B-RAF半胱氨酸富集区的罕见种系突变至关重要，结果证明该结构域在维持B-RAF自抑制以及防止其持续性生物学活性方面具有关键作用。

该实验检测14-3-3蛋白与RAF激酶C-RAF之间的相互作用，这些相互作用在发育和疾病过程中对介导RAF功能具有重要作用。此外，本实验与先前建立的用于检测RAF自身抑制及RAS与RAF相互作用的实验方法相结合，构成了在活细胞中解析RAF激酶调控机制的工具包。首先，取培养于10厘米培养皿中的293 FT细胞，吸除培养基。

用5 mL PBS洗涤细胞。然后加入1 mL胰蛋白酶EDTA，于37°C孵育3至5分钟，使细胞从培养皿上脱落。孵育结束后，向细胞中加入9 mL完全DMEM以中和胰蛋白酶。

反复吹打以形成均匀的单细胞悬液，并将细胞转移至15毫升离心管中。立即取20微升细胞悬液转移至1.7毫升离心管中，加入20微升台盼蓝染液混匀。使用自动细胞计数仪或血细胞计数板进行细胞计数。

将适当体积的细胞转移至50毫升离心管中，并用完全DMEM稀释。向六孔板的每个孔中加入2毫升细胞悬液。将细胞在37°C、10%二氧化碳条件下孵育过夜。

转染前，用 TE 缓冲液稀释纳米荧光素酶 C-RAF 和 1433 zeta halo 质粒，以及 PC DNA 3 空载体。标记一组无菌的 1.7 毫升离心管。向每根离心管中加入 100 微升转染培养基以及表达载体。

现在加入两微升转染试剂，轻轻涡旋混匀。将离心管在微量离心机中短暂离心，然后在约25摄氏度条件下孵育15分钟，使转染复合物形成。随后，将转染复合物逐滴加入细胞中，在37摄氏度孵育16至20小时，以表达Halo和Nano标签蛋白。

首先，标记三组无菌的1.7毫升离心管和一组无菌的15毫升锥底离心管。安装适配15毫升离心管的水平转子离心机，并预冷至4°C。取出转染了293 FT细胞的六孔细胞培养板。

吸出孔中的培养基。每孔加入 250 µL 胰蛋白酶 EDTA，于 37 °C 培养至细胞开始脱落。然后每孔加入 1 mL 含 10% FBS 的检测培养基，剧烈吹打以形成单细胞悬液。

将1毫升细胞悬液转移至预先标记的15毫升离心管中。向每根离心管中加入1毫升含10% FBS的培养基，轻轻倒置混匀5次。随后立即取20微升细胞悬液转移至第一组离心管中。

现在将15毫升离心管在预冷的离心机中以250 ×g离心5分钟。取第一组细胞，用20微升台盼蓝细胞染液进行染色，并使用细胞计数仪或血细胞计数板进行计数。从离心机中取出15毫升离心管后，吸除细胞沉淀中的培养基，并将沉淀重悬于无血清的检测培养基中，制成单细胞悬液。

将细胞重新接种至384孔板和6孔板时，需将15毫升离心管颠倒数次以获得均匀的细胞悬液，并将500微升细胞悬液转移至第二组和第三组的1.7毫升离心管中。向第二组加入0.5微升DMSO，向第三组加入0.5微升Halo 618配体，充分混匀。将含DMSO和含配体的阳性细胞悬液分别转移至试剂储液板的不同孔中。

使用多通道移液器将每种悬浮液各40微升转移至384孔培养板中。将剩余细胞转移至新的六孔培养板中，用于后续的蛋白质印迹分析，并将384孔板和六孔板在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜。取预先在37摄氏度温育的无血清检测培养基。

将解冻的纳米荧光素酶底物用无血清检测培养基按1:100稀释，并转移至试剂储液槽中。使用多通道移液器，将10微升底物混合液加入384孔培养板的每孔中。轻轻旋转培养板一分钟。

将384孔板放入多功能酶标仪中，记录所有含细胞孔在460纳米和618纳米处的发射光信号。使用给定公式计算空白对照组和配体处理组的原始毫BRET单位（milli-BRET units）BRET比值。通过从配体处理组的BRET比值中减去空白对照组的BRET比值，计算校正后的BRET比值。

纳米C-RAF S259A突变体使BRET信号降低约45%，纳米C-RAF S621A突变体使BRET信号降低约25%。双突变体几乎完全消除了BRET信号。