Name: 使用荧光 cAMP 原位差检测器在活细胞中实时 cAMP 动力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: 学习使用荧光cAMP原位差检测器在HEK-293和HASM活细胞中实时监测cAMP动态变化。该方法具有高特异性，可减少其他细胞成分的干扰，为研究哮喘和COPD等疾病中的细胞信号传导提供可靠结果。

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本研究由国家心肺血液研究所（NHLBI）（HL169522）资助。

本研究中使用的所有试剂和设备的详细信息均列在材料表中。
1. 酶标仪高通量检测法
<ol>
	<li>在96孔板中接种携带cADDis BacMam载体的HEK-293细胞（第1天）
	<ol>
		<li>在生物安全柜中分种并感染细胞。
		<ol>
			<li>温热的HEK培养基（表10.25% 胰蛋白酶-EDTA，置于 37 °C 水浴中。</li>
			<li>用浸有乙醇的纸巾擦拭生物安全柜和材料以进行消毒。</li>
			<li>用移液管吸除并弃去培养瓶中的 HEK 培养基。</li>
			<li>加入 5 mL Mg2+ 和 Ca2+ 用移液管加入预热至37 °C的无钙镁杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS），倾斜培养瓶使其充分覆盖瓶底。随后用移液管吸除并弃去DPBS。</li>
			<li>用血清移液管加入3 mL预热的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞。倾斜培养瓶，确保试剂完全覆盖瓶底。盖上瓶盖，静置3–5分钟，使细胞从培养瓶底部脱落&#160;烧瓶 
			注意：本实验的优化条件适用于75 cm2 烧瓶；若使用不同规格的培养装置，可能需要调整试剂的体积。</li>
			<li>吸取5 mL含抗生素的新鲜培养基。将培养基排出后重新吸入，重复冲洗培养瓶内壁，以物理方式使细胞脱落。</li>
			<li>收集烧瓶中的全部体积（8 mL），转移至15 mL离心管中，在25 °C下以200 x g离心 g 5 分钟。</li>
			<li>离心后，用血清移液管小心吸除上清液，注意不要扰动沉淀。</li>
			<li>为在不扰动细胞沉淀的情况下洗涤细胞，加入 500 µL 不含 Mg 的 DPBS2+ 和 Ca2+ 将DPBS加入15 mL离心管侧壁。轻轻加入DPBS后，尽可能多地移除并弃去上清液，注意不要扰动沉淀。重复一次&#160;更多时间。</li>
			<li>计数细胞，并调整细胞密度至250,000个细胞/mL。</li>
			<li>根据每孔所需的试剂体积，配制用于黑色透明底96孔板的预混液。这称为 &#34;组织培养板&#34; 参见以下卷册： 
			注意：以1个孔为例（总体积200 µL）：40 µL生物传感器BacMam载体（储存浓度为2 x 10⁸）10 病毒基因/mL），2 µL 曲古抑菌素A（储存液浓度100 µM；终浓度1 µM），158 µL 细胞密度为250,000 个细胞/mL的细胞悬液。10个孔的示例（总体积2 mL）：400 µL 生物传感器BacMam载体（储存液浓度2 × 10⁸ 病毒基因/mL）10 病毒基因/mL），20 µL 曲古抑菌素A（储存浓度100 µM），1,580 µL 培养基（细胞密度为250,000 个细胞/mL）</li>
			<li>每孔加入 200 µL 混合液。将细胞置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育。2 在平板读数分光光度计检测前，于培养箱中孵育24小时。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在酶标仪上运行
	<ol>
		<li>在实验台面上，小心吸去每个孔中的全部培养基，然后加入 180 µL 含镁的 DPBS2+ 和 Ca2+ 在37 °C下。</li>
		<li>在显微镜下观察细胞以确认细胞状态良好。</li>
		<li>用铝箔包裹培养板，在37 °C孵育30分钟至1小时。</li>
		<li>孵育期间，将药物按1:10稀释（也称为10倍稀释），配制为所需终浓度。即配制100 µM forskolin和100 nM isoproterenol。</li>
		<li>以柱状方式向透明的96孔板中每孔加入60 µL的每种药物（以下简称该板为 &#34;药物平板&#34;). 
		注意：为获得适当的药物稀释度并优化读数，需将药物加入透明的96孔板中，该板被称为 &#34;药物平板&#34;，应在读取时转移到 &#34;组织培养板&#34; 使用96道多通道移液器，使药物能够同时加入所有孔中，并通过荧光分光光度计快速读取结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>荧光酶标仪设置
	<ol>
		<li>调整荧光酶标仪的设置。
		<ol>
			<li>阅读模式： 荧光读取类型： 动力学波长读数： 494 nm 和 522 nm.</li>
			<li>阅读时间：输入 3 分钟 用于基线荧光读数 7 分钟 用于药物添加后的处理。&#34;间隔&#34; 被输入为 00:00:30 每次读取之间间隔 30 s。 
			注意：读取时间可根据所需时间进行优化和延长。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据采集
	<ol>
		<li>从培养箱中取出组织培养板，移除铝箔和板盖，将组织培养板放入酶标仪中。关闭酶标仪抽屉，使组织培养板静置并平衡至仪器温度（37 °C）。</li>
		<li>将装有药物稀释液的透明96孔板（药物板）置于96道移液器下方，练习从各孔中吸取20 µL液体。确保移液器吸头中吸入的药物体积均匀一致。</li>
		<li>启动一个 &#34;基线&#34; 测量运行。 
		注意：40 RFU 及以上被视为有效数据。若数据低于此值，应终止并弃用该实验。</li>
		<li>组织板将在基线运行结束时从读板机中弹出。迅速而小心地从透明药物板中吸取20 µL液体，加入黑色组织板中。随后立即开始 &#34;治疗&#34; 运行。添加药物后，组织板在读板仪外停留的时间不应超过30秒。 
		注意：若加药速度过快，细胞会从培养板上脱落，导致实验无法使用。此外，细胞已感染光敏感绿色荧光蛋白，因此必须迅速且及时地加入药物并立即开始第二次读数，以避免遗漏反应的早期阶段。</li>
		<li>第二次读数完成后，确保组织板已从读板机中弹出，且数据收集已结束。 
		注意：在处理组织板之前，最好先确认细胞仍然附着在板上。在显微镜下观察细胞。如果细胞脱落，则结果无效，应予以弃用，实验需重新进行。</li>
		<li>将生成的数据导出为 Excel 文件。</li>
		<li>打开来自酶标仪的导出的可读 Excel 数据，将相关信息复制并粘贴到 Excel 转换模板中。数据将从酶标仪的原始格式转换为单孔格式，复制数据右侧将显示各列的读数结果。 
		注意：随时间变化的荧光值列以相对荧光单位（RFU，列为转换标题）表示，并以相对于初始读数时RFU读数的小数变化形式表示（t0 命名为ΔF）。在Excel模板中，ΔF表格设定为加药前的最后一次基线读数。这是第6次th 数据采集点</li>
		<li>数据转换后，将Delta F的数据复制并粘贴到数据分析软件中，作为随时间变化的荧光衰减或相对衰减进行分析。</li>
		<li>将 X 轴标题更改为 &#34;时间（s）&#34; 以及Y轴标题设为“ΔF/F”0&#34; 用于相对小数数值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用倒置荧光显微镜进行单细胞检测
<ol>
	<li>在35 mm培养皿中用cADDis BacMam载体转导HASM细胞（第1天）
	<ol>
		<li>在生物安全柜中分装并感染细胞。
		<ol>
			<li>预热 HASM 培养基（表1)，置于37 °C水浴中消化0.25%胰蛋白酶-EDTA。</li>
			<li>用浸有乙醇的纸巾对生物安全柜及材料进行消毒，并擦拭生物安全柜表面。</li>
			<li>用血清移液管移除并弃去烧瓶中的 HASM 培养基。</li>
			<li>加入 5 mL Mg2+ 和 Ca2+ 用新的移液管加入预热至37 °C的无钙镁磷酸盐缓冲液（DPBS），倾斜培养瓶使缓冲液冲洗瓶底。</li>
			<li>用血清移液管加入3 mL预热的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞。倾斜培养瓶，确保试剂完全覆盖瓶底。静置3–5分钟，使细胞从培养瓶表面脱落。</li>
			<li>吸取5 mL含抗生素的新鲜培养基，用移液器反复吹打以使细胞从培养瓶底部脱落。</li>
			<li>将烧瓶中的全部体积（8 mL）转移至离心管中，在200 × g条件下离心5分钟。</li>
			<li>离心后，用血清移液管小心吸除上清液，注意不要扰动沉淀。</li>
			<li>在不扰动沉淀的情况下，加入500 µL不含Mg的DPBS2+ 和 Ca2+ 将DPBS加入离心管侧壁。尽可能吸除并弃去液体，再重复一次。 
			注意：本实验针对75 cm2 烧瓶；若使用不同规格的培养装置，可能需要对试剂的体积进行调整。</li>
			<li>计数细胞并调整至40,000个细胞/mL的细胞密度。</li>
			<li>根据35 mm培养皿每孔所需的试剂体积配制主混合液。参见下方体积： 
			注意：1个孔的示例（总体积500 µL）：20 µL生物传感器BacMam载体（储存浓度为2 x 1010 病毒基因/mL），5 µL 曲古抑菌素A（储存液浓度100 µM，终浓度1 µM），500 µL 细胞密度为40,000 个细胞/mL的培养基。4孔示例（总体积2 mL）：80 µL 生物传感器BacMam载体（储存液浓度为病毒基因/mL），20 µL 曲古抑菌素A（储存液浓度100 µM，终浓度1 µM），2000 µL 细胞密度为40,000 个细胞/mL的培养基。</li>
			<li>每孔加入 500 µL 混合液。将细胞置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育。2 在继续实验前孵育24小时。 
			注意：细胞数量可能因细胞系不同而有所差异。为避免分析时细胞重叠，请使用较低的细胞数量。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备药理学试剂（第2天）
	<ol>
		<li>小心吸出每孔中的培养基，替换为 450 µL 含 Mg 的 DPBS2+ 和 Ca2+ 37 °C</li>
		<li>用铝箔包裹培养皿，并将35 mm的培养板在37 °C下孵育30分钟至1小时。</li>
		<li>在显微镜下观察细胞以确认细胞状态良好。</li>
		<li>同时，准备比目标终浓度高1个对数单位（即高10倍）的药物溶液。因此，配制100 µM的forskolin和100 nM的isoproterenol。</li>
		<li>对于对数剂量滴定，将药物配制为 10 mM，并通过系列稀释获得 100 µM 的佛司可林和 100 nM 的异丙肾上腺素。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据采集 
	注意：以下设置适用于荧光倒置显微镜。不同显微镜配套的软件可能有所差异；此处描述的是本实验方案中使用的一般设置。
	<ol>
		<li>打开中央控制台，然后打开倒置荧光显微镜。</li>
		<li>打开将用于采集的软件并选择 延时拍摄 选项</li>
		<li>将一个35 mm培养皿样品台放置在显微镜载物台上。</li>
		<li>将物镜设置为 x20.</li>
		<li>使用 自动对焦 尽可能获得清晰的图像。如果难以找到单个细胞，可先从4x物镜开始，再切换至20x物镜。若显微镜不具备自动对焦功能，需手动调节焦距。 
		注意：若需要更显著的细胞形态学细节，可使用40倍放大。</li>
		<li>调整以下设置以获得最佳的数据采集效果： 自动亮度 （曝光） 激发波长, 黑平衡 （以降低背景噪声） 自动聚焦.</li>
		<li>在找到多个细胞质发出荧光的视野区域后，以每30秒一次的频率进行延时成像，持续采集数据20分钟。</li>
		<li>点击 开始 开始读取。</li>
		<li>运行3分钟以采集基线数据。采集3分钟捕获数据后，立即向相应孔中轻柔加入50 µL药物。药物加入后，培养皿中的终浓度为10 µM forskolin和10 nM isoproterenol。 
		注意：必须小心添加药物；移液器吸头不得接触培养板，以免移动已设定的视野，导致样本无法被分析。</li>
		<li>继续实验，再运行17分钟，每30秒采集一次数据。</li>
		<li>测试完成后，确保数据已准备好进行分析。 
		注意：尽管当前方案未包含对焦漂移的对照，但在实验中加入此类对照可能具有益处。例如，使用细胞核染料有助于在显微镜分析过程中管理对焦漂移，尤其是在长时间捕获活细胞图像时。cADDis生物传感器通常在细胞内广泛分布，因此采用较宽的焦平面进行成像效果最佳，从而减少对控制对焦漂移的需求。9.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析数据 
	注意：每台显微镜配套的软件可能不同，因此此处描述的是分析所采集图像时应使用的一般设置。
	<ol>
		<li>打开实验过程中采集的图像文件。</li>
		<li>使用 多边形 或 圆形 用于选择每个细胞的感兴趣区域以进行分析。分析应提供每个细胞在每个时间点的亮度值。 
		注意：最佳操作是选择单个细胞，避免选择接触培养皿壁或其他细胞的细胞，以确保获得最佳的数据采集效果。每种条件下至少选择5个细胞进行分析，并至少重复实验三次。</li>
		<li>分析数据后，将数据导入 Excel 表格，从添加药剂或溶剂前的那张图片开始，计算每种条件下每张照片的平均亮度。在此示例中，为第 3 分钟或第 6 分钟th 显微镜下拍摄的照片，因为每张图像每隔30秒拍摄一次。</li>
		<li>计算 ΔF/F0 每种条件下的每个平均值。</li>
		<li>载入统计分析软件并绘制 ΔF/F 图像0 随时间（秒）的变化 
		注意： 图1 提供了各实验方案主要步骤的示意图概览。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

cAMP Analysis with cADDis: Single-Cell to High-Throughput Screening

<ol><li>Krishna, G., Weiss, B., Brodie, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+sensitive+method+for+the+assay+of+adenyl+cyclase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">A simple, sensitive method for the assay of adenyl cyclase.</a> J Pharmacol Exp Ther. 163 (2), 379-385 (1968).</li>
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<li>Li, I. T., Pham, E., Truong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+biosensors+based+on+the+principle+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+for+monitoring+cellular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Lett%22%5BJournal%5D)">Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics.</a> Biotechnol Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).</li>
<li>Deal, J., Pleshinger, D. J., Johnson, S. C., Leavesley, S. J., Rich, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milestones+in+the+development+and+implementation+of+fret-based+sensors+of+intracellular+signals%3A+A+biological+perspective+of+the+history+of+fret%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Milestones in the development and implementation of fret-based sensors of intracellular signals: A biological perspective of the history of fret.</a> Cell Signal. 75, 109769(2020).</li>
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<li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPS+into+membrane+microdomains+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPS into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li>
<li>Agarwal, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+cAMP+signaling+associated+with+lipid+raft+and+non-raft+membrane+domains+in+adult+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes.</a> Front Pharmacol. 9, 332(2018).</li>
<li>Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+dag+and+cAMP+sensors+optimized+for+live-cell+assays+in+automated+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">New dag and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories.</a> J Biomol Screen. 21 (3), 298-305 (2016).</li>
<li>Tewson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+for+detecting+Galphai-mediated+decreases+in+cAMP+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discov%22%5BJournal%5D)">Assay for detecting Galphai-mediated decreases in cAMP in living cells.</a> SLAS Discov. 23 (9), 898-906 (2018).</li>
<li>Nunez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+rapidly+activate+cAMP+production+via+g%28alphas%29+to+initiate+non-genomic+signaling+that+contributes+to+one-third+of+their+canonical+genomic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids rapidly activate cAMP production via g(alphas) to initiate non-genomic signaling that contributes to one-third of their canonical genomic effects.</a> FASEB J. 34 (2), 2882-2895 (2020).</li>
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<li>Zhang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic+dopamine+neurons+motivate+mating+through+persistent+cAMP+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic dopamine neurons motivate mating through persistent cAMP signalling.</a> Nature. 597 (7875), 245-249 (2021).</li>
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<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Area+postrema+cell+types+that+mediate+nausea-associated+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Area postrema cell types that mediate nausea-associated behaviors.</a> Neuron. 109 (3), 461-472 (2021).</li>
</ol>

作者无竞争性财务利益。

准确且灵敏地测量cAMP对于理解其在多种细胞过程中的作用以及研究cAMP依赖性信号通路的活性至关重要。目前常用的cAMP检测方法包括ELISA、放射免疫分析法、FRET生物传感器和GloSensor cAMP检测法14,15,16,17,18。每种cAMP检测方法都有其优势与局限性。本方案可实现对活细胞内cAMP动态变化的实时检测与监测，时间范围从数分钟至数小时，并且无需添加磷酸二酯酶抑制剂即可完成测量。这一点对于致力于研究磷酸二酯酶亚型在调控cAMP信号中作用的研究人员尤为关键19。该生物传感器已有商业化产品（见材料表），提供多种版本：一种绿色荧光蛋白在结合cAMP后荧光强度降低，一种红色荧光蛋白在结合cAMP后荧光增强，以及一种绿色荧光蛋白在结合cAMP后荧光也增强。其中，荧光下降型生物传感器最为实用，因为其主要限制因素是传感器的表达水平，而该版本在实验开始前的基础状态下即呈现最大荧光强度，因此无需通过施加最大浓度cAMP刺激来评估传感器的表达水平。此外，该生物传感器还有靶向定位于膜微区、初级纤毛或细胞核的不同版本。这些不同版本使得在同一细胞内同时检测胞质溶胶与膜/纤毛区室中的cAMP成为可能。这些新型工具在可视化和定量分析不同细胞组分中cAMP动态方面具有独特优势，是当前快速发展的重点研究领域之一20。
该生物传感器提供了一种简便的方法，可有效监测cAMP的实时动态变化，使研究人员能够以极高的时间分辨率观察cAMP水平的快速波动。该生物传感器的一个关键优势在于其高灵敏度，能够检测cAMP浓度的微小和显著变化8。例如，在未添加磷酸二酯酶抑制剂的HEK-293细胞中，低浓度异丙肾上腺素刺激下即可观察到cAMP振荡现象（图2B）。这种振荡行为目前尚未被充分理解，且似乎为这些细胞所特有，但该生物传感器的高灵敏度和快速动力学特性使其能够被检测到。然而需要注意的是，该生物传感器容易达到饱和，因此在量化中等与强cAMP信号之间的差异时可能存在局限性。当同时存在受体刺激并使用磷酸二酯酶抑制剂导致cAMP整体水平升高时，这一限制尤为显著。尽管本研究中展示了HASMC细胞的感染，但必须指出，使用BacMam载体感染原代细胞仍存在挑战。为实现生物传感器的充分表达，需针对不同类型的细胞优化实验条件。尽管如此，该生物传感器具备的高灵敏度和可扩展性，使其非常适合用于高通量检测。
与基于FRET的传感器相比，使用该生物传感器的另一项改进在于最大限度地减少了光漂白。许多荧光生物传感器在长时间或反复激发后容易发生光漂白。本文所述方案采用短时间激发，每次激发间隔30秒。此外，该生物传感器亮度极高，从而进一步限制了此类分析中潜在的光漂白效应。若出现光漂白，会在初始基线读数中表现为基线漂移。如果发生基线漂移，可在拟合曲线前从数据中扣除漂移的基线，或增加采样间隔以降低激发频率。
与其他cAMP生物传感器类似，该生物传感器对cAMP具有高度特异性结合能力。因此，该检测方法产生的信号与cAMP水平直接相关，显著减少了其他细胞成分可能带来的干扰，从而提供可靠的结果。此外，该生物传感器的多功能性值得强调。尽管GloSensor检测法在该领域被广泛使用，但仍存在某些局限性。例如，依赖瞬时转染可能在特定细胞类型中导致效率低下，且在同一细胞内分析多个参数或过程仍具挑战性。此外，该检测依赖于荧光素酶，而某些化合物可能影响酶活性，进而影响结果的准确性21。相比之下，该生物传感器可用于多种细胞类型和实验系统，包括贴壁细胞和悬浮细胞。其对多种细胞环境的兼容性使研究人员能够在不同的生物系统中研究cAMP动态变化22,23,24。将该生物传感器检测与荧光显微镜技术结合，可进一步增强其应用价值，因为同时还能获取细胞形态学信息25,26,27。
该实验方法为研究人员在实验设计上提供了极大的灵活性，能够支持与cAMP信号通路相关的多种研究。它具有多重用途，可用于测定基础cAMP水平，研究cAMP在不同刺激或处理条件下的动态变化，以及探索cAMP在各种生理或病理状态下的动态行为。该方法的一个关键优势在于其与其他技术的良好兼容性，有助于更全面地理解cAMP信号传导。通过将生物传感器与免疫荧光染色或基因操作等方法相结合10，研究人员能够深入揭示cAMP在特定细胞区室或信号通路中的精确时空调控机制。通过这种整合，研究人员可在多种背景下探究cAMP的多样化功能，从而获得关于cAMP介导的细胞过程复杂性的宝贵见解。采用这些技术可使研究人员在单细胞和细胞群体水平上对cAMP水平进行可视化和定量分析，全面了解其在细胞内的分布情况，包括识别cAMP的局部储存池。因此，这些方法的联合应用能够获取精确的数据，显著推动我们对cAMP信号通路的认识。
尽管传统方法在cAMP分析中具有重要价值，但cADDis的引入代表了该领域的一项有前景的进展。由于其特异性、高灵敏度以及实时检测能力，该生物传感器成为研究人员工具箱中的重要补充，尤其得益于其与活细胞的兼容性。凭借实时监测cAMP水平的能力和高灵敏度，该生物传感器在多种实验条件下均具有显著优势。这一进展有助于更深入地理解cAMP信号通路的动态特性及其在生理与病理过程中的功能意义。

腺苷3′,5′-单磷酸（cAMP）在细胞间通讯及多种生理过程的协调中发挥核心作用。cAMP作为第二信使，将来自激素、神经递质或其他细胞外分子的外部信号传递至细胞内，从而启动一系列胞内事件1此外，cAMP 参与多种信号通路，包括与G蛋白偶联受体（GPCRs）和腺苷酸环化酶相关的通路。理解cAMP在细胞信号传导中的作用，对于揭示正常细胞功能的复杂机制以及开发多种疾病潜在疗法至关重要。2.
过去，人们采用多种方法直接或间接地测定 cAMP，包括对细胞内 ATP 池进行放射性标记后通过层析纯化、高效液相色谱法（HPLC）、放射免疫分析法以及酶联免疫分析法1,2。这些传统检测方法的局限性在于它们属于终点检测，需使用大量样本才能构建出依赖时间的响应曲线。近年来，人们开发了荧光共振能量转移（FRET）传感器，可在活细胞中进行检测，获得实时动态数据，并可将传感器靶向定位于不同的亚细胞区域3。FRET 技术利用两种荧光基团，即一个荧光供体和一个荧光受体；当两者距离较近时，受体荧光基团可被供体发出的荧光能量所激发。最常用的两种荧光基团是青色荧光蛋白（CFP）和黄色荧光蛋白（YFP），因为它们具有相匹配的激发和发射特性。除了 CFP 和 YFP，绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（RFP）也常用于 FRET 生物传感器。cAMP 的 FRET 生物传感器通过在 Epac2 cAMP 结合蛋白的两端分别连接供体和受体荧光基团来实现功能。当 cAMP 与 Epac2 结合后，会引起其构象改变，从而增加供体与受体荧光基团之间的距离3,4。这种构象变化表现为 FRET 信号的减弱，即供体荧光基团向受体荧光基团传递能量所引起的受体激发显著降低3。尽管该过程看似简单，但用于 cAMP 研究的 FRET 生物传感器仍存在诸多局限性和问题5。其中之一是荧光蛋白的选择，例如 GFP 本身可自然形成二聚体，从而降低检测灵敏度6。基于 FRET 的 cAMP 生物传感器已被靶向特定微结构域7，但由于包含两个荧光基团的构建体体积较大，可能限制其应用6。另一个重要问题是 FRET 信号的信噪比较低，这是由于荧光基团的激发光与发射光之间存在光谱重叠，导致需要高频率采样，并使结果分析变得复杂4,5。
最近，一种新型生物传感器（cAMP差异检测器） 原位cADDis 在研究 cAMP 信号转导调控时，解决了上述及其他局限性8一个重要的改进在于仅依赖单一荧光染料。这能够实现快速而高效的信号检测，具有更宽的动态范围和更高的信噪比。因此，由于需要筛选的波长范围更窄，检测的准确性得以提高。8与FRET探针类似，该生物传感器已被靶向定位至细胞内特定区域，从而可用于研究区室化理论，并探索脂筏与非脂筏区域及其他亚细胞结构域9最重要的一点或许是单一荧光团生物传感器适用于高通量筛选，相较于基于FRET的生物传感器，其灵敏度和可重复性更高。该生物传感器被包装于BacMam载体中，可实现多种细胞类型的高效转导，并对蛋白表达进行精确调控。
表达调控 通过 BacMam 载体在使用来自不同物种的 GPCR 正交基因进行检测时尤为有用，有助于解释动物研究中的数据。此外，对受体表达水平的控制对于测量药物效应强度的差异（例如逆向激动剂和部分激动剂）至关重要，而较低的受体表达水平有助于模拟动物组织中天然存在的低表达状态。BacMam 是一种经过改造的杆状病毒载体，能够转导哺乳动物细胞，例如原代细胞培养物和 HEK-293 细胞系10. 显性可筛选标记使得BacMam系统相较于传统质粒转染具有更高的稳定性11此类特异性启动子可实现更高效的基因递送与表达。此外，添加曲古抑菌素A（一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂）可提高报告蛋白的表达水平。11表达水平可以被调控 通过 BacMam 病毒的滴度需根据每种细胞类型进行优化。对于该生物传感器，红色或绿色荧光蛋白分别连接在 Epac 的 N 末端和 C 末端。当 cAMP 结合时，生物传感器发生构象变化，使邻近荧光蛋白的氨基酸发生位移。这一变化导致在 400 nm 处的吸收从阴离子态转变为中性态，从而降低荧光强度。
单个细胞中表达有90至120种G蛋白偶联受体（GPCRs），可响应多种神经体液信号12因此，可以假设每个细胞中至少有数十种GPCR分别通过与Gs或Gi偶联来刺激或抑制cAMP。尽管目前已在实时监测这一第二信使方面取得进展（例如FRET技术），但仍需要更高效的方法。本文介绍了利用cADDis实时监测cAMP信号合成与降解的技术方法。可通过荧光酶标仪进行高通量检测，或通过荧光显微镜进行单细胞检测，以实时监测荧光变化。这些方法适用于广泛涉及GPCR信号转导的生物学问题研究 通过 cAMP

<table><tbody><tr><td>96孔板（透明）</td><td>Fisherbrand</td><td>21-377-203</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 培养皿</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627870</td><td>带玻璃底的细胞培养皿</td></tr><tr><td>96孔板&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3904</td><td>黑色，带透明平底</td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素（100倍浓度）</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td>用于HEK和HASM培养基</td></tr><tr><td>BZ-X荧光显微镜</td><td>Keyence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钙（IM）</td><td>Quality Biological Inc</td><td>E506</td><td>用于HASM培养基</td></tr><tr><td>离心管（15 mL）</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>DMEM（1倍浓度）</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>HEK培养基</td></tr><tr><td>含Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;和Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;&amp;nbsp;的DPBS</td><td>Gibco</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>不含Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;和Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;的DPBS</td><td>Corning</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>R&amp;D systems</td><td>S11195</td><td>用于HEK和HASM培养基</td></tr><tr><td>福斯科林（Forskolin）</td><td>Millipore</td><td>344270</td><td>药物</td></tr><tr><td>Green Down cADDis cAMP检测试剂盒</td><td>Montana Molecular</td><td>#D0200G</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Ham's F-12K&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21127022</td><td>用于HASM培养基</td></tr><tr><td>HEPES（1 M）</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>用于HASM培养基</td></tr><tr><td>异丙肾上腺素（Isoproterenol）</td><td>Sigma</td><td>I6504</td><td>药物</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（200 mM，100倍浓度）</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>用于HASM培养基</td></tr><tr><td>微量离心管（2 mL）</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invitrogen</td><td>ant-pm-1</td><td>用于HASM培养基的抗生素</td></tr><tr><td>RNA酶清除剂（RNAse away）</td><td>Thermo Scientific</td><td>700511</td><td>试剂</td></tr><tr><td>氢氧化钠溶液</td><td>Sigma</td><td>S2770</td><td>用于HASM培养基</td></tr><tr><td>SpectraMax M5酶标仪</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>曲古抑菌素A（Trichostatin A）</td><td>TCI America</td><td>T2477</td><td>试剂</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>试剂</td></tr></tbody></table>

利用荧光camp差异检测器原位监测活细胞中camp的实时动态变化

Real-Time cAMP Dynamics in Live Cells Using the Fluorescent cAMP Difference Detector In Situ

cAMP差异检测器 原位 (cADDis) 是一种新型生物传感器，可实现对活细胞内 cAMP 水平的连续检测。该生物传感器由一个经环状重排的荧光蛋白与 Epac2 的铰链区连接而成，形成单一荧光团生物传感器，其在结合 cAMP 后荧光信号增强或减弱。该传感器有红色和绿色荧光增强型，以及绿色荧光减弱型，并包含多种靶向亚细胞定位的红色和绿色版本。为展示该生物传感器的有效性，本研究采用了在结合 cAMP 后荧光减弱的绿色荧光减弱型。文中演示了两种使用该传感器的实验方案：一种利用 96 孔板读板式分光光度计&#160;可与高通量筛选兼容，另一种则利用荧光显微镜进行单细胞成像。在酶标仪上，培养于96孔板中的HEK-293细胞经10 µM forskolin或10 nM isoproterenol刺激后，绿色向下型生物传感器的荧光信号迅速且显著下降。该生物传感器还可用于在荧光显微镜下监测单个人气道平滑肌（HASM）细胞内的cAMP水平。当使用forskolin或isoproterenol刺激时，绿色向下型生物传感器在细胞群体中表现出类似反应。该单细胞检测方法可在20倍和40倍放大倍数下观察生物传感器的定位。因此，该cAMP生物传感器具有高灵敏度和灵活性，可对永生化细胞和原代细胞、单个细胞或细胞群体进行cAMP的实时检测。这些特性使cADDis成为研究活细胞中cAMP信号动态的有力工具。

本研究通过酶标仪和显微镜检测验证了胞质生物传感器的功能。细胞表达生物传感器后，分别用10 µM佛司可林（腺苷酸环化酶的直接激活剂）、10 nM异丙肾上腺素（ß1AR和ß2AR的激动剂）或溶剂对照处理（图1）。每30秒采集一次荧光变化，以反映cAMP的生成情况。
数据被转换为初始荧光值的荧光变化量（ΔF/F）0). 采用单一位点衰减模型对荧光数据进行拟合，以量化不同条件下cAMP水平的时间变化图2 和 图3）。这些衰减曲线的参数可用于量化药物在特定浓度下的反应。采用衰减速率（k）与平台值的乘积作为量化药物反应的单一指标，并在施加同一药物的多个浓度时，利用该指标绘制浓度-反应曲线。13.
在酶标仪上，用10 µM佛司可林刺激后，细胞质传感器在数秒内即显示出荧光强度的显著下降，并在数分钟内持续进展（从200 s时的基础值0 ΔF/Fo降至600 s时的-0.7 ΔF/Fo）（图2A）。根据该绿色传感器的设计原理，荧光强度的降低表明cAMP生成增加，提示佛司可林引起了细胞质内cAMP水平的持续上升。用次最大浓度的异丙肾上腺素（10 nM）刺激HEK-293细胞，则导致生物传感器荧光强度快速但幅度较小的下降（600 s时为-0.3 ΔF/Fo，图2A）。当在单个孔中随时间观察较低浓度的异丙肾上腺素（10 nM和100 nM）作用时，在HEK-293细胞中观察到cAMP水平的振荡现象（图2B）。这些振荡的周期始终约为200 s。常规数据分析包括将反应拟合为单一位点衰减模型，从而对这些振荡进行平均（见连接线）。将多个实验结果平均后，通常会导致这些振荡在数据中变得不明显。尽管如此，该生物传感器表现出足够的灵敏度和快速的动力学特性，能够实现对cAMP振荡的观测。
也可使用荧光显微镜检测cADDis。该方法可实现对单个细胞内cAMP的监测，并可进一步优化以观察靶向不同亚细胞区域的生物传感器。在本研究中，该生物传感器被应用于原代人支气管平滑肌（HASM）细胞。用溶剂、10 µM 福司柯林或10 nM 异丙肾上腺素刺激HASM细胞后，可观察到荧光强度随时间逐渐降低（从基线0 ΔF/Fo 下降至410 s时的-0.9 ΔF/Fo）（图3）（视频1、视频2 和 视频3）。荧光信号均匀分布于细胞质中，并排除细胞核区域（参见时间推移视频）。因此，福司柯林和异丙肾上腺素均在HASM细胞中引起快速且显著的荧光下降。这些结果表明该生物传感器可用于原代细胞培养体系。
<img alt="细胞转染过程；示意图；酶标仪和荧光显微镜装置；数据可视化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66451/66451fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：生物传感器实验流程的示意图。 首先，将培养的细胞进行传代并用新鲜培养基重悬，随后用携带 cADDis 传感器的 BacMam 病毒感染细胞。转染后的细胞使用药理学试剂进行刺激，激活可改变 cAMP 水平的细胞通路。通过酶标仪（A）或荧光显微镜（B）检测细胞内 cAMP 浓度变化所引起的荧光强度变化，从而实现对 cAMP 动态变化的实时定量分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66451/66451fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="比较异丙肾上腺素和佛司可林处理后随时间变化的ΔF/F₀荧光响应图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66451/66451fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：在酶标仪上对活体HEK-293细胞中的cAMP进行实时监测。 对表达生物传感器的96孔板中的HEK-293细胞随时间测量其荧光信号。在建立基础荧光值后，持续监测荧光衰减达7分钟。（A）加入10 µM佛司可林或10 nM异丙肾上腺素后的荧光衰减曲线，数据为10–15次实验的均值±标准误。（B）通过单次实验数据展示加入10 nM或100 nM异丙肾上腺素后出现的荧光衰减振荡现象。两幅图中的数据均拟合为单一位点衰减模型（连接线）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66451/66451fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="钙成像结果，ΔF/F₀ 与时间关系图，包含对照、佛司可林和异丙肾上腺素处理组。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66451/66451fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：在荧光显微镜下对活体人支气管平滑肌细胞（HASM）中的cAMP进行实时监测。 对表达生物传感器的接种于35 mm培养皿中的HASM细胞随时间推移进行荧光检测。在建立基线值后，每30秒测量一次荧光衰减，持续20分钟。在120秒时（箭头所示）加入指定试剂。图中显示了生物传感器对溶剂对照、10 µM佛司可林或10 nM异丙肾上腺素处理后的荧光衰减曲线。展示的数据来自单次实验，并用连线连接。随附经溶剂（对照）、佛司可林或异丙肾上腺素处理细胞的时间推移视频，以直观展示生物传感器的荧光响应情况。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66451/66451fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
视频 1：溶剂处理后实时监测活体人支气管平滑肌细胞（HASM）中cAMP动态变化的时间推移视频。 生物传感器在溶剂（对照）处理下的荧光衰减曲线。每帧图像间隔30秒采集一次，持续20分钟。比例尺：40 μM。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66451/video%20jove%20control%20.zip" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频 2：10 µM 福斯科林刺激下活体人支气管平滑肌细胞中 cAMP 实时监测的时间推移视频。 生物传感器在 10 µM 福斯科林刺激下的荧光衰减曲线。每 30 秒采集一帧，持续 20 分钟。比例尺：40 μM。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66451/video%20FSK%20jove.zip" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频 3：10 nM 异丙肾上腺素刺激下活体人支气管平滑肌细胞（HASM）中 cAMP 实时动态监测的时间延时视频。 生物传感器在 10 nM 异丙肾上腺素刺激下的荧光衰减曲线。每 30 秒采集一帧，持续 20 分钟。比例尺：40 μM。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66451/video%20iso%20jove.zip" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">培养基配方</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">HASM 培养基</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>名称</td>
			<td>体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham's F-12K</td>
			<td>419.65 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>12.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>氢氧化钠溶液</td>
			<td>6 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-谷氨酰胺 200 mM (100X)</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>氯化钙 (1 M)</td>
			<td>0.850 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗生素-抗真菌剂 (100X)</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin </td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">HEK 培养基</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>名称</td>
			<td>体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x)</td>
			<td>444 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗生素-抗真菌剂 (100X)</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin </td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：HASM培养基与HEK培养基的培养基配方。

本研究中介绍的实验方案展示了cAMP差异检测器In Situ通过两种方法检测cAMP的有效性。其中一种方法使用96孔板读数分光光度计结合HEK-293细胞进行检测；另一种方法则在荧光显微镜下观察单个HASM细胞。

利用荧光cAMP差异检测器原位监测活细胞中cAMP的实时动态变化

cAMP原位差异检测器（cADDis）是一种新型生物传感器，可实现对活细胞内cAMP水平的连续测量。该生物传感器是……

我们的研究致力于解析细胞内周期蛋白激酶微区室的组织方式，重点阐明这些区室的形成与维持机制。我们旨在揭示使细胞能够在这些微区室内识别空间信号的关键组分，探索细胞对信号解读的差异性，并研究这些特性在哮喘和慢性阻塞性肺疾病（COPD）等疾病状态下的改变。使用贝克曼载体对原代细胞进行感染具有较大挑战性。为此，应针对不同类型的细胞优化实验条件，以实现cAMP生物传感器的充分表达。本方案可实现对活细胞内环磷酸腺苷（cAMP）动态变化的实时检测与监测，监测时间范围从数分钟至数小时。该生物传感器对cAMP具有高度特异性，因此本检测所产生的信号与细胞内cAMP水平直接相关，显著减少了其他细胞组分的潜在干扰，从而提供可靠的结果。首先，获取人气道平滑肌（HASM）细胞培养物。使用移液管吸出并弃去培养瓶中的HASM细胞培养基。为洗涤细胞，加入5毫升预热至37摄氏度的无镁无钙杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS），轻轻倾斜培养瓶。消化细胞时，加入3毫升0.25%胰蛋白酶EDTA，将细胞置于3至5分钟。加入含抗生素的新鲜培养基5毫升后，将细胞转移至15毫升离心管中，在200 ×g条件下离心5分钟。弃去上清液，沿管壁轻轻加入500微升不含镁和钙的DPBS。吸除液体后，在显微镜下计数细胞，并将细胞密度调整至每毫升40,000个细胞。制备含有载体、试剂及所需数量细胞的主混合液。将500微升主混合液分装至每个35毫米培养皿的孔中，并进行孵育。第二天，小心吸出每个孔中的培养基，加入450 µL含有镁和钙的DPBS，该溶液需预先预热至37°C。用铝箔纸包裹培养板，在37°C下孵育30分钟至1小时。在显微镜下观察细胞状态，并进行系列稀释，以制备用于药理学处理的100 µmol/L佛司可林和100 nmol/L异丙肾上腺素。首先，培养经载体转染的人气道平滑肌（HASM）细胞。进行成像时，打开中央控制台和倒置荧光显微镜。启动指定软件，选择延时成像功能以进行记录。将培养皿安装在显微镜载物台上。使用自动对焦和自动亮度功能，获取单个细胞的图像。调节黑平衡和激发波长。然后点击自动对焦。找到一个含有多个细胞质荧光细胞的视野区域后，将时间间隔设置为每30秒拍摄一次，总时长为20分钟。然后点击确定，开始数据采集。三分钟后，向相应的孔中轻柔加入 50 µL 药物，继续运行实验 17 分钟。打开实验过程中采集的图像文件。使用多边形或圆形工具，选择每个细胞的兴趣区域，并进行分析。然后在 Excel 表格中打开分析后的数据，从添加药理学试剂前的一张图像开始，计算每张照片中每种条件下的平均亮度。在计算每种条件下每个平均值相对于初始荧光的荧光变化后，将数值导入统计分析软件，并以时间（秒）为横坐标，绘制 ΔF/F₀ 变化曲线。与对照组相比，在用 10 µM 福斯科林和 10 nM 异丙肾上腺素刺激 HASM 细胞后，随时间推移可观察到荧光强度明显下降。

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双色荧光交叉相关光谱法研究活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用及蛋白质动力学

学习使用荧光cAMP原位差检测器在HEK-293和HASM活细胞中实时监测cAMP动态变化。该方法具有高特异性，可减少其他细胞成分的干扰，为研究哮喘和COPD等疾病中的细胞信号传导提供可靠结果。

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