Name: 青少年C57BL/6雄性和雌性小鼠的社交失败应激模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-15T14:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: 了解青少年C57BL/6小鼠社交失败应激模型，用于研究社会逆境对神经发育和行为的影响。该模型通过暴露于攻击性CD-1小鼠，成功诱导社交回避行为，并区分易感与韧性个体。

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本研究由加拿大卫生研究院（CF资助号：MOP-74709；PJT 190045）、国家药物滥用研究所（CF资助号：R01DA037911）以及加拿大自然科学与工程研究理事会（CF资助号：2982226）资助。Andrea Pantoja-Urban 获得墨西哥人文、科学与技术国家委员会（CONAHCYT）以及魁北克自然科学与技术基金会（FRQNT）外国学生优秀奖学金计划（PBEEE）的支持。Samuel Richer 获得麦吉尔大学神经科学整合项目奖学金的支持。图示插图使用 BioRender.com 提供的模板制作。

实验操作遵循加拿大动物护理委员会的指南，并经麦吉尔大学和道格拉斯医院动物护理委员会批准（动物实验批准编号：2005-5084）。所有小鼠均饲养在温湿度可控（21-22 °C；60%）的菌落室环境中，于Douglas精神健康大学研究所的神经表型分析中心，接受12小时光照-黑暗循环（光照开启时间为8:00）饲养。小鼠已 随意 实验期间可自由获取食物和水。小鼠被随机分配至各实验组。实验动物购自商业供应商（见 材料清单). 表2 总结了每个实验阶段动物的特征。共使用了489只青春期C57BL/6J小鼠（259只雄性；230只雌性），来自20个实验队列。
表2：各实验阶段的动物受试对象。†如果这些动物未受到严重损伤，可重复用于启动实验。‡如果这些动物未受到严重损伤，可在加速社会挫败应激（AcSD）期间重复用于启动实验。§道格拉斯心理健康大学研究所神经表型分析中心。¶用于雄性动物的实验。#用于雌性动物的实验，若挫败刺激为混合性别，则使用雌性动物进行启动。††不可用于AcSD实验。缩写：AcSD = 加速社会挫败应激；PND = 出生后天数 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66455/Table%202_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载本表格。</a>
1. 驯化
注意：此阶段至少应持续 1 周。
<ol>
	<li>购买雄性CD-1退役种鼠（参见 材料清单）年龄超过4个月，且数量为青少年C57BL/6J小鼠的两倍（例如，若需10只小鼠接受应激处理，则需购买20只CD-1小鼠）。 
	注意：建议获取此数量的 CD-1 小鼠，因为仅有小部分 CD-1 小鼠会对青春期小鼠表现出攻击性行为。</li>
	<li>让CD-1雄性小鼠在其饲养笼中适应新环境，期间提供食物和饮水 随意 在筛选和启动前1周</li>
	<li>使用 PND 的 C57BL/6 &gt;65（成年）和出生后第25 ± 3天（青少年）表2用于筛选和启动阶段。每个启动日每种年龄获取4只C57BL/6小鼠（即，若进行3天启动，则共获取12只PND &gt;65 和 12 只 PND 25 ± 3 的动物，以降低受伤风险，因为这些动物将被反复用于筛选和启动过程。</li>
</ol>
2. CD-1 筛选与启动
注意：此阶段持续时间为3天的筛选期（雌性小鼠为1天）和3至4天的诱导期（对于雌性小鼠，以及根据CD-1小鼠的攻击性行为情况，时间可能延长）。
<ol>
	<li>使用攻击的操作性定义来记录CD-1小鼠的攻击行为，具体方法如下所述。
	<ol>
		<li>一次攻击定义为 CD-1 小鼠咬击 C57BL/6J 小鼠，且 C57BL/6J 小鼠对咬击作出反应并移动离开。咬击定义为 CD-1 小鼠将其牙齿接触 C57BL/6J 小鼠身体任何部位。移动离开定义为 C57BL/6J 小鼠的两只后肢从 CD-1 小鼠接触它之前所处的位置移开。</li>
		<li>确保各次攻击之间至少有约 2 秒的间隔。如果发生多次咬合 &lt;间隔2秒，计为一次发作。</li>
		<li>如果CD-1小鼠连续多次咬合而中间无停顿（&lt;间隔约2秒），用塑料尺轻轻分开动物。若CD-1小鼠咬住不放，应轻轻将其分开。若C57BL/6J小鼠被困在角落或被CD-1小鼠压住而无法在被咬时移开，也应用尺子轻轻分开动物。以上情况均计为一次攻击（直至分开为止）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>筛选
	<ol>
		<li>所有动物操作均应使用腈类检查手套，并避免使用香水或芳香剂。</li>
		<li>执行第1步st 仅在筛选当天使用成年C57BL/6雄性小鼠作为入侵者（PND &gt;65）在CD-1小鼠的饲养笼中进行。每次新实验前均需对CD-1小鼠进行筛查。</li>
		<li>引入一只成年雄性 C57BL/6 小鼠 PND &gt;在 CD-1 雄性小鼠的饲养笼内进行 3 分钟的 65 次攻击行为观察。记录首次攻击行为的潜伏期以及攻击行为发生的次数（参见 补充表1).</li>
		<li>从第2个nd 直至筛选期最后一天，引入一只成年雄性 C57BL/6 PND&gt;65，持续1分钟（若CD-1攻击性很强，则限制在30秒内），然后更换为青春期C57BL/6（PND 25 ± 3）共5分钟。 
		注意：使用青春期小鼠进行筛选非常重要，因为并非所有攻击成年C57BL/6雄性小鼠的个体都会攻击青春期的C57BL/6小鼠。事实上，攻击青春期小鼠的CD-1小鼠并不一定会攻击成年C57BL/6雄性小鼠。</li>
		<li>如果实验目的是研究对雌性小鼠的攻击性行为，则即使实验小鼠包含两种性别，也应使用青春期雌性小鼠进行筛选和诱导。</li>
		<li>记录所有 C57BL/6 小鼠首次攻击的潜伏期、攻击次数以及受到的伤口数量（参见 补充表2).</li>
		<li>记录任何类型的互动行为：追逐、骑跨、嗅闻、理毛或啃咬。若 CD-1 小鼠未接近青春期 C57BL/6 小鼠，需予以记录；若该行为连续持续 2 天，则不应将该 CD-1 小鼠用于后续的诱导实验。</li>
		<li>在启动阶段，选择所有表现出追逐、骑跨、嗅闻、跟随、理毛或啃咬青春期C57BL/6小鼠行为的CD-1小鼠。</li>
		<li>保留未被选中的CD-1小鼠，并用于社交互动测试（SIT）。 
		注意：领地行为会随着时间增加；因此，在下一次实验中，未被选中的 CD-1 小鼠可能对青春期小鼠表现出攻击性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>启动 CD-1 攻击性行为
	<ol>
		<li>将用于初次免疫的CD-1小鼠饲养在各自的原居笼中，直至初次免疫的最后一天。</li>
		<li>引入一只成年雄性 C57BL/6J 小鼠 PND &gt;65，持续30秒，然后与一只青春期的C57BL/6 PND 25 ± 3小鼠交换，共5分钟。</li>
		<li>记录首次攻击的潜伏期、攻击次数以及任何互动行为（参见 补充表 3).</li>
		<li>每天在预定的失败时间（上午9:00和下午2:00）进行2次启动，持续3-4天。 
		注意：并非所有 CD-1 小鼠在最初几天都会攻击青春期小鼠，尤其是当预刺激对象为雌性小鼠时。预刺激的天数可根据 CD-1 小鼠表现出的攻击性行为适当增加或减少。</li>
		<li>为减少引雄天数，可重复使用之前参与过社会挫败实验的雄性CD-1小鼠。若CD-1小鼠未表现出攻击性增强，应延长引雄天数直至达到标准。</li>
		<li>若 CD-1 小鼠表现出极度攻击性行为（C57BL/6 小鼠出现过度伤口），应减少预刺激天数，以防止社会挫败期间发生严重损伤。</li>
		<li>在实验的下一阶段，选择那些连续两天至少攻击青少年小鼠10次（雄性）或5次（雌性）的CD-1小鼠。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. AcSD 实验方案
注意：该阶段包括 3 天的适应期和 4 天的急性睡眠剥夺（AcSD）暴露期。
<ol>
	<li>适应期
	<ol>
		<li>为社会挫败实验设置大鼠笼具（图1A-F）。使用适当的丙烯酸玻璃隔板将大鼠笼具分为两个隔间（图1B、D；参见材料表）。</li>
		<li>在笼具两侧均加入硬木屑垫料，每侧放置一块棉垫作为垫料材料（图1D）。确保用文件夹夹子固定笼具的金属网顶盖（图1E）。确保大鼠笼具覆盖上盖，但不加保护性棉垫（图1F）。</li>
		<li>在每个笼具的一侧放入一只CD-1小鼠。在笼具外侧贴上标签，以便于识别每只小鼠。</li>
		<li>在开始AcSD实验方案前2至3天，将选定的CD-1小鼠饲养于社会挫败装置中（图1F），以增强CD-1小鼠的领地行为。</li>
		<li>在实验开始前1天进行一次诱导攻击（priming session）；此步骤对维持攻击行为的一致性至关重要。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>挫败实验阶段
	<ol>
		<li>每天进行2次实验（第一次：上午9点，第二次：下午2点），持续4天，共8次。制定时间表，确保每次使用的攻击者小鼠不同（参见补充表4和补充表5）。</li>
		<li>在将C57BL/6青春期小鼠引入笼具的CD-1侧之前，称量其体重。先将一只成年雄性C57BL/6小鼠（体重>65 g）放入挫败笼的CD-1侧，持续30秒，随后替换为一只青春期C57BL/6小鼠（出生后第24-28天，PND 24-28），进行持续10分钟的挫败实验，或最多10次攻击，以先达到者为准。</li>
		<li>每次攻击后使用塑料尺将动物分隔开。每次挫败实验结束后，检查受伤情况，并使用止痛药膏进行处理。记录受伤数量。</li>
		<li>将青春期C57BL/6J小鼠放置在空置隔间，紧邻一个不熟悉的攻击者，直至下一次实验。每次实验均更换不同的攻击者。</li>
		<li>每次实验开始时，使用此前未配对过的实验小鼠和攻击者小鼠。监测用于诱导攻击的成年C57BL/6J雄性小鼠的受伤情况（参见补充表6）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>遵循以下建议以保障动物福利并设定人道终点。
	<ol>
		<li>遵循相应机构审查委员会关于社会挫败实验的标准操作程序，并确保持续的兽医评估。</li>
		<li>在整个研究过程中监测小鼠健康状况，避免动物遭受痛苦或死亡。</li>
		<li>确认带孔隔板已正确安装，以防止小鼠穿越至另一隔间。</li>
		<li>当动物出现伤口时，及时通知兽医护理人员进行适当监测，并每日涂抹止痛药膏，直至伤口完全愈合。</li>
		<li>若伤口恶化（伤口面积增大），下一次实验中将攻击次数限制为5次，以允许恢复。检查是否存在严重损伤。严重损伤定义为伤口总面积>1 cm。</li>
		<li>若动物体重较初始体重减少15%-20%，或出现活动能力下降、理毛行为受损、伤口>1 cm、阴茎断裂或前肢咬伤伴肿胀等情况，应立即移除并实施安乐死。 
		注：主要安乐死方法为使用异氟烷/CO2气体舱，随后进行颈椎脱位作为二次安乐死。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对照组小鼠
	<ol>
		<li>每天进行2次实验（第一次：上午9点，第二次：下午2点），持续4天，共8次。制定时间表，确保每次实验中对照组小鼠与不同的C57BL/6J同种个体共处一笼（参见补充表7和补充表8）。 
		注：对照组小鼠不接触攻击者。为模拟每次挫败实验中接触新的CD-1小鼠的情境，每次实验中对照组小鼠均与一只新的同性别、同年龄的同种个体（非同窝）配对。</li>
		<li>将对照组小鼠饲养于社会挫败装置（图1）中，但需与AcSD实验组小鼠分处不同房间。</li>
		<li>每笼放置两只对照组小鼠，分别位于笼具两侧。每次实验时将小鼠放置在笼具的不同侧或不同笼具中，以避免其识别气味。每次实验后轮换对照组小鼠的位置。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="用于小鼠行为实验的动物饲养装置，包含多个隔间及实验设备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66455/66455fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：用于青少年期小鼠的加速社交挫败应激（AcSD）装置。（A）从左至右：配对的钢丝网盖，钢丝间距为 0.6 cm；带孔透明聚碳酸酯隔板，孔径为 0.6 cm；用于固定钢丝网盖的文件夹夹子；带盖透明大鼠笼（无棉质保护层）。（B）上图：成年小鼠慢性社交挫败实验用聚碳酸酯隔板（左）与青少年小鼠 AcSD 实验用隔板（右）的比较；下图：青少年小鼠用聚碳酸酯隔板的特写。（C）上图：成年小鼠慢性社交挫败实验用钢丝网盖（左）与青少年小鼠 AcSD 实验用钢丝网盖（右）的比较；下图：钢丝网盖的特写。（D-F）社交挫败装置的组装过程。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66455/66455fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
4. 社会交互实验
<ol>
	<li>按照先前所述的急性社交挫败（AcSD）方案执行社交互动测试（SIT）57,58,59。
	<ol>
		<li>在最后一次AcSD实验结束后的24小时进行SIT。在上午9点至下午4点之间，在红光条件下（而非黄光条件下）进行SIT。</li>
		<li>设置主方形实验区域及上方的视频摄像机（参见 材料表）。主实验区域分为三个区域：社交互动区（SIZ）、角落区和中心区；这些区域应使用黑色线条在实验区域内标出（使用黑色永久性记号笔）。各区域的尺寸和标准如下：
		<ol>
			<li>确保SIZ为围绕围栏的14 cm × 9 cm的方形区域。角落区为围栏对面墙角的小型方形区域（9 cm × 9 cm），代表距离SIZ最远的位置。中心区为SIZ与角落区之间的区域。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用过氧化氢酶清洁液清洁实验区域及围栏。</li>
		<li>在地面上为每只动物放置识别标签以便分析。记录所有动物的行为以供离线分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第一阶段：测定基础探索行为
	<ol>
		<li>将一个空的金属丝网围栏紧靠实验区域的一侧墙壁放置。将实验用的青少年期C57BL/6小鼠（受挫或对照组）放置在实验区域中央。允许其自由探索2.5分钟，随后取出小鼠。</li>
		<li>使用过氧化氢酶清洁液清洁实验区域及围栏。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第二阶段：社交互动测试
	<ol>
		<li>将一只陌生的CD-1小鼠放入金属丝网围栏内。将围栏放置在与前一阶段相同的位置。</li>
		<li>将同一只青少年期C57BL/6小鼠重新放入实验区域。允许其自由探索2.5分钟，随后取出小鼠。</li>
		<li>使用过氧化氢酶清洁液清洁实验区域及围栏。</li>
		<li>以平衡顺序对所有青少年期C57BL/6小鼠（应激组和对照组）重复上述过程。</li>
		<li>在SIT中使用多只CD-1小鼠，以减少操作应激和偏差（例如，对于30只C57BL/6小鼠的队列，使用4只CD-1小鼠）。在青少年小鼠之间进行平衡分配。 
		注：该测试用于测量实验小鼠对社交目标的接近和/或回避行为，最早由Krishnan5和Golden7描述。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析
	<ol>
		<li>记录测试两个阶段中小鼠在互动区和角落区停留的时间（秒）。</li>
		<li>计算社交互动比值：社交互动区停留时间（CD-1攻击者存在时）除以社交互动区停留时间（CD-1攻击者不存在时）。</li>
		<li>将比值 &lt; 1.00 的应激小鼠归类为易感型，比值 ≥ 1.00 的归类为抗应激型。</li>
		<li>在第一阶段未探索实验区域的小鼠（即在任一指定区域内停留时间为0秒）从所有分析中排除，以控制运动活性差异的影响。</li>
		<li>在≥4次社交挫败实验中未遭受任何攻击的小鼠从所有分析中排除，以避免非典型抗应激动物的干扰。</li>
		<li>排除在互动区内停留时间少于61秒的小鼠（非易感型），以确保较高的社交互动比值真实反映对社交目标的兴趣。</li>
		<li>排除社交互动比值为异常值的小鼠。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Adolescent Social Stress Paradigm in C57BL&#47;6 Mice for Behavioral Research

作者无任何利益冲突需要披露。

CD-1 小鼠中稳定且具有攻击性的行为 
在筛选阶段，必须详细记录 CD-1 小鼠表现出的所有行为（如追逐、骑跨行为、嗅探、理毛或啃咬），并在选择用于 AcSD 实验的 CD-1 小鼠时严格参考这些记录。有可能，某些 CD-1 小鼠在与青春期小鼠互动时并未表现出攻击行为，但在致敏过程中仍会发展出对青春期小鼠的攻击性。相反，若一只 CD-1 小鼠会攻击成年小鼠，但不接近&#160;青春期小鼠&#160;，则其很可能不会发展出对&#160;青春期小鼠&#160;的攻击性。
CD-1 小鼠的致敏阶段可使其对青春期小鼠产生攻击性行为。因此，准确记录其行为对于小鼠的筛选至关重要。此外，每次开展新实验前，必须始终对 CD-1 小鼠进行筛查，即使该 CD-1 小鼠此前已经历过挫败。部分 CD-1 小鼠在长期未受干扰地饲养于其原有笼具中后可能停止攻击青春期小鼠，而另一些小鼠则可能因单独饲养而表现出增强的领地行为。
对于CD-1小鼠的致敏，建议方案为3天。若使用未经训练的CD-1小鼠，当其未主动攻击青春期小鼠时，可适当延长致敏时间。而对于已有与青春期小鼠发生社会挫败经历的CD-1小鼠，此致敏阶段的持续时间可相应缩短。
筛选和预处理阶段对于成功进行AcSD实验至关重要。例如，经过适当预处理的CD-1小鼠比攻击性较弱的CD-1小鼠更快发起攻击并达到10次攻击的上限，从而实现较短的挫败周期。
在攻击性社会 defeat（AcSD）过程中，当攻击行为非常剧烈时（即 CD-1 小鼠不松口咬住 C57BL/6J 小鼠），必须将动物分开放置；否则，青春期小鼠可能会受伤，因此需要限制攻击行为。及时处理伤口也非常重要，以避免感染；建议不要使用油性软膏治疗伤口，因为动物会舔掉软膏，导致局部毛发脱落并使伤口暴露。
用于青少年期 C57BL/6 雄性和雌性小鼠的急性社交挫败应激（AcSD）模型的故障排除 
慢性社交挫败应激模型在用于雄性和雌性 C57BL/6 小鼠的早期青春期时存在重要局限性。本节描述了为建立青春期 AcSD 模型所进行的修改。
仪器设备：完整的仪器设备列表见材料表。早青春期（出生后21–30天）的C57BL/6小鼠体型过小，无法使用实验室先前描述的设备60。丙烯酸玻璃隔板上的穿孔直径过大，足以让C57BL/6小鼠穿过隔板，进入攻击者所在区域。为防止这种情况，特制了穿孔直径较小的丙烯酸玻璃隔板。此外，钢丝网盖需使用夹子固定，以防止小鼠逃出笼具。所使用的盖子通常用于通风笼具。在此实验中，盖子未加装保护棉，以确保良好通风并防止小鼠逃逸。需要注意的是，垫料中木屑的用量应适中，以确保青春期小鼠能够接触到位于盖子上的食物和饮水装置。然而，过多的木屑容易受潮。
CD-1小鼠的选择：在慢性模型中，实验开始前需对CD-1小鼠进行攻击行为的筛选。经过3天的筛选后选择CD-1小鼠，并对其攻击行为进行评估。筛选后，选择攻击潜伏期低于30秒且攻击行为稳定的个体进入下一阶段。然而，在慢性社会挫败实验过程中，CD-1小鼠在10天内未能持续维持稳定的攻击次数（图2B）。因此，由于部分CD-1小鼠对入侵小鼠缺乏攻击性，不得不将其从实验中剔除。事实上，尽管仅有少数CD-1小鼠会对入侵小鼠发起攻击，但其中一些个体表现出极强的攻击性，有时甚至严重伤害雄性C57BL/6 PND 21天小鼠。因此，调整了CD-1小鼠的筛选标准，改为选择对青春期小鼠具有攻击性的个体，以增强其身体攻击行为。
身体攻击行为的一致性：持续的身体攻击可导致快速而彻底地击败入侵者6。为了在不同实验及实验操作者之间标准化操作流程，采用了攻击行为的操作性定义57，从而实现对攻击性程度的精确量化测量。
诱导攻击性行为：在慢性社会挫败实验过程中，攻击次数存在较大差异，且在实验的最后几天逐渐减少（图2B）。为了增强CD-1小鼠对青春期C57BL/6雄性小鼠的攻击性行为，对CD-1小鼠进行了诱导，使其表现出持续的攻击性，无论引入其笼内的小鼠是哪一只。该行为通过在引入青春期小鼠前，先放入一只成年C57BL/6雄性小鼠持续1分钟来实现，从而促使CD-1小鼠在成年小鼠被移出后攻击青春期小鼠。
模型持续时间：出生后第21天（PND 21）的青春期C57BL/6小鼠体型非常小，CD-1小鼠仅一次攻击就可能对其造成严重伤害。因此，为了针对青春期早期并实现多次社交挫败干预，本研究选用了一种替代经典10天慢性社交挫败应激的模型。加速社交挫败应激（AcSD）42 每天进行两次身体攻击，分别在上午和下午各一次，共持续4天（总计8次）。该AcSD模型使青春期小鼠的年龄从PND 21提高至PND 25，仍仅针对青春期早期阶段。
青春期急性社交挫败模型的局限性 
急性社交挫败（AcSD）模型存在一些局限性。与成年小鼠的慢性社交挫败模型相比，AcSD需要筛选两倍数量的CD-1小鼠来匹配青春期C57BL/6小鼠的数量。由于引诱阶段的持续时间可能因CD-1小鼠的攻击性行为而有所不同，因此应提前规划AcSD实验的时间安排，并充分考虑所有这些变量。由于大多数青春期小鼠在经历AcSD后会表现出对社交回避的抵抗性，为了获得足够数量的易感小鼠，实验队列应至少包括20只雄性小鼠和30只雌性小鼠。
在青春期小鼠中，AcSD 实验在不同实验组间产生一致的结果 
在经历社会应激（包括慢性社会挫败和 AcSD 两种方案）后，大多数青春期雄性小鼠表现出对社会回避的抵抗性。然而，在慢性社会挫败模型中，CD-1 小鼠攻击次数的个体差异无法排除，可能成为混杂因素。相比之下，在 AcSD 实验中，每次挫败阶段前均对 CD-1 小鼠进行预处理，以确保各次实验中的攻击次数保持一致（图 2D、E）。总体而言，所有接受 AcSD 处理的小鼠实验组在各次实验中均表现出相似的攻击次数（图 2D）；而接受慢性社会挫败模型处理的小鼠组则未呈现此一致性（图 2B）。
与在其他物种和品系中使用该模型的研究相比，将慢性社交挫败应激用于成年C57BL/6雌性小鼠一直具有挑战性9,13,45,61。在青春期C57BL/6雌性小鼠的AcSD实验中，我们延长了启动阶段，以确保CD-1小鼠表现出攻击性行为（图4A）。然而，在不同雌性实验队列中，攻击次数可能存在变异（图4B）。尽管如此，在这些实验中，所有CD-1小鼠均对雌性表现出攻击性行为。为增加攻击次数，可将与雄性小鼠的启动时间延长至1分钟。与雄性类似，对社交回避具有抵抗性的青春期C57BL/6雌性小鼠比例高于易感个体（图4C,D）。此外，抵抗性小鼠与易感小鼠之间的攻击次数无显著差异（图4E），表明该表型独立于攻击次数。AcSD模型可用于青春期C57BL/6雌性小鼠，并且可利用相同的CD-1小鼠同时在两种性别中开展实验。

慢性社会挫败应激范式被广泛用于模拟出生后第（PND）&#62;65天成年雄性啮齿类动物的社会应激。该范式基于当一只入侵者进入其领地时，成年雄性啮齿类动物表现出的自然攻击行为。此模型已应用于多种啮齿类动物，包括大鼠、仓鼠和小鼠1,2,3,4,5,6,7,8,9，通常包含约10天的物理攻击与心理应激相结合的过程，在此期间，入侵的啮齿类动物每天会经历几分钟来自领地拥有者的身体攻击。两只动物被共同置于领地拥有者的笼子中，中间用隔板分隔，允许感官接触但防止身体接触7。在小鼠实验中，最常用的领地拥有者/攻击者小鼠是退役繁殖用的Swiss CD-1小鼠，这类小鼠对入侵小鼠表现出强烈的领地攻击行为6,7。对于入侵小鼠，研究最充分的品系为近交系C57BL/6小鼠2,4,5。挫败小鼠每天暴露于新的攻击者，以避免对特定攻击者产生习惯化。对照组小鼠则每天与不同的同种动物共同饲养。在最后一次挫败刺激后24小时，实验小鼠接受社会交互测试（SIT），在该测试中，它们可在开放场中自由探索，测试区域在无目标（无目标动物）或有目标（新CD-1小鼠作为目标）条件下进行。对照组小鼠在目标存在时，在交互区域停留的时间显著长于非目标区域。根据社会交互比值（与攻击者共处时在交互区域停留的时间 / 无攻击者时在交互区域停留的时间），将挫败小鼠分为易感型（比值&#60;1）或抗逆型（比值&#62;1）。该方法为研究个体对压力反应的差异提供了有效的工具。
近年来，慢性社会挫败应激模型主要应用于成年雄性小鼠，因为雄性小鼠存在显著的等级支配关系，表现为雄性之间的打斗，而非与雌性之间的对抗6,7。此外，雄性啮齿类动物通常不会攻击雌性，而是表现出交配行为10。尽管存在这些障碍，研究人员已开发出多种策略，以将慢性社会挫败应激范式应用于成年雌性小鼠。例如，加州小鼠的社会挫败模型基于该单配型物种两性在保卫领地时表现出的自然攻击性9,11。其他方法则侧重于通过刺激CD-1小鼠的腹内侧下丘脑，使其表现出持续的攻击行为10,12，或在实验用成年雌性小鼠身上施加雄性尿液，以使其受到CD-1攻击者小鼠的攻击13。CD-1小鼠这种增强且稳定的攻击性对于实验中的受试小鼠在与攻击者长时间互动过程中反复遭受攻击后表现出明确的屈服行为至关重要6。
将慢性社交挫败模型改良用于青少年期 C57BL/6 小鼠 
青春期是一个心理社会功能显著成熟的阶段，伴随着大脑微观与宏观结构的改变而同步发展，尤其是在前额叶皮层。在人类和啮齿类动物中，关于青春期具体起止时间尚无统一共识14,15。此外，青春期存在若干关键的易损窗口期，在此期间，外界经验可能干扰正在进行的大脑发育和认知发展过程16,17,18,19。青春期与青春期在时间上重叠，但这两个术语并不等同。青春期指性成熟的开始，而青春期则代表一个更广泛的阶段，其特征是从幼年状态逐步过渡到获得独立性20。不同研究团队提出，小鼠的青春期从断奶期（出生后第21天，PND 21）持续至成年期（出生后第60天，PND 60）21。其中，早期青春期可定义为断奶后的第一和第二周（PND 21–34），中期青春期则为 PND 35–48 阶段。这些时间段涵盖了多个明确的发育阶段，例如多巴胺系统的发育22,23,24、发育中神经网络对药物效应的易感性17,25,26,27，以及独特的行为特征16,20,28,29,30。
中国台湾地区研究人员需注意，实验方案中要求受试小鼠表现出攻击行为，这是社会挫败实验方案的关键条件。然而，与雌性小鼠类似，雄性小鼠通常不会对青春期早期的小鼠表现出攻击性互动，这可能是因为它们不将其视为威胁。目前大多数关于慢性社会挫败对青春期C57BL/6小鼠影响的研究均在青春期中期阶段开展。31,32,33,34,35；其他研究未明确说明青春期暴露时的出生后天数36,37，或延长至成年早期以观察其影响38 或不允许感官接触39；其他关于青春期小鼠的研究使用了不同的品系40,41. 采用慢性社会挫败应激法在雄性青春期小鼠中开展的这些研究的特征总结于 表1.
我们的研究团队致力于研究C57BL/6小鼠在特定青春期暴露窗口（包括青春期早期）的影响。由于不同青春期阶段持续时间较短，我们设计了一种改良版的慢性社交挫败应激范式的加速版本42。该模型被称为青少年小鼠加速社交挫败应激（AcSD）。先前的研究表明，大鼠在青春期对社交应激的敏感性存在显著的性别差异8,26,43,44,45，人类中社交应激对心理健康轨迹的有害影响也存在性别差异46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56。AcSD模型对青春期雌性小鼠同样有效，使其能够研究潜在的性别特异性后果，并探索其神经生物学基础。
表1：使用社会挫败应激范式研究青春期雄性小鼠的研究。 品系与物种：加州小鼠：Peromyscus californicus。C57BL/6：Mus musculus 黑六近交系小鼠品系。C57BL/6J：由杰克逊实验室提供的M. musculus 黑六近交系小鼠模型。CD-1：来自瑞士远交白化小鼠品系的M. musculus。ICR：癌症研究所远交白化小鼠品系的M. musculus。OF1：Oncins France 1远交白化小鼠品系的M. musculus。 
缩写：wk = 周；PND = 出生后天数；res = 抗逆型；sus = 易感型；unsus = 非易感型。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66455/Table 1_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 青春期小鼠&amp;nbsp;</td><td>内部繁殖</td><td></td><td>小鼠饲养于道格拉斯心理健康大学研究所神经表型分析中心。</td></tr><tr><td>C57BL/6 成年小鼠&amp;nbsp;</td><td>查尔斯河实验室</td><td>菌株编号：027</td><td>小鼠按计划订购，以确保在出生后第PND天到达&gt;65只小鼠按每笼四只进行群养，饲养于标准小鼠笼中。</td></tr><tr><td>C57BL/6J 青春期小鼠&amp;nbsp;</td><td>杰克逊实验室</td><td>品系编号：000664；RRID:IMSR_JAX:000664</td><td>小鼠按到达出生后第24天（PND 24）的时间订购，并以每笼四只的标准分组饲养于常规小鼠笼中。</td></tr><tr><td>CD-1小鼠&amp;nbsp;</td><td>查尔斯河实验室</td><td>品系编号：022</td><td>超过三个月龄的退役繁殖小鼠，全程单笼饲养。</td></tr><tr><td>清洗液&amp;nbsp;</td><td>Virox 动物健康</td><td>DIN 02537222</td><td>Prevail：加速过氧化氢。消毒清洁剂和除臭剂。</td></tr><tr><td>透明带孔亚克力玻璃隔板&amp;nbsp;</td><td>由道格拉斯医院生产，定制订单</td><td></td><td>0.6 cm（宽） &amp;times; 45.7 cm（d） &amp;times; 22.23 厘米（高）；孔径 0.6 厘米。隔板带有小孔，允许小鼠之间进行感官接触，但无法进行身体接触。</td></tr><tr><td>透明矩形大鼠笼具&amp;nbsp;</td><td>艾伦镇</td><td></td><td>24 厘米（宽） &amp;times; 48.3 cm（d） &amp;times; 22.23（h）</td></tr><tr><td>用于床褥的棉垫</td><td>Inotiv Envigo</td><td>T.6060 iso-BLOX</td><td>2.5 cm × 2.5 cm。添加至社交挫败装置中。</td></tr><tr><td>硬木屑垫料</td><td>Inotiv Envigo</td><td>Teklad 7090，7115</td><td>Sani-chip 垫料</td></tr><tr><td>用于固定钢丝网盖的大型长尾夹</td><td>缝合钉</td><td>货号：132429，型号：24178-CA</td><td>51 mm</td></tr><tr><td>中等尺寸的金属夹子，用于固定钢丝网盖</td><td></td><td>货号：132367，型号：24172-CA</td><td>32 毫米，以防大号夹子导致大鼠笼盖无法闭合</td></tr><tr><td>止痛乳膏</td><td>Polysporin</td><td></td><td>复方止痛乳膏（红色包装，非药膏剂型），2 种抗生素加盐酸利多卡因</td></tr><tr><td>成对钢丝帽盖&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>24 cm（宽） &amp;times; 48 cm（直径），烤架之间间距为 0.6 cm（宽）</td></tr><tr><td>可拆卸金属丝网围栏&amp;nbsp;</td><td>约翰斯顿工业塑料</td><td></td><td>11 厘米（宽） &amp;times; 6.8 cm（d） &amp;times; 42 厘米（高）定制规格；每个社交互动测试区域使用两块预先切割的透明聚碳酸酯固定</td></tr><tr><td>社交互动开放场实验装置</td><td>PEXIGLAS</td><td></td><td>45 cm（宽） &amp;times; 45 cm（直径） &amp;times; 49 厘米（高），由不透明丙烯酸玻璃（Plexiglas）定制而成&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>秒表&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>用于计时挫败实验会话</td></tr><tr><td>带红外灯的摄像机&amp;nbsp;</td><td>斯旺</td><td>SRDVR-44580V&amp;nbsp;</td><td>斯旺相机 - 4通道1080p数字视频录像机 &amp;和 2 x PRO-T853</td></tr><tr><td>视频追踪软件&amp;nbsp;</td><td>Topscan</td><td></td><td>2.0 Clever Systems 公司</td></tr></tbody></table>

用于青春期 c57bl/6 雄性和雌性小鼠的社会挫败应激模型

Social Defeat Stress Model for Adolescent C57BL&#47;6 Male and Female Mice

青春期的社会逆境普遍存在，可能对心理健康的发展轨迹产生负面影响。为了理解社会压力对大脑持续发育和行为结果的影响，有必要在青春期雄性和雌性啮齿类动物中建立社会压力模型。慢性社会挫败应激范式（CSDS）已被广泛用于成年C57BL/6雄性小鼠的社会压力建模，该方法利用成年雄性啮齿动物对侵入其领地的外来个体表现出的攻击行为。该范式的一个优势在于，可以根据小鼠在最后一次挫败应激后24小时的社会行为个体差异，将其分为“心理弹性”和“易感”两组。然而，在青春期C57BL/6小鼠中应用该模型一直存在挑战，原因在于成年或青春期小鼠通常不会攻击早期青春期的雄性或雌性小鼠，且青春期本身是生命中一个短暂的阶段，包含若干明确的时间窗口，具有特定的脆弱性。这一局限性通过采用一种适用于青春期雄性和雌性小鼠的加速版CSDS模型得以克服。该模型为为期4天的应激范式，每天进行两次身体攻击，使用成年C57BL/6雄性小鼠对CD-1小鼠进行攻击性诱导，使其能够迅速攻击青春期的雄性或雌性小鼠。该模型被称为青春期小鼠的加速社会挫败应激（AcSD）。青春期小鼠经历AcSD后24小时，无论雄性还是雌性，均出现社交回避行为，但仅发生在部分受挫小鼠中。尽管在“心理弹性”组与“易感”组之间，攻击次数在各次应激会话中保持一致，这种脆弱性仍然存在。AcSD模型持续时间足够短，可在青春期内的特定时间段内实施应激暴露；同时允许根据是否出现社交回避行为对小鼠进行分类，也是目前首个可用于研究青春期C57BL/6雌性小鼠社会挫败应激的模型。

使用慢性社交挫败应激模型，在青春期 C57BL/6 雄性小鼠（PND 21）中总共进行了四项不同的实验。然而，该模型在早期青春期 C57BL/6 小鼠中的应用存在重要局限性。
适用于青少年期 C57BL/6 小鼠的设备改造 
首要的限制在于，用于社会挫败实验装置的设备原本是为成年小鼠设计的。由于体型较小，出生后第 21 天（PND 21）的青少年期 C57BL/6 小鼠能够穿过隔板上的孔洞进入攻击者小鼠所在的一侧，从而中断了感官接触阶段。此外，青少年期小鼠还能通过钢丝网盖的栅栏间隙逃脱。因此，对设备进行了改造以防止小鼠逃脱（图 1）。隔板上孔洞的直径由 1.1 cm 改为 0.6 cm（图 1B），钢丝网盖也更换为栅栏间距由 1.1 cm 改为 0.6 cm 的型号（图 1C）。此外，网盖使用夹具固定，大鼠笼还加装了无防护棉的塑料盖。木屑垫料的高度也调整为适合青少年期小鼠的适宜水平（图 1D-F）。
AcSD 模型需要对成年雄性 CD-1 小鼠进行预处理，以确保其表现出持续且稳定的攻击行为 
第二个更为重要的局限性在于 CD-1 小鼠对青少年小鼠的躯体攻击行为缺乏一致性。在长期的社会挫败实验过程中，攻击行为的表现差异极大：有的实验周期（10 分钟）内完全无攻击行为，有的则出现一至两次攻击性撕咬，而由于青少年小鼠体型较小，此类撕咬往往导致死亡。然而，若将同一批 CD-1 小鼠用于多次实验，则其攻击次数的一致性有所提高。
图2B展示了每个慢性社会挫败实验队列（P0、A0、A1和A2）每日攻击次数。结果显示，天数与队列之间存在交互作用（图2B，双因素重复测量方差分析：F(27, 234) = 3.83，p &lt; 0.0001），天数的主效应（F(6.288, 163.5) = 6.2，p &lt; 0.0001）以及队列的主效应（F(3, 26) = 3.8，p = 0.02）。事后检验显示，各队列在第1、2、3和7天存在显著差异（Holm-Sidak事后检验：第1天，P0 vs. A2，p = 0.02；A1 vs. A2，p = 0.02；第2天，A1 vs. A2，p = 0.04；第3天，A0 vs. A1，p = 0.007；A1 vs. A2，p = 0.04；第7天，A0 vs. A1，p = 0.04）。在实验P0和A0中，所有CD-1小鼠在最后3天停止了攻击行为。用于实验P0和A0的CD-1小鼠随后被用于实验A1，其中攻击行为保持一致（图2B），表明若CD-1小鼠此前经历过身体接触，其更倾向于表现出攻击性。
因此，如步骤2.1和2.2所述，对CD-1小鼠专门筛选其对青少年小鼠的攻击性，并用成年C57BL/6雄性小鼠诱导其对青少年C57BL/6小鼠产生攻击性。此外，采用AcSD方法将年龄从PND 21延长至PND 25，仍可针对早期青春期阶段。
在 AcSD 实验期间，CD-1 小鼠对青春期小鼠的攻击次数呈现出更为一致的增加模式，如图 2D所示。与慢性社会挫败实验范式不同，实验未发现实验阶段与实验队列之间存在显著交互作用（图 2D，双因素重复测量方差分析：F(35, 483) = 1.33，p = 0.1）；但存在显著的阶段主效应（F(5.644, 389.5) = 14.15，p &lt; 0.0001）和队列主效应（F(5, 69) = 7.91，p &lt; 0.0001）；Holm-Sidak post hoc 检验未显示各队列间存在显著差异。对各队列攻击次数的平均值进行比较后发现，该效应主要由队列 A7 驱动，其攻击次数显著更高（数据未显示，单因素方差分析 F(5, 69) = 7.911，p &lt; 0.0001；Holm-Sidak post hoc 检验：A3 与 A6 比较，p = 0.04；A7 与 A5 比较，p = 0.002；A7 与 A6 比较，p &lt; 0.0001；A7 与 A8 比较，p = 0.0001）。
在急性社会挫败（AcSD）实验中，与采用未经预先刺激的CD-1小鼠进行慢性社会挫败实验相比，青春期小鼠在使用经预先刺激的CD-1小鼠时遭受了更多的攻击行为（图2E，Welch校正的非配对t检验，t = 15.40，df = 17.87，p &lt; 0.0001）。在慢性社会挫败实验过程中，攻击行为并不一致，实际上，部分实验小鼠完全未受到攻击。
<img alt="青少年社交挫败实验结果；图表比较慢性（CSDS）与急性（AcSD）攻击。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66455/66455fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：慢性社交挫败应激与急性社交挫败应激（AcSD）每日攻击次数的比较。 （A）慢性社交挫败应激模型的时间线。（B）在青少年C57BL/6雄性小鼠中，慢性社交挫败应激期间各实验队列（P0、P1、A1和A2）每日的攻击次数（双因素重复测量ANOVA）。（C）加速社交挫败应激（AcSD）模型的时间线。（D）在青少年C57BL/6雄性小鼠中，AcSD期间各实验队列（A3-A8）每日的攻击次数（双因素重复测量ANOVA）。（E）AcSD组的平均攻击次数显著更高（Welch校正的非配对t检验，****p &lt; 0.0001）。所有数据均以均值 ± 标准误表示。缩写：CSDS = 慢性社交挫败应激；SIT = 社交互动测试；PND = 出生后天数；P0, A0-A8 = 各实验队列的标签。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66455/66455fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
AcSD 会话期间的攻击模式不影响 24 小时后的社交表型 
在经历社交挫败应激后，大多数青春期雄性小鼠在社交互动测试（SIT）中并未表现出社交回避行为（图 3B，慢性社交挫败：单因素方差分析 F(2, 43) = 14.57，p &lt; 0.0001；F，AcSD：Kruskal-Wallis 检验，H(2) = 72.35，p &lt; 0.0001）。在两种模型中，表现出社交回避与未表现出社交回避的受挫小鼠之间的攻击次数均无显著差异（图 3D，慢性社交挫败：双因素重复测量方差分析，F(9, 252) = 4.07，p = 0.21；H，AcSD：双因素重复测量方差分析，F(7, 511) = 1.32，p = 0.24）。然而，经历慢性社交挫败后的小鼠中，具有抗挫能力（resilient）的小鼠比例高于经历 AcSD 处理后的小鼠（图 3C、G，70 % vs 55.26 %，二项检验（单尾），p = 0.0047）。
<img alt="青少年社会挫败研究；实验时间线、互动比率图、饼图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66455/66455fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：慢性社会挫败应激与加速社会挫败应激（AcSD）范式后社会互动测试（SIT）得分的比较。 （A）慢性社会挫败应激模型的时间线。（B）青少年期经历慢性社会挫败应激后SIT得分的分布（单因素方差分析）。（C）青少年期经历慢性社会挫败应激后具有适应力/易感个体的比例。（D）慢性社会挫败应激期间不同表型所遭受的攻击次数，适应力组与易感组之间无显著差异（双因素重复测量方差分析）。（E）加速社会挫败应激（AcSD）模型的时间线。（F）青少年期经历AcSD后SIT得分的分布（Kruskal-Wallis检验）。本图已根据文献57修改。（G）青少年期经历AcSD后具有适应力/易感个体的比例。本图已根据文献57修改。（H）AcSD期间不同表型所遭受的攻击次数；适应力组与易感组之间无显著差异（双因素重复测量方差分析）。本图已根据文献59修改。**p &lt; 0.001，****p &lt; 0.0001。所有数据均以均值 ± 标准误表示。缩写：PND = 出生后天数；Con = 对照组；Res = 适应力组；Sus = 易感组。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66455/66455fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
AcSD 可用于青春期 C57BL/6 雌性小鼠 
由于PND 25的C57BL/6雄性和雌性小鼠尚未达到生殖成熟，经预处理的CD-1小鼠可能会像攻击青春期雄性小鼠一样对青春期雌性小鼠发起攻击性行为。然而，为达到稳定的攻击次数，预处理阶段必须延长图 4A）。如图所示 图 4B，各实验中天数与队列之间均未发现交互作用（图4B双因素重复测量方差分析： F(35,707) = 1.38, p = 0.07），存在显著的会话主效应（F(6.286, 634.9) = 16.1, p &lt; 0.0001）以及队列的主效应（F(5, 101) = 11.34, p &lt; 0.0001；Holm-Sidak 事后检验 测试：第2次会话 C4 对 C8， p = 0.03；第6次会话 C7 与 C4 比较， p = 0.02；C7 与 C5 比较， p = 0.02；第7次会话C8与C3对比， p = 0.02；C8 与 C4 比较， p = 0.045）。大多数暴露于 AcSD 的青春期 C57BL/6 雌性小鼠对社交回避具有适应性（图 4C, Brown-Forsythe 方差分析： F(2,113.4) = 27.2, p &lt; 0.0001），与青春期雄性小鼠相似。在具有抗压能力的小鼠与易感小鼠之间，攻击次数未发现显著差异（图4E双因素重复测量方差分析，会话 × 表型交互作用： F(7, 714) = 0.73, p = 0.64，会话的主效应 F(6.375, 650.3) = 7.02, p &lt; 0.0001，表型无主要效应 F(1, 102) = 0.4, p = 0.53).
<img alt="采用时间线、攻击会话图、社交互动分析、饼图的青春期雌性小鼠 AcSD 研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66455/66455fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：青春期雌性小鼠中的 AcSD。 （A）实验时间线。（B）AcSD 期间每日攻击次数（双因素重复测量方差分析）。（C）青春期雌性小鼠在 AcSD 后社交互动测试（SIT）得分分布（Brown-Forsythe 方差分析）。（D）青春期经历 AcSD 后具有复原力/易感性小鼠的比例（右侧）。（E）AcSD 期间不同表型小鼠所受攻击次数；在复原力与易感性小鼠之间未发现显著差异（双因素重复测量方差分析）。所有数据均以均值 ± 标准误表示。（C–E）这些图表已根据文献59修改。缩写：SIT = 社交互动测试；PND = 出生后天数；C3–C8 = 各实验队列标签；Con = 对照组；Res = 复原力型；Sus = 易感性型。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66455/66455fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
补充表 1：成年小鼠第 1 天筛选的评分表模板。 缩写：CD-1 = 参与筛选的 CD-1 小鼠编号，Exp = 实验编号，3 min = C57BL/6 成年小鼠筛选过程的持续时间，BL6 ID = 用于筛选的 C57BL/6 成年小鼠编号，Lat 1 ADULTS = CD-1 小鼠对 C57BL/6 成年小鼠首次攻击的潜伏期，# aggressions = CD-1 小鼠发起的攻击次数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66455/Supplementary%20Table%201_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充表 2：成年及青少年小鼠筛选评分表模板。缩写：Exp = 实验编号，1 min = C57BL/6 成年小鼠筛选实验的持续时间，BL6 ID = 用于筛选的 C57BL/6 成年小鼠编号，Lat 1 ADULTS = CD-1 小鼠对 C57BL/6 成年小鼠首次攻击的潜伏期，# aggressions = CD-1 小鼠发起攻击的次数，5 min = C57BL/6 青少年小鼠筛选实验的持续时间，BL6 Ad = 用于筛选的 C57BL/6 青少年小鼠编号，Lat 1 Adolescents = CD-1 小鼠对 C57BL/6 青少年小鼠首次攻击的潜伏期，CD-1 = 被筛选 CD-1 小鼠的编号。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66455/Supplementary%20Table%202_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充表3：启动阶段的评分表模板。缩写：CD-1 = 用于启动的CD-1小鼠编号，Exp = 实验编号，30 sec = C57BL/6成年小鼠启动阶段的持续时间，BL6 ID = 用于启动的C57BL/6成年小鼠编号，Lat 1 ADULTS = CD-1小鼠对C57BL/6成年小鼠首次攻击的潜伏期，# aggressions = CD-1小鼠发起的攻击次数，Min: 3 = C57BL/6青春期小鼠启动阶段的持续时间，BL6 Ad = 用于启动的C57BL/6青春期小鼠编号，Lat 1 Adolescents = CD-1小鼠对C57BL/6青春期小鼠首次攻击的潜伏期，# mountings = C57BL/6青春期小鼠接受的骑跨次数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66455/Supplementary%20Table%203_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充表4：社会挫败实验排程评分表模板（20只青春期小鼠）。缩写：CD1 = CD-1小鼠编号，E = 实验，H = 湿度，1 st = 第1轮，2nd = 第2轮，BL6 adult = 用于致敏的C57BL/6成年小鼠编号，Weight = C57BL/6青春期小鼠体重，# attacks = CD-1小鼠发起攻击次数，# wounds = C57BL/6青春期小鼠受伤次数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66455/Supplementary%20Table%204_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充表 5： 社会挫败实验排程示例。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66455/Supplementary%20Table%205_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充表6：成年C57BL/6雄性小鼠损伤监测模板。缩写：1st - # wounds = C57BL/6成年小鼠在第1次实验中受到的伤口数量，2nd - # wounds = C57BL/6成年小鼠在第2次实验中受到的伤口数量，BL6 = 用于致敏的C57BL/6成年小鼠的编号。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66455/Supplementary%20Table%206_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充表 7：对照组排班模板（10 只青春期小鼠）。随机化规则：不得重复与同一只同类小鼠配对；同一只小鼠在同一天内不得重复出现在盒子的同一侧；小鼠需与来自不同笼子（相对于其原居笼）的小鼠进行随机配对；原居笼已编号；小鼠编号依据其原居笼编号而定；失败组与对照组小鼠均从原居笼中随机选取。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66455/Supplementary%20Table%207_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充表 8：对照组排程示例。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66455/Supplementary%20Table%208_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

我们开发了一种针对青春期C57BL/6小鼠的加速社交挫败应激模型，该模型适用于雄性和雌性小鼠，并允许在特定的青春期阶段进行暴露。暴露于该模型可诱导社交回避行为，但仅发生在部分经历挫败的雄性和雌性小鼠中。

用于青春期 C57BL/6 雄性和雌性小鼠的社会挫败应激模型

青春期的社会逆境普遍存在，可能对心理健康的发展轨迹产生负面影响。在青春期雄性和雌性动物中建立社会应激模型……

我们研究青春期社会逆境对神经发育及行为结果的影响，特别关注雄性和雌性C57BL/6小鼠。我们采用改良的慢性社会挫败范式来模拟社会心理压力。我们的模型称为加速社会挫败应激，专为在青春期C57BL/6小鼠中应用而设计。社会挫败应激方案需要 resilient 小鼠表现出攻击性行为。现有研究通常在中青春期进行，或在出生后暴露日龄方面缺乏特异性。部分研究延伸至成年早期，或使用非常见的小鼠品系。在青春期C57BL/6小鼠中实施社会挫败模型一直具有挑战性，因为成年或青春期小鼠通常不会攻击早期青春期的雄性或雌性小鼠，且青春期本身是生命中一个短暂的阶段，包含特定时间窗口的易感期。急性社会挫败（AcSD）模型可在暴露后24小时成功诱导雄性和雌性小鼠产生社交回避行为，其持续时间较短，允许在青春期内的特定时间段进行暴露干预。该模型可用于区分具有抗压性和易感性的实验小鼠，是首个可用于研究青春期C57BL/6雌性小鼠社交挫败应激的模型。本模型的建立适用于青春期的雄性和雌性C57BL/6小鼠。该四天应激范式每天进行两次身体攻击实验，通过使用成年C57BL/6雄性小鼠对CD-1小鼠进行攻击性诱导，确保CD-1小鼠能够迅速攻击实验用的雄性或雌性小鼠。首先，将一只青春期的 C57BL/6 小鼠放入已预先处理过的 CD-1 小鼠的笼子中。当 CD-1 小鼠咬住或用牙齿接触青春期小鼠身体的任何部位时，记录为一次攻击行为。当 C57BL/6 小鼠将其两只后肢从最初所处的位置移开时，即判定为逃避行为。如果CD-1小鼠连续多次咬击，应使用塑料尺将动物分开。同样，如果CD-1小鼠咬住不放，或C57BL/6小鼠被CD-1小鼠逼入角落或被压住无法移动时，也应立即分开动物。在筛选和预处理CD-1小鼠前，需戴上一副腈类检查手套。第一天，在CD-1小鼠的笼子中引入一只成年雄性C57BL/6小鼠（出生后第65天或更年长）作为入侵者，持续三分钟。记录首次攻击行为的潜伏期以及攻击行为发生的次数。从第二天至筛选和致敏阶段的最后一天，先引入一只成年雄性C57BL/6小鼠（出生后第65天或更年长）持续一分钟，随后更换为一只出生后第25天的青春期C57BL/6小鼠，持续五分钟。如果诱导的是对雌性C57BL/6小鼠的攻击性行为，则应使用青春期雌性小鼠进行筛选和诱导。记录首次攻击的潜伏期、攻击次数以及所有C57BL/6小鼠所受的伤口情况。如果CD-1小鼠在筛选或诱导期间连续两天未接近青春期C57BL/6小鼠，则不应将该CD-1小鼠纳入实验。首先，使用亚克力玻璃隔板将笼架分隔成两个区域。在笼子两侧均加入硬木屑垫料，然后在每一侧放置一块棉垫。使用文件夹夹子固定金属网盖。然后将不带保护棉的盖子盖在笼子上。将 CD-1 小鼠放在隔板的一侧。在笼子外部贴上标签，以便于识别每只小鼠。对于挫败实验阶段，制定为期四天、每天两次的实验计划，每次实验使用不同的攻击者。称量一只C57BL/6品系的青春期小鼠。随后，将一只C57BL/6品系、出生后第65天或更年长的雄性小鼠引入挫败笼的CD-1侧，持续30秒。将一只青春期的C57BL/6小鼠（出生后24至28天）放入笼中，进行持续10分钟的挫败实验，或直至发生10次攻击为止。记录首次攻击的潜伏期、攻击次数以及所有C57BL/6小鼠受到的伤口情况。每次攻击后，使用塑料直尺将动物分隔开。每次失败后，检查是否有损伤，并使用止痛药膏进行处理。记录损伤数量。将失败的青春期C57BL/6小鼠放入其攻击者旁边的空置隔间，直至下一次实验开始。使用在先前实验中未配对的实验小鼠和攻击小鼠开始新的实验阶段。监测用于致敏的成年C57BL/6雄性小鼠的受伤情况。对于对照小鼠，每笼放置两只对照小鼠，分别置于笼子的两侧。将对照组小鼠饲养在与遭受社交挫败的小鼠不同的房间内的社交挫败装置中。每次实验阶段中，轮换对照组小鼠，使每只实验小鼠被引入一只陌生的C57BL/6小鼠的笼子中。在多个实验批次中，CD-1小鼠对C57BL/6小鼠的攻击行为具有一致性。在加速社交挫败过程中，与经历慢性社交挫败方案的青春期雄性小鼠相比，接受预处理CD-1小鼠攻击的青春期雄性小鼠遭受了更多的攻击。经预处理的CD-1小鼠对青春期C57BL/6雄性和雌性小鼠表现出攻击性攻击行为。在各次实验中，天数与队列之间均未发现交互作用。在比较经历加速社交挫败的具有韧性的小鼠与易感小鼠所受到的攻击次数时，无论实验在雄性还是雌性小鼠中进行，均未发现差异。

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