Name: 半自动 8 臂径向迷宫中小鼠的食欲空间工作记忆任务，减少迷宫中的恐惧记忆联想 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 24 s
Description: 学习使用半自动八臂径向迷宫测试小鼠空间工作记忆的方法。该方案通过多阶段适应训练减少应激反应，确保行为神经科学实验数据的可靠性，适用于认知功能与学习能力研究。

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我们感谢沃尔夫森生物医学研究所的同事们在讨论中提供的帮助，感谢牛津大学的大卫·班纳曼（David Bannerman）在小鼠行为学方面的建议以及对论文初稿的审阅。我们还感谢马修·格里斯特（Matthew Grist）在技术与行政方面的支持。本研究由惠康信托基金 [108726/Z/15/Z 和 214286/Z/18/Z] 以及 Gerald Choa Neuroscience Institute [PJ8425013] 资助。

所有小鼠实验均事先获得伦敦大学学院伦理委员会批准，并依据英国政府《1986年动物（科学程序）法》及后续相关法规授权进行。
1. 在软件应用程序上制备自动迷宫控制程序
注意：使用了如图1A-C所示的自动化放射臂迷宫，以及图1D中的房间布局。
<ol>
	<li>按照图2所述准备门关闭的实验流程。</li>
	<li>在软件应用程序中设置习惯化阶段1的开始（图2A）。具体操作步骤如下：
	<ol>
		<li>设置试验开始和视频录制，并在软件中关闭所有臂。当软件识别到小鼠进入迷宫中央枢纽后5秒，开始追踪并打开所有门。</li>
		<li>当小鼠进入某一臂且距离中央枢纽最近的门4 cm时，关闭所有门。随后立即打开小鼠所选臂的门。</li>
		<li>当小鼠返回中央枢纽后，关闭该臂的门，将其限制在中央枢纽内5秒。重复此过程30分钟。</li>
		<li>当30分钟结束且小鼠返回中央枢纽时，停止视频录制和追踪。 
		注：允许小鼠根据自身意愿自由探索迷宫。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>习惯化阶段2（图2B）
	<ol>
		<li>在相关软件中设置试验开始和视频录制，并关闭所有门。</li>
		<li>当软件识别到小鼠进入迷宫中央枢纽后5秒，开始追踪并打开所有门。</li>
		<li>若小鼠每个臂至少进入两次，或经过30分钟后返回中央枢纽，则结束试验。允许小鼠根据自身意愿自由探索迷宫。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>习惯化阶段3（图2C） 
	注：此阶段为阶段1和阶段2的结合。
	<ol>
		<li>设置软件以启动试验和视频录制，并关闭所有门。</li>
		<li>当软件识别到小鼠进入中央枢纽后5秒，设置软件控制迷宫门的开启。此时开始追踪并打开所有门。</li>
		<li>当小鼠进入某一臂且距离中央枢纽最近的门4 cm时，关闭所有门，然后打开该臂的门。</li>
		<li>当小鼠完全进入中央枢纽后关闭门，将其限制在中央枢纽内3秒。重复此序列30分钟，或直到小鼠每个臂至少进入一次。</li>
		<li>在满足上述条件且小鼠完全进入中央枢纽后，设置试验结束。 
		注：允许小鼠根据自身意愿自由探索迷宫。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>工作记忆任务（图2D、E）
	<ol>
		<li>设置软件以启动试验和录制，并关闭所有门。</li>
		<li>当软件识别到小鼠进入中央枢纽后5秒，设置软件开始追踪。</li>
		<li>开始强制运行阶段。以伪随机顺序依次向小鼠呈现4个臂。</li>
		<li>当小鼠进入第一个臂且距离中央枢纽3 cm时，确保门关闭，并将其限制在该臂内15秒。</li>
		<li>让门&#160;打开，使小鼠返回中央枢纽。</li>
		<li>关闭该门，然后打开第二个臂。</li>
		<li>重复此过程直至第四个臂。</li>
		<li>在强制运行阶段中，当小鼠完成第四个臂并返回中央枢纽后，将其限制在中央枢纽内5秒。</li>
		<li>打开所有门，开始自由运行阶段。</li>
		<li>当小鼠在收集完所有奖励/每个臂至少进入一次后返回中央枢纽时，结束试验。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 准备用于单只饲养的家居笼
<ol>
	<li>为新实验设置使用标准筑巢材料的新笼子。
	<ol>
		<li>为每只实验小鼠在新笼子中放入新垫料、木屑、纸制小屋、纸制隧道、纸制筑巢条和木质咬合块。</li>
		<li>放置食物加料斗并盖上盖子。 
		注意：若未放置食物加料斗，小鼠可能会损坏通风部件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 动物饲养室中的操作、称重及饮食限制（第 -7 天至第 0 天）
<ol>
	<li>用手轻轻地引导小鼠进入饲养笼中提供的纸制隧道。</li>
	<li>用手通过纸制隧道38,39,40将小鼠从群养笼中提起，并在胸部高度保持数秒。或者，让小鼠自愿爬到手上。 
	注意：在行为学实验中，以最小化应激的方式处理动物至关重要。切勿通过尾巴抓取小鼠，这会对其造成显著应激。使小鼠适应实验人员同样重要。小鼠必须充分适应并保持放松状态，否则后续在迷宫中的学习效果将不佳。</li>
	<li>始终采用相同的抓取方式固定小鼠。将小鼠置于天平上监测体重，并记录其体重。 
	注意：避免因快速移动或制造噪音而使小鼠产生应激。最好在安静环境中进行此操作，否则小鼠可能从天平或实验人员手中跳下。此外，若小鼠处于应激状态，可能出现眯眼、发出尖叫声，甚至咬伤实验人员的手41,42。</li>
	<li>称重后，将小鼠放入先前准备好的新笼中。</li>
	<li>在接触放射臂迷宫前一周，开始对小鼠实施限量饮食。此举可激励其在迷宫中主动觅食以获取食物奖励。实验期间的食物奖励为稀释的甜炼乳。</li>
	<li>在笼中提供 2 ~ 3 g 标准饲料，并在整个实验过程中维持小鼠体重为其初始体重的 85 ~ 90%。 
	注意：C57BL/6 小鼠每日摄食标准饲料约 3–4 g43。</li>
	<li>以夜间体重下降情况为参考，标准化次日饲料供给量。此后，每日提供足量的标准饲料，以在整个实验期间维持其体重为初始体重的 85–90%。 
	注意：这些动物需缓慢减重。应监测其体重及面部表情，以避免应激。</li>
	<li>在饲养笼中放置装有 1 mL 稀释炼乳（奖励物；甜炼乳 : 水 = 1 : 1）的小塑料杯，直至第一阶段适应期结束，以使小鼠适应奖励物。确保小鼠摄食该奖励物。若所用小鼠品系对所提供食物表现出新奇物恐惧（neophobia），应更换奖励食物。 
	注意：自第二阶段适应期起，不再在饲养笼中提供奖励物。若任何小鼠的体重降至初始体重的 80% 以下，应根据 IACUC 及所在国家相关指南实施安乐死。若在首次体重检测时，某小鼠未达到所用品系的正常体重范围（8–12 周龄时为 20–30 g），则不应将其纳入实验队列，以避免后续难以维持其体重在目标范围内。</li>
</ol>
4. 将小鼠带入测试室
<ol>
	<li>使用推车将小鼠缓慢运送到行为测试室。</li>
	<li>让小鼠在推车上静置 5 分钟，期间不进行干扰。</li>
</ol>
5. 实验室设置
<ol>
	<li>将中央枢纽区域的间接照明设置为80勒克斯（lux），使用暖白光灯泡，并在中央枢纽处播放70分贝（dB）的白噪声。注：已知中等强度的白噪声暴露可使大鼠在几何结构复杂的迷宫中表现更佳44,45。白噪声的作用似乎不仅仅是掩盖环境中不可避免的背景噪声；70分贝的白噪声可增加大鼠多个脑区的胆碱摄取，包括前额叶皮层、下丘脑和海马体（但纹状体除外）46，而RAM工作记忆的表现已知依赖于海马体、额叶皮层和前脑之间胆碱能通路的完整性32,47。此外，动物在环境中精确导航时会同时利用远端和近端视觉线索。然而，在空间学习过程中，小鼠更依赖远端视觉线索而非近端线索进行导航48。在本实验中，尽管在8臂RAM的各个臂后壁上引入了印在小纸片上的近端视觉线索，但并未减少“链式”行为（daisy-chaining behavior）。相反，几何不对称的远端视觉线索（位于房间天花板和墙壁上）能够减少链式行为，并对RAM中的空间导航至关重要。</li>
</ol>
6. 习惯化阶段1 - 无奖励（第1-2天）
注意：迷宫中不放置任何奖励物。此阶段旨在使小鼠适应迷宫的门及其发出的声音。
<ol>
	<li>点击开始小鼠追踪和视频录制 开始 点击软件上的按钮，然后将小鼠缓慢移至迷宫，避免使其受到应激。操作时，实验者用手握住小鼠，缓慢移动并逐渐调整高度。将小鼠放置于中央枢纽区域。 
	注意：如果小鼠在实验者手上出现颤抖，应放慢动作，这是恐惧的表现。在中央枢纽内5秒的限制期间，小鼠会移动。在开始强制跑动阶段前，小鼠被放入中央枢纽时可面向任意一侧。</li>
	<li>持续在放置于远离迷宫或低于迷宫壁高度的电脑显示器上观察小鼠的行为。若小鼠试图通过攀爬迷宫壁逃离，只需从椅子上站起以表明实验者的存在，并向其走近。&#160;监测其表现。在最坏情况下，将小鼠推回&#160;迷宫 
	注意：通常情况下，当实验人员靠近时，其衣物摩擦产生的声音会使小鼠返回迷宫。此操作需迅速完成。若实验人员持续进行该操作，小鼠在适应阶段1至3结束后会停留在迷宫内。若小鼠 repeatedly 跳出迷宫，建议将其排除于后续实验及分析之外。</li>
	<li>试验结束后，从迷宫的一个臂中收集小鼠时，让小鼠自愿爬到实验者的一只手上，同时用另一只手遮住迷宫臂，防止小鼠跳离迷宫。</li>
	<li>刷去小鼠粪便，并用干纸巾擦拭迷宫，以清除食物奖励的任何残留痕迹。随后用湿纸巾擦拭，再用干纸巾将迷宫擦干（约2分钟）。</li>
	<li>对每只小鼠依次进行两天的上述操作。 
	注意：30 分钟后，小鼠可能尚未访问迷宫的全部 8 个臂。这是正常现象，不会造成问题。小鼠通常以非系统性、非顺序性的方式访问各臂，并谨慎移动，在每个臂中停留的时间不均等。在此阶段，小鼠可能会攀爬迷宫壁和/或跳出迷宫。如果发生此类情况（例如小鼠试图攀爬墙壁），实验人员应通过靠近迷宫并制造一些声响（如衣物摩擦声）使小鼠意识到其存在，从而阻止该行为。因此，可能需要仔细观察小鼠在放射状八臂迷宫（RAM）中的行为并迅速采取行动。经过数次重复该操作后，小鼠通常会留在迷宫内。如果尽管采取了所有措施，小鼠在适应阶段仍无法留在 RAM 中，则应将其从分析中剔除。</li>
</ol>
7. 习惯化阶段2 - 奖励阶段（第3-4天）
注意：此阶段旨在鼓励小鼠在迷宫中自由探索以获取食物奖励。
<ol>
	<li>在每个臂的食物孔中各加入 70 μL 的食物奖励。</li>
	<li>点击软件上的 开始 按钮启动小鼠轨迹追踪和视频录制，然后按照 6.1 节所述将小鼠放置于迷宫中央枢纽。</li>
	<li>从远处通过电脑显示器持续观察小鼠行为，必要时记录其行为表现，例如攀爬迷宫壁或跳出迷宫。当小鼠每个臂至少进入两次，或已过去 30 分钟时，结束该次试验。</li>
	<li>试验结束后，通过让小鼠自愿爬到实验者的手上将其从某一臂中取出，同时用另一只手遮挡该臂，防止其跳出迷宫。</li>
	<li>按照 6.4 节（习惯化阶段 1）所述方法清洁迷宫（约 2 分钟）。</li>
	<li>每只小鼠每天进行两次，连续两天重复此操作。 
	注意：在此阶段，小鼠可能出现连锁行为（daisy-chaining），但无需担忧，因为在工作记忆任务中额外增加的 4 次入臂次数可能会抑制此类行为。在此步骤中，小鼠可在不取食奖励的情况下停留在臂内。第 4 天时，小鼠应比第 3 天训练得更好，但仍可能停留在臂的中间位置。</li>
</ol>
8. 习惯化阶段3 - 奖励阶段（第5-6天）
注意：此阶段旨在使小鼠适应第一阶段和第二阶段组合环境。
<ol>
	<li>用70 μL的奖励物将所有食物井进行诱饵处理。</li>
	<li>点击软件的开始按钮，并将小鼠放置于迷宫的中央枢纽，以启动小鼠追踪和视频记录。</li>
	<li>从远处持续观察PC显示器上小鼠的行为，直到小鼠至少进入每个臂一次，或已过去30分钟。若小鼠试图逃离迷宫，应按照适应阶段1（6.2）所述迅速处理。</li>
	<li>试验结束后，让小鼠自愿爬到实验者的手上，同时用另一只手遮盖迷宫臂，防止其跳离迷宫，从而将小鼠从迷宫中移出。</li>
	<li>按照6.4节（适应阶段1）所述方法清洁迷宫（约2分钟）。</li>
	<li>每只小鼠每天进行两次，持续两天。 
	注意：在此阶段，最好将任何试图逃离迷宫的小鼠从分析中剔除。</li>
</ol>
9. 工作记忆任务 - 有奖励（第7天 - 第15天）
<ol>
	<li>用40 μL的奖励物对所有臂进行引诱。将奖励物放置在每个食物井中靠近中央枢纽的位置，以使小鼠从中央枢纽难以看到。</li>
	<li>点击软件的开始按钮，启动小鼠追踪和记录，然后将小鼠轻轻放置在迷宫的中央枢纽上，避免使其受到应激。</li>
	<li>在中央枢纽限制5秒期间，走开并坐在远离迷宫的地方。观察小鼠的行为，并记录小鼠在迷宫中访问各臂的顺序（见补充文件1）。</li>
	<li>当小鼠收集完全部八个食物奖励后，停止记录其访问臂的顺序，这标志着工作记忆任务的结束，随后让小鼠额外访问四个臂。 
	注意：通过此操作，小鼠在被取出前可获得稍长的自由活动时间，有助于其专注于工作记忆任务。此步骤还可强化小鼠对“奖励物一旦被取走便不会补充”的认知。</li>
	<li>在完成四次额外臂访问后，在最后一次臂访问结束时，将手覆盖该臂的上方，让小鼠爬到手上，从而将其从迷宫中移出。 
	注意：避免在中央枢纽捕捉小鼠，以免小鼠将被捕捉与中央枢纽（即其决定下一步前往哪个臂的位置）产生关联。当小鼠熟悉任务（包括额外臂访问）后，它们可在最后一个食物井附近自由移动，或在中央枢纽停留一段时间。但应在3分钟内完成4次额外臂访问。若超过5分钟仍未完成，则将其放回饲养笼。</li>
	<li>通过轻敲下一个笼子的笼壁，选择下一个笼子以调节小鼠的觉醒水平，准备下一次试验。</li>
	<li>按照6.4节（适应阶段1）所述方法清洁迷宫（约2分钟）。</li>
	<li>继续进行下一只小鼠的实验，并在9天内轮流对每只小鼠重复此过程6次。 
	注意：随着小鼠逐渐学会识别已无更多奖励或已无新臂可探索的情况，后期试验中四次额外臂访问的平均持续时间应逐渐延长。</li>
</ol>
10. 评分
<ol>
	<li>计算 &#34;每日成功率评分&#34; (%) = 4（目标进入次数）/（总臂进入次数 [4 + 错误次数]）× 100 
	注意：强制运行后，仅有四个臂内设有奖励（即目标臂）。若小鼠进入其在强制运行阶段已访问过的臂，则计为一次错误；重复进入任一臂也计为错误。&#160;在自由运行状态下。</li>
	<li>计算 &#34;完美试验比例评分&#34; (%) 在6次试验中 = [（完美试验次数）/ 6] × 100 
	注意：完美得分表示无工作记忆错误。</li>
	<li>在软件中选择小鼠的速度、移动距离和加速度参数，用于分析并计算每天的平均值。分析时需排除额外的四次臂进入次数。此外，在实验结束后通过回看小鼠轨迹追踪视频，测量这四次额外臂进入的持续时间。 
	注意：小鼠在之后可立即快速转身&#160;进入一个臂。不要将其计数或评分&#160;一个条目，因其为快速纠正错误，&#160;这意味着工作记忆是有效的49然而，如果小鼠越过臂的中点或在臂内停留超过3秒，则记录并计为一次进入。每日成功次数得分反映小鼠的学习曲线，完美试验比例得分反映工作记忆保持效率。</li>
</ol>
11. 统计学
<ol>
	<li>若研究对照组与基因敲除小鼠品系之间的差异（如先前发表的研究50中所述），请按以下方法进行统计分析。
	<ol>
		<li>使用重复测量双因素方差分析（ANOVA）并结合事后分析（例如 Bonferroni 检验），比较对照组和实验组的结果数据［在 9 个不同时间点对每个个体进行测量］。</li>
		<li>若进行组间比较，每组应至少测试 10 只，理想情况下约 20 只小鼠。当基因操作、造模损伤或药物处理的效果明显时，可使用较小样本量得出结论。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明无利益冲突需要披露。&#160;

工作记忆1 是一种认知过程，能够在短时间内存储有限的信息，并在执行心理任务（如记忆电话号码或从不同位置记住前往目的地的路线）的规划与实施过程中对这些信息进行操作和使用。工作记忆与流体智力密切相关，后者是指快速推理和抽象思维的能力。有研究认为，工作记忆训练可以提升流体智力2。因此，工作记忆对于科学研究至关重要。
目前最常用的啮齿类动物行为实验最初是于20世纪80年代为大鼠设计的，而如今研究人员经常将这些实验方案应用于小鼠。然而，大鼠与小鼠在行为上存在持续且显著的差异3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19。特别是恐惧管理是一个可能影响实验结果的重要因素，因为与大鼠相比，小鼠更容易产生应激反应3,4,5,6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19。因此，在将这些实验方案应用于小鼠时，必须充分考虑二者之间的差异。在本实验方案中，我们力求在八臂放射迷宫工作记忆任务期间最大限度地减少应激因素。这通过使用小鼠追踪与迷宫控制软件精确控制门的关闭时间来实现。此外，我们避免在实验阶段结束时于中央枢纽区域捕捉小鼠。该方法使小鼠能够在选择下一个臂时，不会将该位置与被捕获的恐惧感相关联。将小鼠的捕捉延迟至迷宫中所有奖励均已被取走之后，确保了最后一次获取奖励的体验不会与被捕获的负面经历相联系。
陆地放射臂迷宫（radial arm maze, RAM）是一种广泛使用的实验装置，用于评估啮齿类动物的空间与非空间学习记忆能力，并检测其工作记忆和参考记忆。它是小鼠空间学习与记忆研究中最常用的实验装置之一20,21,22。RAM 利用啮齿类动物探索迷宫、寻找新奇事物以及通过试错方式学习空间信息的自然倾向，同时也结合了觅食行为。通过限制其饮食并在迷宫中以偏好食物作为奖励，可进一步增强这种行为倾向。目前，已有多种 RAM 装置的变体被使用，例如具有 6、8、12 或 16 个臂的迷宫，以及部分封闭或开放/高架式的装置23,24,25。现今大多数实验方案均基于 Olton 等人提出的方法20,26，但通常采用更简单的（6 或 8 个臂）迷宫设计9,24,27,28,29。在放射臂迷宫（6 或 8 个臂）中测试工作记忆比使用 T 型迷宫（2 个臂）更具优势，因为动物在前者中有更多的臂可供选择和探索。
原始的RAM由Olton和Samuelson设计20 通过使用食物诱饵作为正向强化手段来评估大鼠的空间学习与记忆能力，不同于 Morris 水迷宫和八臂放射状水迷宫等利用负向强化（即让动物浸入水中）的水迷宫实验20,30,31,32. Olton 和 Samuelson20发现大鼠在通过放射状迷宫（RAM）时对空间位置具有出色的记忆能力。他们证明了海马体参与空间信息的处理。因此，他们提出了一个概念&#160;双重记忆系统，包括工作记忆和&#160;参考记忆，啮齿类动物中的双重&#160;记忆系统已被提出&#160;此前由 Honig 报道36&#160; 基于实验&#160;与鸽子。Olton 等人&#160;发现海马体功能对工作记忆至关重要。这是通过在内嗅区、穹窿伞体部、海马体前方、隔区或后连合穹窿等部位制造损伤，以破坏海马体结构的主要外部纤维连接而实现的。26,33,34,35穹窿-齿状回病变未影响参考记忆26.&#160;
在现代实验方案中，动物通过连续3天、每天自由探索迷宫10-15分钟来适应环境，随后进行为期1-3周的迷宫训练，所有分支末端或固定选定分支末端放置偏好的食物，分别用于测试工作记忆，或在同一实验中同时测试工作记忆和参考记忆9,29,37。
这些实验方案通常描述得不够完整，且未充分考虑大鼠与小鼠之间的行为差异。本文中，我们详细介绍了我们的实验方案及相关经验，特别是如何根据大鼠与小鼠在恐惧管理方面的差异，避免将恐惧经历与特定地点和时间相关联。本方案适用于希望研究空间工作记忆，并将其应用于小鼠的电生理学、实时成像和组织学研究的科研人员。

<table><tbody><tr><td>动脉钳或钳子</td><td>任何</td><td>N/A</td><td>用于切割标准饲料</td></tr><tr><td>C57BL/6J小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>000664</td><td>2～3个月大</td></tr><tr><td>炼乳（Carnation）</td><td>Nestle</td><td>N/A</td><td>在任务中用作奖励</td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td>任何</td><td>N/A</td><td>用于炼乳的清洗和稀释液</td></tr><tr><td>EthovisionXT13&amp;nbsp;</td><td>Noldus</td><td>N/A</td><td>控制迷宫门并追踪小鼠</td></tr><tr><td>多体位点模块</td><td>Noldus</td><td>N/A</td><td>用于多身体部位追踪</td></tr><tr><td>试验 &amp;硬件控制模块</td><td>Noldus</td><td>N/A</td><td>用于试验 &amp;硬件控制</td></tr><tr><td>I/O 盒</td><td>Noldus</td><td>N/A</td><td>控制迷宫门</td></tr><tr><td>迷宫外视觉线索</td><td>任何</td><td>N/A</td><td>用于小鼠迷宫定位</td></tr><tr><td>高分辨率相机</td><td>Tracksys</td><td>N/A</td><td>用于小鼠追踪与拍摄</td></tr><tr><td>画笔</td><td>任何</td><td>N/A</td><td>用于清洗</td></tr><tr><td>纸隧道</td><td>任何</td><td>N/A</td><td>用于小鼠操作</td></tr><tr><td>纸制圆顶屋</td><td>任何</td><td>N/A</td><td>用于筑巢</td></tr><tr><td>纸张嵌套条纹</td><td>任何</td><td>N/A</td><td>用于筑巢</td></tr><tr><td>Pipetteman P1000&amp;nbsp;</td><td>Gilson</td><td>F144059M</td><td>为家庭笼舍提供稀释的炼乳</td></tr><tr><td>P1000 吸头</td><td>任何</td><td>任何</td><td></td></tr><tr><td>Pipetteman P200</td><td>Gilson</td><td>F144058M</td><td>用于迷宫诱饵</td></tr><tr><td>P200 吸头</td><td>任何</td><td>任何</td><td></td></tr><tr><td>放射臂迷宫</td><td>Tracksys</td><td>N/A</td><td>定制</td></tr><tr><td>房间灯具</td><td>任何</td><td>N/A</td><td>为了确保迷宫内光照均匀</td></tr><tr><td>小型塑料杯</td><td>任何</td><td>N/A</td><td>为家庭饲养笼提供稀释的炼乳</td></tr><tr><td>白噪声扬声器</td><td>任何</td><td>N/A</td><td>用于播放白噪声</td></tr><tr><td>标准饲料</td><td>任何</td><td>N/A</td><td>饮食限制</td></tr><tr><td>纸巾</td><td>任何</td><td>N/A</td><td>用于清洗</td></tr><tr><td>可调焦透镜</td><td>Tracksys</td><td>N/A</td><td>5-50 毫米，手动对焦，手动光圈</td></tr><tr><td>木质咬口器</td><td>任何</td><td>N/A</td><td>用于筑巢</td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>Falcon</td><td>Falcon&amp;trade; 352070</td><td>用于将炼乳与蒸馏水按1:1比例混合</td></tr></tbody></table>

一种用于小鼠的半自动化八臂放射迷宫中的趋近性空间工作记忆任务，可减少迷宫中恐惧记忆的关联

An Appetitive Spatial Working Memory Task for Mice in a Semi-Automated 8-Arm Radial Maze, Reducing Fearful Memory Association in the Maze

本文详细介绍了一种利用半自动八臂放射状迷宫（radial 8-arm maze, RAM）检测小鼠空间工作记忆的实验方案。RAM 是一种部分封闭的装置，由中央平台向外呈放射状延伸出8条水平且等距分布的臂，每条臂的入口可通过伺服电机控制的自动门独立调控。实验开始时，动物被放置于中央平台，并允许其在迷宫中探索，以获取位于各臂末端或特定臂末端的食物奖励。RAM 任务最初为大鼠设计，我们已将其方案优化适用于小鼠，例如增加了适应性训练步骤。在本方案中，所有臂最初均放置加糖炼乳作为诱饵，小鼠首先被依次引导进入4条经伪随机选择的臂以获取奖励（“强制运行”阶段），随后同时打开所有门，允许小鼠自由探索并寻找剩余4个奖励（“自由运行”阶段）。在强制运行与自由运行之间设置5秒延迟，以增加对工作记忆的挑战；若小鼠在自由运行阶段进入此前已访问过的臂，则记录为一次错误。当所有奖励均被获取后，任务结束。经过6天的适应期及9天的迷宫训练后，雄性C57BL/6小鼠通常可达到每日≥80%的成功率，成功率计算公式为4/(4+E)，其中E为错误次数。该半自动化任务原则上可与其他 体内 电生理学、多光子显微镜或钙成像等监测方法。

本方案曾用于我们此前的发表研究，旨在利用MyRF cKO小鼠和对照组50，探究新生少突胶质细胞和髓鞘是否对空间工作记忆任务的表现具有必要性。我们发现，对照组小鼠的工作记忆任务表现有所提升，而MyRF cKO小鼠则未见改善。在野生型小鼠中，工作记忆任务可刺激并促进与工作记忆处理相关的脑区中少突胶质前体细胞（OPCs）的增殖与分化，以及少突胶质细胞（OL）的髓鞘形成。我们还曾采用T型迷宫奖励交替任务评估空间工作记忆。该任务用于检测MyRF cKO小鼠的工作记忆缺陷。然而，在接受T型迷宫奖励交替任务的小鼠组与笼内对照组之间，组织学分析未观察到显著差异。因此，我们得出结论：本研究中所呈现的方案在研究工作记忆方面比T型迷宫奖励交替任务更为有效。
每只小鼠每天进行6次工作记忆任务试验，总计持续一小时。因此，本实验方案允许每批最多8只小鼠同时进行。在早期适应阶段，小鼠在迷宫臂中的停留时间不均，运动速度较慢，并在迷宫臂末端停留较长时间。直到适应期第5天结束时，它们在各迷宫臂中的活动时间仍存在较大差异，且可在不触碰奖励物的情况下返回中央枢纽（图3A）。然而，到第6天时，动物在8–15分钟内至少进入每个迷宫臂一次，并在各个臂中停留的时间趋于一致，表明动物已适应迷宫环境，具备开展正式任务的条件（图3A，第6天下排图像，以及 图3B）。
在适应阶段，它们经常用后肢站立，并从臂部或中央枢纽向上张望。在工作记忆任务期间也观察到类似行为，但它们并不一定沿相同方向移动（例如，2 -&gt; 3-&gt; 5 -&gt; 8 [顺时针] 或 8 -&gt; 5 -&gt; 3 -&gt;2 [逆时针]）。它们可以改变方向（例如，5 -&gt; 4 -&gt; 6 -&gt; 1). 单只小鼠对选择臂的顺序没有明显的群体倾向性。在自由运行阶段，小鼠选择最后一个获得奖励的臂所花费的时间略长于选择第一个获得奖励的臂，这可能是因为在自由运行阶段的首次选择时有四个选项，而到最后一次奖励时仅剩一个选项。强制运行阶段的第一个臂至少在自由运行开始前50（15+15+15+5）秒向小鼠呈现。因此，若无工作记忆错误，该工作记忆任务并不容易完成。 补充视频 1 显示一只小鼠在工作记忆任务训练第8天完成了一次完美试验。
无论采用哪种评分系统，我们均发现小鼠在为期9天的RAM测试期的前3天表现几乎持平，但此后显著改善（图4A、B）。经过6天的适应期和9天的迷宫训练后，雄性C57BL/6小鼠通常从第8天起每日成功率得分稳定达到≥80%，该得分定义为4/(4+E)，其中E为错误次数。自由运行期间的平均行进距离随时间逐渐缩短，但平均速度和加速度则日间相对稳定（图4C–F）。小鼠可能在额外进入四次迷宫臂期间形成了被捕获的恐惧记忆，这可能是实验后期小鼠停留时间延长的原因之一（图4G）。
在本实验方案中，适应期持续6天，这有助于使动物的生物钟适应实验条件，即使动物饲养设施中的光/暗周期未被反转。
<img alt="用于行为实验的放射状迷宫装置；包含模块化臂、食穴和实验室布局的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66456/66456fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：RAM 规格与特性 (A从顶部安装的CCD和侧面观察的迷宫视图及其尺寸。B食物井低于迷宫底面1.5 cm，以确保小鼠无法从迷宫表面看到其中的内容 &gt;10 cm 远处。 (C迷宫区域设置。图中显示中央枢纽及第1至第8臂。D实验房间示意图及外部视觉线索，附房间照片。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66456/66456fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠在迷宫中的行为追踪示意图；包含任务与条件流程图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66456/66456fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：迷宫控制程序的流程图。（A）适应阶段 1（第 1 和第 2 天）。（B）适应阶段 2（第 3 和第 4 天）。（C）适应阶段 3（第 5 和第 6 天）。（D）工作记忆任务（第 7–15 天）。（E）工作记忆任务范式的示意图。小鼠依次进入伪随机选择的四个强制运行臂，在中央枢纽内被限制 5 秒后，再进行自由运行以获取剩余的奖励。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66456/66456fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠适应过程；迷宫实验的路径追踪结果及试验时长表格。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66456/66456fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：6天适应期间的热图与鸟巢图。（A）三只小鼠在适应期第1至第6天的运动轨迹热图。在适应期第3至第6天，每只小鼠每天进行两次试验；上方热图显示第一次试验，下方热图显示第二次试验。（B）适应期第6天的鸟巢图。上方三幅为小鼠1、2、3的第一次试验，下方三幅为第二次试验。下方表格列出了这三只小鼠各次试验的持续时间。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66456/66456fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="分析小鼠9天行为指标的图表：成功率、cm、cm/s、cm/s²、秒。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66456/66456fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：RAM工作记忆任务。（A）每日平均成功率（%），计算公式为 [4 /（自由探索阶段的入臂次数）× 100]。每天的成绩取6次试验的平均值。（B）任务进行9天期间的完美试验得分。（C）个体小鼠行进距离及平均值。（D）任务中小鼠的个体奔跑速度及平均值。（E）小鼠的个体加速度及平均值。（F）小鼠的个体减速度及平均值。（G）额外4次入臂访问的个体持续时间及平均值。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66456/66456fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
补充视频 1：小鼠在工作记忆任务训练的第 8 天完成了一次完美的试验。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66456/Supplementary%20video%20JoVE66456%20Takahiro%20Shimizu%20et%20al.avi" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充文件 1：示例记录表。在观察小鼠行为的同时，记录其前肢访问的顺序。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66456/Example%20Recording%20Sheet%20JoVE66456%20Takahiro%20Shimizu%20et%20al.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

大多数啮齿类动物的行为实验最初是为大鼠设计的。由于大鼠与小鼠之间存在行为差异，这些实验有时需要针对小鼠进行修改。本文介绍了一种用于检测小鼠空间工作记忆的方法，旨在尽量减少工作记忆任务过程中小鼠所承受的压力。

本文详细描述了一种利用半自动八臂放射状迷宫（RAM）检测小鼠空间工作记忆的实验方案。RAM 是一种部分...

大多数啮齿类动物的行为实验最初是为大鼠设计的。随着近年来基因工程技术的进步，研究人员经常使用为大鼠建立的实验方案对小鼠进行行为实验。由于大鼠与小鼠在行为上存在差异，有时需要对小鼠的实验方案进行调整。在本视频中，我们介绍一种用于检测小鼠空间工作记忆的实验方案。工作记忆是一种认知过程，能够在短时间内存储有限的信息，并在心理任务的规划与执行过程中对其进行操作和利用。在人类中，工作记忆与流体智力的测量指标相关，对学习具有重要意义。因此，工作记忆本身是重要的研究课题。

[讲师] 为新实验准备新的笼子，使用标准的筑巢材料。在新笼子中放入新的垫料木屑、纸制管道、纸制筑巢条和木质啃咬块。放置好罩式食槽并盖上盖子。用手将小鼠引导至其家笼中提供的纸制管道内。使用纸制管道从群养笼中轻轻提起小鼠。将小鼠放在手上，并在胸部高度保持数秒钟。或者，让小鼠自行爬到手上。切勿通过尾巴抓取小鼠。在行为学实验中，以最小化应激的方式处理动物至关重要。使小鼠习惯实验人员的操作同样重要。应采用相同的抓取方法捕捉小鼠。将小鼠放在电子秤上监测体重，并记录其体重数值。称重后，将小鼠放入先前准备好的新笼中。操作小鼠时，避免快速移动或发出巨大声响，以免惊吓小鼠，否则小鼠可能从秤上或手上跳下。在接触实验装置前一周，对小鼠实施定量喂养限制。控制标准饲料的供给量，以促使小鼠在实验中积极探索迷宫以获取食物奖励——即稀释的甜炼乳。每天在笼中提供2至3克标准饲料，并在整个实验期间维持小鼠体重为其初始体重的85%至90%之间。同时在此阶段，于家笼中的小型塑料杯内提供1毫升稀释炼乳，使小鼠适应该食物。观察小鼠是否摄食一段时间，确保小鼠不表现出食物新奇恐惧（food neophobia）。使用推车将小鼠缓慢运送至行为测试室。然后调节房间光照，使用暖白色灯泡将中央枢纽区域照度设为80 lux，并播放70分贝的白噪音（在中央枢纽处测得）。实验开始前，让小鼠静置5分钟，不受干扰。习惯化阶段一：将迷宫控制系统设置为允许小鼠在门由小鼠追踪软件控制的情况下探索迷宫。此阶段旨在使小鼠适应门的运动及其发出的声音。点击软件上的“开始”按钮启动试验和视频录制，随后将小鼠带至迷宫并放置于中央枢纽。持续观察小鼠行为。此阶段迷宫内不放置食物奖励。小鼠可自由访问任一臂，次数不限。在30分钟内，门的控制不会干扰小鼠的活动。持续进行直至30分钟结束。试验结束后，从某一臂中取出小鼠并放回家笼。为下一只小鼠清洁迷宫。每只小鼠均按此流程连续进行两天。仲裁阶段二：将迷宫控制系统设置为允许小鼠在无门控干预的情况下自由探索迷宫，并在各臂末端的食物井中寻找食物奖励。此阶段旨在鼓励小鼠为获取食物奖励而自由探索迷宫。在每个臂的食物井中放置70 µL奖励物。自习惯化阶段二起，不再在家笼中提供该奖励物。点击软件“开始”按钮启动试验和视频录制，随后将小鼠带至迷宫。观察小鼠行为。在此阶段，小鼠移动较慢，表现谨慎，可能多次返回同一食物井。持续进行直至小鼠至少进入每个臂两次，或30分钟时间结束。试验结束后，从某一臂中取出小鼠并放回家笼。为下一只小鼠清洁迷宫。每只小鼠每天重复两次，连续进行两天。习惯化阶段三：将迷宫控制系统设置为使小鼠适应阶段一与阶段二的组合条件。允许小鼠至少进入每个臂一次。在所有食物井中均加入70 µL奖励物。点击软件“开始”按钮启动试验和视频录制，随后将小鼠带至迷宫。观察小鼠行为。持续进行直至小鼠至少进入每个臂一次，或30分钟时间结束。试验结束后，从某一臂中取出小鼠并放回家笼。为下一只小鼠清洁迷宫。每只小鼠每天重复两次，连续进行两天。如本图所示，随着时间推移，小鼠访问的臂数逐渐增加。在习惯化第六天，小鼠可在7至15分钟内至少进入每个臂一次，并在各臂停留相似的时间，表明动物已适应迷宫环境，可进入正式任务阶段。该空间工作记忆任务在单次试验中包含三个部分：强制运行、中央枢纽5秒禁闭，随后为自由运行。在强制运行阶段，随机伪选择四个臂，并依次向小鼠呈现。在自由运行阶段，小鼠需记住在本次试验的强制运行中已访问过的臂，以便最高效地获取剩余四个奖励。迷宫设置应遵循前一屏幕所示的方案，每轮试验中所有小鼠必须经历相同的一组强制臂。小鼠每天进行六次试验，持续九天。每次试验开始前，在所有臂的食物井中加入40 µL奖励物。将奖励物放置在靠近中央枢纽的食物井内，使其难以从中央枢纽直接看到。点击软件“开始”按钮启动试验和视频录制。将小鼠带至迷宫中央枢纽时，避免造成应激。小鼠在中央枢纽禁闭5秒后，试验将自动开始。在5秒禁闭期间，离开迷宫区域并在距离迷宫不远的位置坐下。持续观察行为，并记录小鼠访问臂的顺序以供评分，直至小鼠获取所有奖励。当小鼠收集完迷宫中所有奖励后，允许其额外访问四个臂。通过此操作，小鼠不会将被捕获与中央枢纽关联起来——而中央枢纽对小鼠决定下一步行动方向至关重要。此外，工作记忆任务的完成与被捕获之间也不会直接关联。同时，这也将强化“先前访问过的臂中奖励不会补充”的认知。在第四个额外臂的末端，用一只手覆盖该臂，让小鼠爬到另一只手上，随后将其放回家笼。在清洁迷宫前，轻敲下一只待测小鼠的家笼，以平衡其觉醒状态，为下一次试验做准备。清洁迷宫时，使用画笔、一张湿纸巾和两张干纸巾。先用画笔清除小鼠粪便。用干纸巾擦拭迷宫表面，去除残留的炼乳痕迹。再用湿纸巾擦拭迷宫地板。最后用干纸巾擦干迷宫，进入下一次试验。每日成功率得分计算方式为：4除以总臂进入次数。实验最后一天的平均成功率约为80%。完美试验比率得分计算方式为：完美试验次数除以6，在实验最后一天达到60%以上。在软件中选择对小鼠的速度、距离和加速度进行分析，并执行分析。注意在上述分析中排除额外的四次臂访问数据。同时测量这四次额外臂访问的持续时间。若小鼠学习效果良好，其移动距离应随时间缩短；速度与加速度应保持平稳；而额外四次臂访问的持续时间应随时间延长。

进行本实验时，至关重要的是让小鼠熟悉实验操作人员，并使小鼠适应实验房间的环境，从而最大限度地减少小鼠的应激反应。

该方案易于使用且可靠，可重复获得数据。由于迷宫为半自动化，该方案无需大量人力，适用于实验室成像和电生理学研究。该方案是研究空间工作记忆的有力工具。

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