快速分离无颗粒细胞的斑马鱼I期卵母细胞

本研究旨在建立一种快速高效分离纯度较高的第一期卵母细胞的方法，同时去除颗粒细胞污染。主要目标是开发一种方法，以促进在卵母细胞特异性研究领域（特别是基因组学和表观遗传学研究）中进行更精确的分析。斑马鱼的卵母细胞被单层颗粒细胞所包裹。

由于卵母细胞与颗粒细胞在数量和体积上存在显著差异，很难将颗粒细胞与卵母细胞清晰分离，这使得获取用于特定分析（尤其是基因组相关研究）的纯净卵母细胞样本变得困难。该方法相较于机械法及以往的检测方法具有多项优势。首先，改进后的检测缓冲液更为温和，有助于在分离卵母细胞和颗粒细胞的同时，最大限度地减少对这些细胞的损伤。

此外，该方法使我们能够获得大量纯净的I期卵母细胞。我们希望这项研究能帮助科研人员更深入地观察鱼类卵母细胞的细节及其发育过程，包括表观遗传学和基因组结构等方面。该方法同样适用于塘鳢，我们相信它还可被应用于多种不同鱼类的研究。

首先，将一条已处死的雌性斑马鱼放在桌面上。用吸水纸吸去鱼体表面多余的水分。使用一对显微剪，在鳃盖后缘处剪去鱼头，然后连同泄殖腔一起剪去尾部。

将中段躯干转移至含有2毫升L-15培养基的35毫米培养皿中。接着剪开腹部中轴，去除内脏和 swim bladder（鱼鳔）。用一对镊子从腹部剥离两侧的卵巢。

去除附着在卵巢上的脂肪组织、鳞片及其他身体组织。首先，将切除的斑马鱼卵巢转移至含有两毫升细胞解离液的六孔板中。在28.5°C条件下孵育卵巢2至3小时。

加入 2 至 3 毫升预热的 L-15 培养基至缓冲液中，以终止消化。接着，将一个 70 微米的细胞筛置于六孔板的另一个孔中。向孔内加入 L-15 培养基，确保培养基液面高于细胞筛。

现在，使用移液器将消化液通过细胞滤筛。用移液器吸除多余的消化液。向孔中加入 4 mL 新鲜的 L-15 培养基，并轻轻重悬卵母细胞。

几分钟后，用移液器吸出上清液。为进行质量控制，将卵母细胞转移至含有新鲜L-15培养基的35毫米培养皿中。使用10倍或更高倍数的光学显微镜观察卵母细胞。

使用钝头注射工具去除所有细胞碎片、一期卵母细胞或任何其他时期的卵母细胞。为确认卵母细胞的发育阶段，将Hoechst 33342加入含有卵母细胞的L-15培养基中并进行孵育。在紫外激光激发下，使用荧光显微镜观察卵母细胞。

用针仔细挑出不符合预期标准的卵母细胞。幼年卵巢显示出大量透明的一期卵母细胞，同时伴有较少数量的二期卵母细胞。成年鱼类的卵巢则以不透明的晚期二期至三期卵母细胞为主。

参照方法导致卵母细胞表面出现大量被染色的颗粒细胞核，紧密包裹着卵母细胞。相比之下，改良方法能够分离出第一阶段的卵母细胞，且无颗粒细胞核染色。