Name: 通过腰椎池注射在幼年大鼠中鞘内载体给药 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 38 s
Description: 了解通过腰椎池注射在幼年大鼠中进行鞘内AAV9载体给药的手术方法。该技术用于评估基因治疗在中枢神经系统疾病中的疗效，为儿科遗传病研究提供重要模型。

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作者谨此感谢德克萨斯大学西南医学中心的 Steven Gray、Matthew Rioux、Nanda Regmi 和 Lacey Stearman 就幼年大鼠在鞘内注射操作中所带来挑战的富有成效的讨论。本研究部分得到了 Jaguar Gene Therapy 公司资助（资助对象：JLFK）。

本研究经埃默里大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。本研究采用斯普拉格-道利大鼠（年龄28-30天，体重约90-135 g，雄性和雌性）。
1. 载体的制备
<ol>
	<li>在实验开始时，将AAV9载体（参见材料表）置于冰上解冻。</li>
	<li>将含有载体的微量离心管在台式离心机中短暂离心，以确保所有液体均位于管底。</li>
	<li>轻轻弹击微量离心管，确保溶液充分混匀。</li>
</ol>
2. 恢复笼的制备
<ol>
	<li>将一个干净的笼子放在电热毯上（参见材料表），使笼子仅有一半与电热毯接触。</li>
	<li>将电热毯的温度设置为约37 °C。</li>
</ol>
3. 手术平台的准备
<ol>
	<li>将等温垫（见材料表）在微波炉或水浴中加热至 39 °C，使其内容物变为液态。</li>
	<li>将等温垫放置在手术平台上，并用干净的吸水实验台垫覆盖。</li>
</ol>
4. 动物准备
<ol>
	<li>使用异氟烷在透明箱中对大鼠进行麻醉（遵循机构批准的方案）。麻醉诱导开始时使用5%异氟烷，随后每分钟降低1%，直至达到2%。维持动物在2%浓度下额外3分钟。</li>
	<li>将装有动物的箱子移至通风橱并打开箱盖。 
	注意：此举可限制外科医生接触麻醉气体。</li>
	<li>使用电动剪毛器去除动物背部的毛发。 
	注意：也可选用脱毛膏或手动剃刀配合剃须膏进行脱毛。</li>
	<li>将动物放置于手术台上，使其鼻部进入麻醉鼻罩。 
	注意：在手术区域去毛过程中，动物可能开始恢复意识。若发生此情况，应按照上述方法重新麻醉。</li>
	<li>为每只眼睛涂抹润滑性眼膏，以防止手术期间角膜干燥。</li>
	<li>使用聚维酮碘和异丙醇擦拭巾交替消毒手术区域，共进行三次。</li>
	<li>皮下注射镇痛药。 
	注意：通常使用丁丙诺啡，剂量为0.01–0.05&#160;mg/kg，每12小时给药一次。 alternatively，可单次给予缓释型丁丙诺啡1 mg/kg，以提供长达72小时的有效镇痛。有关疼痛管理的具体指南，请咨询所在机构的IACUC。</li>
	<li>在L2至L6棘突上方皮下注射100 µL的1%利多卡因，以实现局部麻醉。</li>
	<li>在动物髋部前方稍靠头侧位置放置一卷纸巾或直径为1.5 cm的管状物。这有助于脊柱屈曲，便于将针头插入两个椎板之间。</li>
	<li>将带开窗的手术巾（见材料表）覆盖于动物体表，使开窗部位对准腰椎区域。</li>
</ol>
5. 暴露腰椎
<ol>
	<li>通过捏压动物的每只爪子，观察是否无回缩反应，以确认麻醉深度。</li>
	<li>使用#11手术刀片，从L2至L6沿中线在皮肤上做一个约3 cm长的切口。</li>
	<li>将无菌弯头手术剪插入肌肉与皮肤之间，然后张开剪刀尖端，以分离皮肤与肌肉。</li>
	<li>去除覆盖L2-L5棘突的筋膜。</li>
</ol>
6. 注射器的装载
<ol>
	<li>将25–35 µL载体（以达到所需剂量）移液至无菌微量离心管的管盖中。</li>
	<li>用胰岛素注射器吸取全部液体。 
	注意：此过程中务必避免吸入空气。</li>
</ol>
7. 进行注射
<ol>
	<li>确定L5和L4棘突的位置。 
	注意：L6位于两侧髂嵴连线的正中央，其棘突可通过钝性器械探查而易于识别。随后可将器械沿背部轻柔向上滑动，以确定L5和L4棘突的边界。</li>
	<li>将一只手放置妥当，使拇指轻轻置于动物的尾巴和一条后肢上。用另一手指固定注射器。</li>
	<li>将注射器针头置于L5棘突左侧，对准其尾端。注射器应与身体正中线呈约30°角，并与实验台平面呈约30°向上倾斜。 
	注意：可借助手术显微镜以更清晰地识别解剖标志，并准确定位针尖位置。</li>
	<li>向前推进针头约8 mm，越过L5椎板上方，继而穿过L4椎板下方进入腰池，直至触及骨质。正确穿刺时，可观察到或通过置于后肢/尾巴上的拇指感知到后肢和/或尾巴的短暂抽动。若未出现抽动，应退出针头并尝试从左侧重新穿刺。若仍无抽动，可根据需要在L4/L3或L3/L2间隙重复操作。</li>
	<li>缓慢推动活塞，持续约5秒。 
	注意：注射过程中可能出现后肢或尾巴的抽动。</li>
	<li>在完全推注完毕后，保持注射器位置不动约30秒，以使压力达到平衡，从而在拔出针头时尽量减少注入物的反流。</li>
	<li>缓慢拔出针头。</li>
</ol>
8. 切口的闭合
<ol>
	<li>对切口边缘进行对合。</li>
	<li>从伤口的一端开始，使用4-0缝线（参见材料表）或外科缝钉闭合切口。</li>
</ol>
9. 恢复与监测
<ol>
	<li>将动物放入预热的笼子中。</li>
	<li>至少每15分钟检查一次动物，直至其完全恢复自主活动能力。 
	注意：此过程通常需要15至45分钟。</li>
	<li>术后接下来的三天内，每天至少进行一次健康状况检查。术后前两天给予镇痛药物，或根据机构动物护理与使用委员会（IACUC）的要求给予镇痛剂。</li>
	<li>术后一周，拆除缝线或钉合夹。</li>
</ol>
10. 随访程序
注意：为了确定注射技术的准确性，按照上述方法注射台盼蓝染料，然后立即处死动物（遵循机构批准的方案），并进行椎板切除术以观察结果。
<ol>
	<li>在动物仍处于麻醉状态时，通过注射致死剂量的戊巴比妥将其安乐死 通过 腹腔注射，剂量为150 mg/kg。</li>
	<li>呼吸和心脏活动停止后，打开胸腔以确认死亡。&#160;将手术切口从背部向上延伸至颈部。</li>
	<li>在棘突两侧的肌肉上，沿脊柱方向平行切开长约4 cm的切口，尽量靠近棘突。</li>
	<li>使用精细镊子或剪刀，去除棘突之间的肌肉组织。</li>
	<li>使用咬骨钳从L6向上至下胸段脊柱去除棘突（参见 材料表避免扭转操作，以免损坏咬骨钳。</li>
	<li>将咬骨钳的尖端插入L5椎板下方，通过分次操作去除覆盖脊髓的骨质 &#34;咬伤&#34; 从中取出。 
	注意：向后牵拉L6棘突可便于咬骨钳尖端的插入，但必须小心操作以避免损伤脊髓。</li>
	<li>继续向头侧扩大椎板切除范围，至少四个椎板。检查椎板内表面是否有染料痕迹，如有则提示注射失败。</li>
</ol>

Lumbar Puncture Delivery of AAV9 in Juvenile Rats for CNS Gene Therapy

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</ol>

Donsante 博士是关于 AAV9 载体脑脊液给药的一项待批准专利的发明人。

中枢神经系统（CNS）会受到多种疾病的影响。对于那些具有隐性单基因性质的疾病，例如脊髓性肌萎缩症，通过病毒载体递送功能正常的基因拷贝是一种具有吸引力的治疗策略。然而，血脑屏障（BBB）会阻止大多数经静脉给予的基因治疗载体进入脑组织11。即使某些载体能够穿越血脑屏障，例如AAV9，也必须使用高剂量给药，以弥补因外周组织转导造成的载体损失12。年龄也是一个限制因素。随着年龄增长，人体对各种AAV血清型的环境暴露增加13，常常导致产生可中和治疗性载体的抗体14。因此，针对中枢神经系统疾病的基因治疗载体经静脉递送通常仅限于婴儿，而不用于成年后确诊的患者。
对于老年患者，将载体直接注射到脑脊液中可实现中枢神经系统的广泛转导，从而避开血脑屏障和已存在的抗AAV抗体15由于该方法具有靶向性，因此也可使用较低的载体剂量。在临床应用中主要有两种途径：（1）腰椎穿刺和（2）侧脑室注射。后者风险较高，但通常可实现更广泛的脑部转导。腰椎穿刺更为安全，但转导主要偏向脊髓。通过将患者置于头低脚高位（Trendelenburg位）可能增强脑部转导效果，但相关研究数据尚不一致。16,17使用导管到达小脑延髓池 通过 腰椎穿刺在临床上可能提供更优的选择，但其应用仍处于早期阶段5可能存在其他将动物模型中建立的方法转化到临床应用的挑战，例如由于脑脊液泄漏导致的载体丢失18 背根神经节中的毒性和毒性反应19. 
大多数针对中枢神经系统的疗法研究在啮齿类动物中进行时，通常使用新生期或成年动物（&gt;60日龄）。新生动物具有体型小的优势，可实现较高的有效剂量，且其免疫系统尚未发育成熟，可避免对治疗剂产生免疫反应带来的干扰。然而，从脑发育角度来看，新生小鼠或大鼠更接近人类的胎儿阶段。对于旨在用于5至10岁儿童的疗法，幼年大鼠（25至35日龄）在神经发育方面是更合适的模型20。由于此前尚未建立针对幼年大鼠的鞘内注射方法，而已有的成年小鼠和大鼠注射技术在该年龄段大鼠中均被证明无效，因此开发了上述操作方法。需要明确的是，幼年大鼠不仅体型小于成年大鼠，其保护脊髓的硬脊膜弹性也可能存在差异，这可能导致适用于成年大鼠穿刺该组织层的技术在幼年大鼠中失效。
在学习如何对幼年大鼠进行鞘内注射时，必须使用染料（如台盼蓝）作为治疗药物的替代物，且在开始使用治疗药物进行研究之前，操作者应充分确信自己能够成功且可重复地完成该操作。熟练掌握该技术需要通过练习积累经验，以体会进针角度准确与偏离目标时注射器手感的差异。常见的错误有两种：如果进针角度过浅，针头会触碰到椎板顶部或前方椎板的背面，此时不会出现抽动反应，且针头推进的距离会比8 mm短几毫米；如果进针角度过大，则针头可能穿过两个椎板之间的间隙进入腹腔。此时，针头推进的距离会明显超过8 mm。一旦发生这种情况，应立即退出针头，重新调整位置后再次尝试。在少数发生此类情况的实例中，针头在撤回和重新定位前短暂地进入腹腔几毫米，并未对动物造成任何明显的持久性伤害。
研究发现，观察针头置入后是否产生生理反应对于确保该操作的可重复性和高成功率至关重要。当未观察到反应时，注射的成功率较低。然而，在某些情况下，需要在多个位点进行尝试才能获得反应，并且在一个或多个先前的针道中观察到微量染料。硬膜外腔内未观察到染料，提示部分先前的穿刺可能已穿透硬膜，但并未引起尾巴或腿部的抽动。由于回流极少（与注射时在针道中观察到的情况相似），因此认为在这些情况下，先前的穿刺对药物递送效率的影响可忽略不计。
一旦掌握了递送技术，可能会遇到第二个非手术相关的挑战。具体而言，在成年大鼠（约70日龄）中，即使由同一病毒载体核心实验室制备，AAV9载体通过鞘内递送至脊髓和脑组织的效率在不同批次之间也可能存在显著差异。某些批次表现符合预期，可在整个脊髓灰质中实现有效转导；而另一些批次则无法有效穿透灰质，主要转导背根神经节。10造成这种差异的原因尚不明确，因为这些载体具有很强的效力 体外 当直接注射到脊髓时，建议在开始大规模研究之前，使用任何新批次的病毒对3-4只动物进行预试验，以确认该批次病毒的表现符合预期。可通过免疫组织化学或免疫荧光染色检测目的蛋白的表达，或采用定量PCR（qPCR）或数字滴定PCR（ddPCR）定量检测转基因mRNA或载体基因组的数量来评估病毒的效价。21除了区分病毒批次的未知变量外，动物年龄、注射体积、给药速度和载体浓度的微小差异也可能导致实验结果的变异。在开展大规模研究之前，可能需要针对每种病毒或其他候选治疗剂对这些因素进行优化。
经过训练后，经验丰富的外科医生可在约30分钟内完成幼年大鼠的鞘内注射手术，从麻醉诱导到开始恢复期。这使得可在短时间内处理大量动物。术后恢复也很快，大多数动物在20至30分钟内即可正常行走。在完成超过200例此类手术后，未发现该操作引起任何不良反应。
最后，在手术过程中尽量减少动物痛苦并确保动物福利是至关重要的考虑因素。因此，必须正确使用麻醉剂和镇痛剂，并在手术过程中以及动物完全从麻醉中恢复之前维持其体温。不同机构的相关监管机构和兽医人员可能对这些事项有不同的要求和建议。本方案中所述麻醉剂和镇痛剂的使用是在咨询埃默里大学（Emory University）兽医及实验动物护理与使用委员会（IACUC）工作人员后制定的。研究人员应与其所在机构的本地兽医和实验动物护理与使用委员会密切合作，以满足相应要求。
该操作步骤存在一定的局限性。本文所述方法是为幼年大鼠设计的，而人类与大鼠在结构及其他诸多方面存在显著差异，这可能会限制该操作在人类中的应用。在幼年大鼠中实现腰椎鞘内注射治疗药物的目的，是为了促进利用幼年大鼠模型来评估候选治疗药物的有效性——即使在患者中应用时可能需要调整具体的给药方式。

近年来，随着美国食品药品监督管理局（FDA）批准了针对脊髓性肌萎缩症、视网膜营养不良、凝血因子IX缺乏性血友病、癌症等多种疾病的病毒介导基因疗法，基因治疗的前景终于得以实现1,2,3,4。目前还有 countless 其他疗法正处于研发阶段。基因治疗旨在将治疗性基因递送至患者的细胞中，该新基因的表达产物可弥补内源性缺陷基因所缺失的功能、抑制有毒基因的表达、杀死癌细胞，或提供其他有益的生物学功能。
对于影响中枢神经系统（CNS）的疾病，通常希望将基因治疗载体直接递送至靶组织。非全身性给药方法具有两个优势：一是可最大限度减少因外周转导引起的脱靶副作用，二是可显著减少在靶组织中实现足够转导水平所需的载体用量5。
向中枢神经系统（CNS）递送基因治疗载体有多种方法。实质内注射是指将载体直接注射到脊髓或脑组织中，可用于向特定区域递送。然而，对于许多疾病而言，需要实现中枢神经系统的广泛转导。这可以通过将载体递送至脑脊液（CSF）5来实现，脑脊液是流经并环绕脑和脊髓的液体。将载体递送至脑脊液主要有三种方式。侵入性最强的方法是脑室内注射，需在颅骨上钻孔，并将针头穿过脑组织进入侧脑室，可在全脑实现转导。然而，该操作可能导致颅内出血，且通常在脊髓中的转导范围有限6。向颅底的大脑池（cisterna magna）注射侵入性较小，但存在损伤脑干的风险。尽管该方法常用于动物研究5，但在临床实践中已不再常规使用7。腰椎穿刺是侵入性最小的脑脊液接触方式，操作时将针头插入两个腰椎椎体之间的腰池。
腰椎穿刺用于载体递送在成年大鼠和小鼠以及新生小鼠中常规进行8,9。本研究的作者近期在幼年大鼠（28–30日龄）中实施了腰椎穿刺以递送9型腺相关病毒血清型（AAV9）载体。在成年大鼠中，使用新生儿腰椎穿刺针垂直插入L3与L4椎体之间9。正确置针的标志是出现尾部抽动以及脑脊液流入针头储液腔。然而，在幼年大鼠中，这两种可观察指标均无法实现。随后，作者尝试采用成年小鼠的操作方法，使用27 G胰岛素注射器以一定角度插入L5与L6之间10。在体型通常小于P28大鼠的成年小鼠中，该操作不会引起尾部抽动，但针头位置错误可通过注射液回流而被察觉。然而在幼年大鼠中，该方法始终导致注射液被递送至硬膜外腔，这可能源于成年小鼠与幼年大鼠在脊髓周围组织层弹性上的差异。随后评估了导管递送方法。具体而言，通过腰池硬膜上的切口插入导管，并将其上行至胸段脊髓中部；然而，该方法在递送过程中导致大量注射液从切口部位反流。尝试使用引导针经皮将导管置入蛛网膜下腔也未成功。由于椎板间隙较窄，导管很可能撞击头端椎板而无法继续前进。
此处描述了一种实现成功且可重复溶液递送的方法 通过 在幼年大鼠中进行腰椎穿刺。该方法可用于病毒载体，也可能适用于细胞、药物及其他治疗剂。

<table><tbody><tr><td>200 &amp;micro;L 过滤吸头</td><td>MidSci</td><td>PR-200RK-FL</td><td>病毒移液</td></tr><tr><td>AAV9-GFP</td><td>Vector Builder</td><td>P200624-1005ynr</td><td>表达 GFP 的 AAV9 载体</td></tr><tr><td>带针可吸收缝线，涂覆 Vicryl 聚乳酸-羟基乙酸共聚物 910，FS-2，3/8 圆弧反向切割针，4-0 编织线</td><td>McKesson</td><td>J422H</td><td>缝合线</td></tr><tr><td>实验台垫</td><td>VWR</td><td>56616-031</td><td>手术</td></tr><tr><td>Braintree Scientific 恒温垫，8'' x 8''</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-195-4664</td><td>维持体温</td></tr><tr><td>布托啡诺</td><td>McKesson</td><td>1013922</td><td>镇痛剂</td></tr><tr><td>缓释布托啡诺（1 mg/mL）</td><td>Zoopharma</td><td></td><td>长效镇痛剂</td></tr><tr><td>棉签</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-365-409</td><td>清除血液</td></tr><tr><td>手术洞巾，小鼠用，透明塑料，12&quot; x 12&quot;，带粘性开窗</td><td>Steris</td><td>1212CPSTF</td><td>手术洞巾</td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>镊子</td></tr><tr><td>电热毯</td><td>CVS Health</td><td></td><td>CVS Health 系列 500 加长型加热垫</td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 单通道可调移液器，20&amp;ndash;200 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td>病毒移液</td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14059-11</td><td>弯头手术剪</td></tr><tr><td>Friedman-Pearson 咬骨钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>16121-14</td><td>椎板切除术</td></tr><tr><td>Halsey 持针器</td><td>Fine Science Tools</td><td>12001-13</td><td>持针钳</td></tr><tr><td>胰岛素注射器，超细针头，12.7 mm x 30 G，3/10 mL/cc</td><td>BD</td><td>328431</td><td>注射器</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>McKesson</td><td>803250</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>异丙醇擦拭巾</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-031-350</td><td>皮肤消毒</td></tr><tr><td>利多卡因，1%</td><td>McKesson</td><td>239935</td><td>局部麻醉</td></tr><tr><td>微量离心管：1.5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-137</td><td>注射器装液</td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-118-0481</td><td>皮肤消毒</td></tr><tr><td>手术刀柄 - #4</td><td>Fine Science Tools</td><td>10004-13</td><td>手术刀片夹持器</td></tr><tr><td>Sure-Seal 吸入麻醉诱导室</td><td>Braintree Scientific</td><td>EZ-17</td><td>麻醉箱</td></tr><tr><td>手术刀片 Miltex 碳钢，No. 11，无菌一次性独立包装</td><td>McKesson</td><td>4-111</td><td>#11 手术刀片</td></tr><tr><td>SYSTANE NIGHTTIME 眼膏</td><td>Alcon</td><td></td><td>眼膏</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>VWR</td><td>97063-702</td><td>注射</td></tr></tbody></table>

通过腰池注射在幼年大鼠中进行鞘内载体递送

Intrathecal Vector Delivery in Juvenile Rats via Lumbar Cistern Injection

基因治疗是一种强大的技术，可通过向患者体内递送新基因来治疗疾病，无论是引入功能性基因、失活毒性基因，还是提供一种其产物可调节疾病生物学过程的基因。治疗性载体的递送方式有多种，从用于全身递送的静脉输注，到直接注射至靶组织。对于神经退行性疾病，通常希望将转导偏向大脑和/或脊髓。靶向整个中枢神经系统的侵入性最小的方法是将药物注射至脑脊液（CSF）中，从而使治疗剂能够到达中枢神经系统的大部分区域。将载体递送至脑脊液中最安全的方法是腰椎鞘内注射，即通过穿刺针进入脊髓的腰池。该技术也称为腰椎穿刺，在新生期和成年啮齿类动物以及大型动物模型中已得到广泛应用。尽管该技术在不同物种和发育阶段之间具有相似性，但围绕鞘内腔的组织在大小、结构和弹性方面的细微差异，要求在操作方法上做出相应调整。本文介绍了一种在幼年大鼠中进行腰椎穿刺以递送腺相关病毒血清型9载体的方法。在此过程中，将25–35 µL的载体注入腰池，并使用绿色荧光蛋白（GFP）报告基因评估每次注射所产生的转导分布情况。文中还讨论了该方法的优势与挑战。

为了评估注射技术的准确性，使用染料台盼蓝作为治疗药物的替代物。该染料可快速与蛋白质结合，因此通常保留在其被注射入的结构内。这意味着染料可能无法准确预测治疗药物在注射后的实际分布情况；它仅用于显示注射是否准确。当成功注入腰池时，台盼蓝会结合硬脊膜，使脊髓周围区域呈现蓝色。然而，若穿刺针未能穿透硬脊膜，染料则会停留在硬膜外腔。此时，硬脊膜以及周围组织（骨表面、连接椎板的韧带和肌肉）均会被染成蓝色。这些染色模式肉眼即可清晰辨别。
如果仅对脊髓和脊柱进行横向切割，很难评估注射操作是否正确。相反，建议使用咬骨钳从L5椎板开始，向头侧方向进行椎板切除术。在此过程中必须注意不要损伤硬脑膜。使用解剖显微镜可使该过程更为简便。图1提供了成功注射与部分成功注射的对比示例。成功注射时，在拔出针头后，针道内几乎没有或完全没有染料回流现象。成功注射后，去除椎板以暴露脊髓，可见脊髓内部含有台盼蓝，但骨表面无染料分布（图1A）。此外，在成功注射后，脑干和小脑上也可观察到染料（图1B）。相比之下，部分成功注射的特征是在注射过程中染料沿针道明显回流，和/或在骨表面可见染料痕迹（图1C）。
采用上述步骤，将28 µL表达增强型绿色荧光蛋白（GFP）的AAV9载体以3 × 1013 病毒基因组/mL的浓度注射，每只动物总剂量为8.4 × 1011 病毒基因组。四周后，动物被处死，并用4%多聚甲醛灌注10。随后取出脑和脊髓组织，并制备成冷冻切片。获取厚度为40 µm的切片，并对GFP进行染色。图2展示了该载体所获得的转导模式示例。转导效率在脊髓中通常最高，尤其是在腰段区域（图2A-C），这可能是由于其靠近注射部位所致。脑组织也实现了转导（图2D-F），但如预期所示，其转导范围较脊髓更为有限。
为说明单名经验丰富的外科医生使用同一批次病毒所获得结果的可重复性，本研究中15只大鼠的小脑和大脑皮层染色切片分别如图3和图4所示。其中7只大鼠的颈段脊髓染色切片也一并展示（图5）。当然，不同剂量、病毒载体批次及不同外科医生操作时，脑部转导效率可能会表现出更大的变异性10。
<img alt="术后组织样本的组织学检查，突出显示血管和组织结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66463/66463fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：染料注射后脊髓的暴露情况。 在注射台盼蓝后进行椎板切除术。(A) 在正确注射的情况下，脊髓被染成蓝色，且在椎板切除过程中移除的骨组织表面未见染料（箭头所示）。(B) 染料也可在脑干周围观察到。( C) 当注射过程中发生明显反流时，脊髓内部染料较少，而骨表面可见染料沉积（箭头所示）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66463/66463fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜图像中脑和脊髓的组织学分析；灰质染色模式。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66463/66463fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：鞘内给予 AAV9-GFP 后实现的转导模式示例。 分别对（A）颈段、（B）胸段和（C）腰段脊髓的 40 µm 厚切片进行 GFP 免疫组织化学染色（黑色染色）。在所有节段均观察到高水平的灰质转导。（D）相比之下，脑组织的整体转导程度较稀疏。左侧和右侧方框区域分别在（E）和（F）中放大显示。（E）大部分染色信号位于小脑，主要在浦肯野神经元中（箭头所示）。（F）大脑皮层中的神经元（箭头）和星形胶质细胞（箭头头所示）均被转导。比例尺：（A-C）325 µm；（D）5 mm；以及（E,F）200 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66463/66463fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="脑组织学显微镜图像，显示用于神经解剖学研究的冠状切面。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66463/66463fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：小脑中转导的可重复性。 同一外科医生使用相同剂量和批次的病毒注射15只大鼠后，小脑转导效果的可重复性。比例尺：1 mm。图像中的数字表示大鼠编号（“窝别”“个体”）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66463/66463fig03largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="GFP 皮层染色，注射后4周，显微图像，实验结果，神经组织研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66463/66463fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：皮层转导的可重复性。 同一外科医生使用相同剂量和批次的病毒对15只大鼠进行注射后，皮层转导的可重复性结果。比例尺：500 µm。图像中的数字表示大鼠编号（“ litter”。“individual”）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66463/66463fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="GFP 染色过程，颈椎图像，鞘内注射后 4 周，科学结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66463/66463fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图 5：颈段脊髓中转导的可重复性。 同一外科医生使用相同剂量和批次的病毒对 7 只大鼠进行注射后，颈段脊髓中转导效果的可重复性。比例尺：500 µm。图像中的数字表示大鼠的编号（“窝别”“个体”）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66463/66463fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文描述了一种对幼年大鼠腰池进行注射的外科手术方法。该方法已用于基因治疗载体的鞘内递送，但预计也可适用于多种其他治疗剂，包括细胞和药物。

基因治疗是一种强大的技术，可通过向患者递送新基因来治疗疾病，无论是引入功能性基因、失活特定基因……

我们的研究重点是开发针对影响中枢神经系统疾病的基因疗法。截至2023年12月，美国食品药品监督管理局（FDA）已批准基于腺相关病毒（AAV）的基因疗法用于治疗少数几种遗传性疾病，包括脊髓性肌萎缩症、莱伯先天性黑蒙症、杜氏肌营养不良症以及血友病A和B。目前还有更多疗法正处于临床前和临床试验研究阶段。要制定安全有效的遗传病干预措施，需要综合运用多种方法，从对患者的细致自然病史研究，到在细胞培养和动物模型中开展的临床前工作；而基因疗法实际上只是用于此目的的多种技术之一。许多基因治疗实验使用新生期或成年动物。尽管儿童患者是遗传性疾病的重要群体，但很少有研究评估针对青少年的治疗方法。因此，对于年龄较大的儿童，体型和免疫系统为基因治疗的静脉递送带来了显著障碍。鞘内给药可能克服这一限制，但我们需要合适的模型来验证这一假设。我们开发的这一操作步骤将使我们能够在幼年大鼠中评估该方法的有效性。首先，取含有 AAV9 载体的试管。使用台式离心机，短暂离心试管。然后轻轻弹击试管，确保溶液充分混匀。接下来，在电热毯上放置一个洁净的笼子，并将电热毯的温度调节至约 37 摄氏度。使用微波炉或水浴，将等温垫加热至 239 摄氏度。然后将该垫子放置在手术平台上，并用干净的吸水实验台垫覆盖。首先将麻醉后的动物置于手术平台上。为每只动物的眼睛涂抹润滑性眼膏，以防止手术过程中角膜干燥。使用聚维酮碘和异丙醇交替擦拭剃毛的手术区域，共进行三轮消毒。然后在动物髋部前方稍靠前的位置下方放置一卷纸巾或直径为1.5 cm的管状物。用带窗孔的手术巾覆盖动物，将窗孔对准腰椎部位以暴露手术区域。通过夹捏每只足掌并观察是否无回缩反应，来确认动物的麻醉深度。随后，使用11号手术刀片，从L2至L6椎骨沿正中线做一条3 cm长的皮肤切口。现在将一把无菌的弯头手术剪插入肌肉与皮肤之间，轻轻张开剪尖，以分离皮肤与下方的肌肉。去除覆盖在L2至L5椎骨棘突上的筋膜。用移液器吸取25至35 µL的AAV9载体，滴入无菌微量离心管的管盖中。用胰岛素注射器从瓶盖中吸取全部载体体积。然后确定动物的L5和L4棘突。将注射器针头置于L5棘突左侧，使其与该棘突的尾端对齐。将注射器针头向前推进约8 mm，越过L5椎板，然后在L4椎板下方进入腰池，直至接触到骨性结构。缓慢按压注射器活塞约五秒钟。随后缓慢从穿刺部位撤出针头。使用4-0缝线或外科缝合钉，从伤口一端开始关闭切口。为了评估染料注射的效果，在处死动物后，于棘突两侧平行于脊柱方向在肌肉上做一条4 cm长的切口。用精细镊子或剪刀小心地去除棘突之间的肌肉组织。使用咬骨钳，从L6至下胸椎段椎板切除棘突。将咬骨钳的下端尖部插入L5椎板下方，通过分次咬除，系统性地去除覆盖脊髓的骨质。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

通过腰椎池注射在幼年大鼠中鞘内载体给药

来源：Smit, R. D., et al．利用脑部与脊柱联合手术通过双病毒载体靶向新生大鼠皮质脊髓束．J. Vis. Exp.

向新生大鼠皮质脊髓神经元靶向递送病毒以研究脊髓损伤

来源：Chen, Y., et al．大鼠中枢神经系统中反义寡核苷酸的鞘内递送．J. Vis. Exp.

向大鼠中枢神经系统鞘内递送测试化合物

来源：Keefe, K. M., 等．慢病毒载体直接注射揭示大鼠脊髓中的多条运动通路．J. Vis.

向大鼠脊髓注射病毒载体以进行逆行神经元示踪

来源：Li, D., et al. 成年小鼠中重组腺相关病毒的直接鞘内注射. J. Vis. Exp.

在小鼠模型中通过鞘内递送病毒治疗中枢神经系统疾病

本报告介绍了一种简单快速的鞘内穿刺技术，可在短暂轻度麻醉条件下对小鼠腰段脊髓进行局部siRNA转染。...

在体 内 脊髓中的siRNA转染与基因敲低 通过 小鼠快速无创腰椎鞘内注射

本文介绍了一种使用含1%盐酸利多卡因的病毒溶液进行直接鞘内注射的技术，以确保腺相关病毒高效递送至小型动物，并建立了一种评分系统，可根据利多卡因引起的短暂性肌力减弱程度来预测中枢神经系统中的转导效率。...

成年小鼠脑脊液内直接注射重组腺相关病毒

本方案演示了将一种可逆向运输的病毒载体注射到大鼠脊髓组织中的操作。该载体在突触处被摄取，并逆向运输至靶神经元的胞体。此模型适用于重要脊髓通路的逆向示踪，或用于基因治疗应用中对特定细胞的靶向递送。...

直接注射慢病毒载体突出显示大鼠脊髓中的多条运动通路

本文介绍了一种通过将导管植入大鼠脊柱腰段鞘内空间，向其中枢神经系统递送药物的方法。我们重点阐述反义寡核苷酸的递送，但该方法同样适用于其他治疗方式的给药。...

大鼠中枢神经系统中反义寡核苷酸的鞘内递送

本方案展示了一种新方法，通过向新生大鼠出生后5至10天的体躯运动皮层注射顺向化学遗传修饰剂，并向颈段脊髓注射可逆向运输的Cre重组酶，实现对特定细胞亚群的基因治疗。...

使用双病毒载体通过联合脑部与脊柱手术靶向新生大鼠皮质脊髓束

本文介绍了一种改良的大鼠鞘内导管置入方法，该方法操作简便、使用方便，是一种可靠的重复性鞘内给药途径。...

一种改良的大鼠鞘内导管置入方法

腰椎鞘内注射是一种具有转化相关性的给药途径，可用于将基因治疗递送至中枢神经系统。本标准化操作方案全面涵盖了新生期、幼年期及成年小鼠和大鼠的腰椎鞘内注射技术，旨在指导研究人员在临床前基因治疗研究中采用该技术。...

小鼠和大鼠中枢神经系统靶向基因治疗载体的腰椎鞘内注射

了解通过腰椎池注射在幼年大鼠中进行鞘内AAV9载体给药的手术方法。该技术用于评估基因治疗在中枢神经系统疾病中的疗效，为儿科遗传病研究提供重要模型。

通过腰池注射在幼年大鼠中进行鞘内载体递送

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