Name: 卵巢癌类器官的生物样本库策略:解决跨组织学亚型和疾病阶段的患者间异质性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 了解卵巢癌类器官生物样本库的建立方法，涵盖组织处理、接种、培养基调整及免疫荧光染色技术。该方案解决患者间异质性，支持长期扩增与个性化治疗研究。

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本研究由德国癌症研究中心（DKTK）慕尼黑合作站点资助，该站点是德国癌症研究中心（DKFZ）与慕尼黑大学医学中心（LMU Munich）之间的合作项目。本研究还得到了德国癌症援助基金会项目（#70113426 和 #70113433）的支持。组织和类器官的石蜡包埋工作在慕尼黑大学医学院解剖学研究所核心设施完成。共聚焦成像在生物医学中心（BMC）生物成像核心设施完成。作者谨此感谢Simone Hofmann、Maria Fischer、Cornelia Herbst、Sabine Fink和Martina Rahmeh提供的技术协助。

根据慕尼黑大学伦理委员会（17-471）的规定，并遵循现行的欧盟、国家和地方相关法规，收集了卵巢癌手术中的肿瘤组织标本，并建立了患者来源类器官。参与本研究的每位患者均已签署书面知情同意书。处理新鲜组织样本时，需具备生物安全二级（Biosafety Level 2）操作许可及超净工作台。由于组织样本可能存在潜在感染性（因未常规检测相关传染病而无法排除），必须严格遵守机构的生物安全规定，并确保实验操作人员配备充足的个人防护装备。
1. 准备工作
<ol>
	<li>培养基制备
	<ol>
		<li>每周新鲜配制一次二维（2D）和三维（3D）培养基，并于 4 °C 保存。 
		注意：每种培养基各成分的精确组成详见表 1。卵巢癌培养基 1（OCM1）和 OCM2 均可额外添加 HER1ß（终浓度：50 ng/mL），从而形成四种不同条件：OCM1、OCM1+HER1ß、OCM2、OCM2+HER1ß。</li>
		<li>将生长因子试剂配制成储备液，于 20 °C 保存；A83-01 和烟酰胺则配制成储备液后于 +4 °C 保存。由于生长因子对温度敏感，解冻后的储备液应立即用于培养基配制，并通过分装成小份避免反复冻融。 
		注意：培养基配制是关键步骤，必须严格控制。</li>
		<li>RSPO-1 条件培养基的制备
		<ol>
			<li>将 HA-R-Spondin1-Fc 293 T 细胞（储存于 -80 °C）在 37 °C 快速解冻。用 10 mL 基础培养基（含 10% 胎牛血清，FCS），即后续所称的基础培养基++，洗涤细胞。</li>
			<li>将细胞沉淀重悬于 12 mL 基础培养基++ 中，并接种至一个 T75 培养瓶中。</li>
			<li>当细胞达到汇合状态时，使用含胰蛋白酶的消化试剂以 1:6 比例传代（37 °C 下作用 4 分钟），接种至新的 T75 培养瓶中。</li>
			<li>次日，在培养基中加入博来霉素 D1（1.25 µL/mL）。</li>
			<li>当细胞再次达到汇合状态时，以 1:20 比例用胰蛋白酶消化（37 °C 下作用 4 分钟），将细胞接种至多个 T75 培养瓶中（培养瓶数量根据目标终体积确定），每瓶加入 30 mL 含 10% FCS 及博来霉素 D1 的基础培养基++。</li>
			<li>当细胞生长至约 50% 汇合时，开始制备条件培养基：弃去原培养基，更换为 40 mL 含 5% FCS 但不含博来霉素 D1 的基础培养基。</li>
			<li>3 天后收集第一次上清液。为去除碎片，以 1,200 × g 离心 10 分钟。将上清液收集至无菌容器中，于 4 °C 保存。</li>
			<li>向细胞中加入新的含 5% FCS 的基础培养基。3–4 天后收集第二次上清液，同样以 1,200 × g 离心 10 分钟，然后将此次上清液与第一次上清液混合。</li>
			<li>使用 0.2 µm 瓶顶滤器过滤条件培养基。</li>
			<li>为进行质量控制及 RSPO1 定量，将所制备的条件培养基加入 293T 细胞系（293T WntR, 7xTcf-eGFP）14，该细胞系稳定转导了携带 Wnt 报告基因的 GFP 质粒18。 
			注意：根据 GFP 信号的强度和数量，通过检测 Wnt 报告基因细胞系的活性来评估 RSPO1 作为 Wnt 通路激动剂的功能。</li>
			<li>将条件培养基分装为 15 mL 每份，若需在一周内使用，则于 4 °C 保存；若需长期储存（最长 6 个月），则于 -20 °C 保存。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 卵巢癌类器官培养的启动
<ol>
	<li>原代组织分离
	<ol>
		<li>手术后应尽快运输新鲜且具有活性的组织，并在采集后最多20小时内完成分离。确保使用配备约4°C冷袋的运输箱，在组织保存液中进行适当的运输。</li>
		<li>在实验室中，准备必要的试剂和设备以及时处理样本：
		<ol>
			<li>将基底膜提取物II型基质（BME 2基质）置于冰上解冻（约2小时）。</li>
			<li>准备一次性手术刀、灭菌解剖工具（剪刀和镊子）以及用于50 mL离心管的400 µm滤器插件。</li>
			<li>准备一个装有少量液氮的容器用于快速冷冻，并准备一个预热至37°C的水浴锅。 
			注：操作应在细胞培养超净工作台内进行。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在培养皿中用磷酸盐缓冲液（PBS）（不含Ca++和Mg++）彻底清洗新鲜组织。在培养皿内使用一次性手术刀和/或剪刀将组织切成3-5 mm大小的小块。</li>
		<li>将获得的组织分为以下三部分：
		<ol>
			<li>将组织收集至冻存管中，转移至装有液氮的预置容器中进行速冻。</li>
			<li>将组织（2-3 mm）放入装有福尔马林的组织学标本容器中固定（24小时），随后包埋于石蜡中用于染色19,20。</li>
			<li>进一步在酶消化前对组织进行匀浆。使用手术刀最大程度进行机械解离，并转移至50 mL组织管中。 
			注：匀浆过程中必须确保组织始终浸没在PBS中，以防止组织干燥。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将匀浆后的组织与消化液混合，消化液包含PBS（不含Ca++和Mg++）、I型胶原酶（储存液5 U/µL，终浓度1 U/µL）以及选择性ROCK1和ROCK2抑制剂（终浓度3 µM）（组分见表1）。每2 cm3肿瘤组织使用15 mL消化液加入50 mL离心管中。 
		注：对于有限材料（如活检样本），仅需少量消化液（约2-3 mL）即可确保酶解离效果。</li>
		<li>为实现酶解离，将离心管置于37°C水浴中孵育1.5小时。期间间歇性剧烈涡旋震荡（约每20分钟震荡10-15秒），以促进机械解离。</li>
		<li>孵育结束后，向管中加入15 mL冷的基礎培养基++，在300 × g条件下离心5分钟。</li>
		<li>去除上清液后，加入5 mL新鲜的基础培养基++。使用400 µm滤器将细胞悬液过滤至新的50 mL离心管中。</li>
		<li>在300 × g条件下离心5分钟，弃去上清液，保留细胞沉淀。</li>
		<li>为去除红细胞，向细胞沉淀中加入5 mL红细胞裂解（RBC）缓冲液，在37°C水浴中孵育5分钟。</li>
		<li>加入5 mL基础培养基++以终止裂解反应，在300 × g条件下离心5分钟。向细胞沉淀中加入3 mL基础培养基++。</li>
		<li>用台盼蓝染色液按1:1稀释后（例如，10 µL样本 + 10 µL台盼蓝染色液），使用自动细胞计数仪或在Neubauer计数板中手动计数活细胞数量。</li>
		<li>计算直接进行3D接种所需的细胞数。每个肿瘤样本需在48孔板中每种卵巢癌培养基至少接种2-3孔，即共8-12孔（接种基质包括OCM1、OCM1+HER1ß、OCM2、OCM2+HER1ß）。每孔接种30,000个细胞，接种于25 µL BME 2型基质液滴中。可选方案：使用24孔板，每孔加入50 µL BME 2基质和50,000个接种细胞。</li>
		<li>将剩余细胞进行2D培养（见步骤2.1.13）。</li>
		<li>将含有所需总细胞数的基础培养基++悬液转移至新离心管中，在300 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，保留细胞沉淀。</li>
		<li>在冰上向细胞沉淀中加入所需总量的冷BME 2基质（48孔板每孔25 µL，即4孔共100 µL），通过轻柔吹打使细胞均匀分布，避免产生气泡。</li>
		<li>将含细胞的BME 2基质液滴（每孔25 µL）接种至预热的空48孔板中。为确保各孔间细胞分布均匀，在将BME 2基质液滴转移至各孔前，需在管内缓慢轻柔地上下吹打3-4次，防止细胞在分配过程中沉淀。</li>
		<li>将培养板在37°C孵育至少30分钟，使BME 2基质液滴凝固后，向对应孔中各加入250 µL四种卵巢癌培养基（OCM1、OCM1+HER1ß、OCM2、OCM2+HER1ß）。</li>
		<li>在进行直接3D接种的同时，通过启动2D培养保存剩余分离的细胞。
		<ol>
			<li>在300 × g条件下离心5分钟后，将细胞沉淀加入2D培养基中。根据3D接种后剩余细胞数量选择培养容器（T75或T25培养瓶）。</li>
			<li>将培养瓶在37°C孵育3-5天以促进细胞贴壁。前72小时内保持使用相同培养基。</li>
			<li>当细胞达到汇合状态时，将培养物转移至BME 2基质中。不要通过传代扩增原代分离细胞的2D培养，因为长期2D培养会损害其干性潜能。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从2D培养转至3D培养
	<ol>
		<li>在T75或T25培养瓶中，用5 mL PBS洗涤单层细胞两次以使细胞脱离底部表面，随后加入1 mL胰蛋白酶，在37°C孵育10分钟。</li>
		<li>加入5 mL冷的基础培养基++以终止消化试剂作用，在300 × g条件下离心5分钟。</li>
		<li>向细胞沉淀中加入3 mL基础培养基++，按步骤2.1.12-2.1.13所述方法计数细胞，并按照步骤2.1.16-2.1.18所述方法接种至不同培养基组合中（见图1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类器官生长评估
	<ol>
		<li>每周至少对各孔拍照一次以记录类器官生长情况。使用相差显微镜拍摄高质量、可比较的2D/3D培养及直接接种板的图像。注意保持放大倍数的一致性，使用4×获取孔的整体概览（用于定量），使用10×和20×记录类器官形态。</li>
		<li>将图片按不同细胞系分别存储于独立文件夹中。</li>
		<li>通过比较不同接种方式（2D后接3D接种 vs. 直接3D接种）及不同培养基组合（OCM1、OCM1+ HER1ß、OCM2、OCM2+ HER1ß）下的类器官形成情况，筛选最适合长期培养的类器官系。
		<ol>
			<li>通常在分离后14-21天，评估不同条件下类器官形成能力（数量）、大小及细胞表型。观察以下特征：无空泡形成、无膜出泡或黏附丧失、无细胞变圆等现象。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 器官样体的长期培养
<ol>
	<li>类器官传代
	<ol>
		<li>避免在增殖期过于频繁地分割类器官。机械和酶消化操作的间隔应超过10天。</li>
		<li>为解离每个BME 2基质液滴，加入250 µL（48孔板格式）或500 µL（24孔板格式）冰冻的基础培养基++。确保液滴完全溶解，间歇性地用移液器上下吹打，并刮擦培养板底部。将细胞悬液转移至15 mL离心管中并置于冰上。再加入1 mL冰冻的基础培养基++。 
		注意：BME 2基质的去除效率高度依赖于培养基温度，因为低于4 °C时溶解效果最佳。</li>
		<li>合并2–3个技术重复孔以实现均匀扩增。在300 × g条件下离心5分钟。将悬液对着光源检查，观察是否仍可见BME 2凝胶。若仍可见BME 2基质，则弃去上清液，并用冰冻培养基重复洗涤。</li>
		<li>在37 °C水浴中加入1 mL胰蛋白酶（储存于20–25 °C）孵育7–10分钟。间歇性涡旋10秒以增强解离效果。定期肉眼观察试管，判断解离是否正在进行。</li>
		<li>使用23 G至27 G针头的注射器反复抽吸细胞悬液。检查是否仍有大块细胞团存在，必要时重复该步骤。 
		注意：通过注射器进行碎片化处理是可选步骤，针头尺寸取决于所需的&#160;解离效率&#160;。均匀的细胞悬液有助于细胞在各孔中均匀分布。</li>
		<li>加入1 mL冷的基础培养基++以终止反应。</li>
		<li>可选：按照步骤2.1.12–2.1.13所述计数细胞，并确定相对于亲代代次的传代比例（例如1:3孔）。</li>
		<li>在300 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。</li>
		<li>按照步骤2.1.16–2.1.18所述进行接种，并根据已建立的长期培养条件加入相应的最佳卵巢癌类器官培养基。每3–4天更换一次卵巢癌培养基。</li>
		<li>若在换液过程中发生BME 2基质液滴破裂，可考虑在不进行酶消化的情况下重新接种。为避免液滴破裂，换液时应小心操作，避免直接将液体滴加到BME 2基质液滴上。此外，在步骤2.1.16中用BME 2基质稀释前，避免在细胞沉淀中残留过多基础培养基++，否则可能影响液滴的稳定性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类器官的冷冻保存 
	注意：应在传代后第一周的增殖期进行类器官的冷冻保存。
	<ol>
		<li>根据步骤3.1.2使用冰冻的基础培养基++解离BME 2基质液滴。离心并弃去上清液（如步骤3.1.3所述）后，在冰上操作，将细胞沉淀重悬于1 mL冰冻的冷冻保存液中。将细胞悬液转移至预先标记的1.8 mL冻存管中。</li>
		<li>将冻存管放入预冷的含异丙醇的冷冻容器中，并于-80 °C过夜放置。</li>
		<li>冻存管可在-80 °C保存最多2个月。长期稳定保存需转移至液氮中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类器官冻存样本的复苏
	<ol>
		<li>在标记好的15 mL离心管中，将9 mL基础培养基++置于37 °C水浴中预热。</li>
		<li>将所需冻存管从-80 °C或液氮储存处转移至装有液氮的运输容器中。</li>
		<li>将冻存管放入37 °C水浴中，轻轻振荡，直至管壁附近的冷冻物质开始融化。</li>
		<li>缓慢将类器官悬液加入含9 mL培养基的标记管中。轻轻摇动试管。在300 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。</li>
		<li>按照步骤2.1.16–2.1.18所述进行接种，并根据各细胞系已确定的长期培养条件加入相应的最佳卵巢癌类器官培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类器官固定
	<ol>
		<li>按照步骤3.1.2–3.1.3所述收集类器官。</li>
		<li>加入3 mL 4%多聚甲醛（PFA）PBS溶液（pH 7.4），室温孵育1小时。</li>
		<li>用5 mL PBS洗涤两次，每次在300 × g条件下离心3分钟，弃去上清液。向沉淀中加入4 mL新鲜PBS，4 °C保存至包埋。 
		注意：固定后的类器官稳定性良好，可在4 °C保存1个月后再进行包埋。</li>
		<li>将组织学凝胶（储存于-20 °C）在65 °C加热至完全液化。</li>
		<li>观察固定后的类器官是否已沉降至管底并清晰可见。弃去上清液。若细胞沉淀松散，可在300 × g条件下离心3分钟，弃去上清PBS。</li>
		<li>用移液器轻轻吹打，将沉淀重悬于100 µL温热凝胶中。将液滴转移至封口膜上，室温静置约15分钟使其凝固。</li>
		<li>将固定的凝胶块转移至组织包埋盒中。按照标准组织包埋流程19,20进行操作。</li>
		<li>使用切片机切割5–10 µm厚的切片。将切片转移至载玻片上。在65 °C烘干1小时，存放于干燥处。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类器官切片的免疫荧光染色
	<ol>
		<li>将制备好的载玻片依次通过以下梯度溶液：组织学透明剂处理2次，每次15分钟；100%乙醇15分钟；100%乙醇1分钟；96%乙醇10分钟；70%乙醇5分钟；50%乙醇5分钟。</li>
		<li>加入PBS，在100 rpm摇床上孵育5分钟。重复洗涤两次。</li>
		<li>将载玻片置于耐热腔室中，加入&#160;抗原&#160;修复&#160;溶液（Tris(羟甲基)氨基甲烷-乙二胺四乙酸（EDTA）缓冲液[pH 9.0]或柠檬酸盐缓冲液[pH 6.0]）。在蒸锅中加热容器30分钟，随后冷却至室温。</li>
		<li>重复步骤3.5.2。</li>
		<li>将含载玻片的腔室置于1%通透性&#160;洗涤剂溶液（溶于PBS）中15分钟。</li>
		<li>重复步骤3.5.2。</li>
		<li>使用免疫组化蜡笔在载玻片上圈出类器官的位置，以便在后续步骤中保持液滴完整性。</li>
		<li>根据二抗的物种来源，在每张载玻片上加入100 µL含10%血清的稀释液。</li>
		<li>重复步骤3.5.2。</li>
		<li>将一抗用稀释液稀释，最终体积为100 µL。在4 °C孵育至少16小时，置于孵育盘/湿盒中。</li>
		<li>重复步骤3.5.2。</li>
		<li>将二抗用稀释液稀释，形成100 µL液滴，在室温下于孵育盘中孵育2小时。</li>
		<li>重复步骤3.5.2。</li>
		<li>加入DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐）核复染溶液，按1:1,000比例用稀释液稀释。室温孵育10分钟。</li>
		<li>重复步骤3.5.2。</li>
		<li>加入封片剂，盖上盖玻片。待封片剂干燥后（约8–12小时），用透明指甲油密封载玻片。</li>
		<li>使用共聚焦显微镜或其他荧光显微镜成像。拍摄整体图像以及能反映类器官形态主要特征的亚细胞结构细节图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Standardizing Ovarian Cancer Organoid Biobanking

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<li>Leica Biosystems. Leica ASP300S - Advanced smart processor vacuum tissue processor, instructions for use, V 2.1. , Available from: 
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</ol>

M.K. 被列为一项与卵巢癌类器官培养基相关专利的发明人。F.T. 收到来自阿斯利康（AstraZeneca）、Clovis、卫材（Eisai）、ImmunoGen、Medac、默沙东（MSD）、PharmaMar、罗氏（Roche）、SAGA Diagnostics 以及 Tesaro/GSK 的研究资助、顾问委员会酬金、演讲酬金及差旅费用。S.M. 收到来自艾伯维（AbbVie）、阿斯利康（AstraZeneca）、Clovis、卫材（Eisai）、葛兰素史克（GlaxoSmithKline）、Hubro、Medac、默沙东（MSD）、诺华（Novartis）、Nykode、奥林巴斯（Olympus）、PharmaMar、辉瑞（Pfizer）、罗氏（Roche）、Sensor Kinesis、梯瓦（Teva）和 Tesaro 的研究资助、顾问委员会酬金、演讲酬金或差旅费用。

本设计方案解决了既往在卵巢癌类器官生物样本库建立过程中存在的类器官形成及长期传代潜力方面的挑战，确保从大多数实体瘤病灶中成功建立完全可扩增的类器官细胞系。用于类器官建立的肿瘤样本的外科采集过程对后续的得率和扩增潜力具有显著影响。肿瘤组织样本可在多种手术过程中获取，包括多脏器切除术、诊断性腹腔镜检查或活检。经验丰富的妇科肿瘤外科医生应优先从腹膜部位获取纯净的肿瘤样本。值得注意的是，已观察到大体积肿瘤病灶中肉眼可见的坏死区域在类器官培养的成功建立方面适用性较差。由于样本纯度对于在后续应用中准确反映其分子及表型特征至关重要，因此临床团队与实验室团队需协同合作，以实现最佳的生物样本库建设，确保所建立的类器官细胞系来源于肿瘤中最具代表性的区域。
尽管本方案涵盖了我们在为期两年的生物样本库工作中观察到的生长因子依赖性差异，但显然仍需进一步优化以提高效率，因为在20%的病例中我们仍未观察到类器官生长，且部分细胞系表现出有限的扩增潜力，提示干细胞特性的维持尚未达到最佳状态。虽然目前我们的类器官生物样本库仅包含浆液性组织学类型的卵巢癌样本（HGSOC和LGSOC），但在开展系统性生物样本库项目之前，我们对其他上皮性卵巢癌组织学类型样本的经验显示，其建系成功率相似，无明显特异性差异。值得注意的是，大多数上皮性卵巢癌亚型在形态上具有相似的柱状假复层上皮结构，这类结构也见于苗勒管来源的组织（如输卵管、子宫、宫颈）；相比之下，卵巢上皮本身在发育上起源于生殖嵴和中肾，其表面被覆单层立方上皮。由于调控上皮稳态的发育通路在成体干细胞潜能的维持中起核心作用，因此在制定类器官生物样本库培养方案时，应充分考虑其胚胎起源的差异。因此，我们认为卵巢表面的前体细胞可能需要器官特异性的培养条件，才能实现长期稳定的生长。
值得注意的是，在我们实验室中，该方案对于接受过新辅助化疗的卵巢癌样本同样取得了成功，尽管新辅助化疗会影响细胞活力和组织表型。与未经化疗的初次减瘤手术组织样本相比，这些样本含有更多的碎片和细胞外组织聚集体，可能影响类器官的形成潜力。在这些情况下，我们发现适量的手术组织以及严格遵守推荐的运输条件对于成功生成类器官至关重要，因为新辅助治疗后的样本可能更为敏感。
我们反复观察到一种非常有趣的现象：新分离的前体细胞在二维培养中进行短暂扩增后，对后续类器官生长具有促进作用。这一现象已被纳入标准化实验流程，成为癌症类器官研究领域方法学的重要补充，该领域目前在很大程度上依赖于直接接种策略。可以推测，前体细胞在酶消化后的敏感性，以及生长因子能否充分激活其增殖能力，可能是造成这种差异的潜在机制，而这种差异在某些情况下直接决定了细胞系能否成功建立。然而，仍需进一步研究以明确其中的因果关系。
针对三维卵巢癌类器官中高细胞黏附性和功能性连接难以消化的问题，当胰蛋白酶消化后仍有较大团块残留时，可结合使用针头和注射器进行机械与酶解离解。尝试不同的酶解条件可能进一步优化解离效果。
经过长期保存后，可根据实验设计将类器官系解冻并重新投入培养，用于后续应用。这使得研究人员能够随时获取已建立的特定类器官系，以满足特定的研究需求，尤其适用于结合患者疾病进展来研究某些类器官系的长期行为。然而，卵巢癌类器官的冷冻保存仍面临挑战。冻融过程中的温度变化可能对类器官的存活率、功能性和扩增潜能产生不利影响。液氮中的长期保存更为稳定，因其极低的温度可最大限度地降低降解风险，从而维持类器官的完整性。然而，仍需持续优化冷冻、保存和解冻的标准化操作流程，以进一步改进这些过程。
尽管存在上述未解决的问题，本方案仍展示了从卵巢癌患者实体瘤样本中持续稳定地建立类器官系的能力。在本实验室，截至目前共处理了120例原发性卵巢癌组织样本，在约50%的病例中获得成功，涵盖多种组织学亚型和疾病阶段，包括初次肿瘤减灭术、复发性疾病以及新辅助化疗后的手术标本。本方案通过提供一个系统化的框架，用于从不同患者样本中生成类器官，并在不同培养基中进行平行接种以及采用多种接种策略，从而有机会评估不同个体间干性潜能的差异，进一步提供有关肿瘤生物学的额外信息。据我们所知，绝大多数研究通常采用相反的策略，即在少量样本上测试培养基组分，并为简便起见主要选择一种最优培养基。而我们对HER1ß的作用、RSPO1与FGF10添加效果以及二维/三维接种方式的系统性测试结果明确表明，卵巢癌组织在干性特性方面存在显著的患者间异质性，最优培养基确实具有患者特异性。因此，系统性地平行测试提供不同外源旁分泌信号环境的多种培养基组分至关重要。
建立一个包含来自多种卵巢癌患者的类器官及其前瞻性收集的临床信息的活体生物样本库，为广泛的研究应用提供了宝贵的资源，并反映了可能适用于更大患者群体的异质性临床特征17。长期培养和冷冻保存能够确保实验的一致性，并可在长时间内反复获取相同的类器官系，为肿瘤细胞系特性保持不变的纵向实验设计奠定了基础。
通过保留上皮结构和极性，类器官系是研究由旁分泌信号通路介导的细胞间通讯及依赖于微环境的细胞命运决定的合适模型。将类器官包埋于组织学凝胶中是一种实用且高效的中间步骤，可避免固定后材料丢失，并确保后续处理（如石蜡包埋和切片）能够与组织样本并行进行。在类器官数量极为有限时，固定过程中类器官的丢失是一个关键问题。然而，可通过在冷的基础培养基中充分洗涤以彻底去除细胞外基质中的类器官，并在固定前合并至少两个24孔板中完全生长的孔，从而抵消这一损失。免疫荧光染色方案可实现高分辨率共聚焦成像，将卵巢癌类器官的分子特征和表型特征与亲本肿瘤组织相对应，同时也是研究细胞对化学化合物反应或鉴定基因修饰类器官系的有力工具。该方法无需特殊修改，同样适用于组织学染色。根据研究目的，可考虑使用切片机切割更薄的切片（2–3 µm）。
重要的是，稳定的长期培养是进行基因编辑实验以及针对新型和标准疗法的药物反应与耐药性功能检测的前提条件17,21特别是，在疾病进展和复发期间通过再次活检所生成的类器官，为直接比较治疗初治的原发肿瘤与复发时新出现的特征提供了可能。这有助于识别患者特异性的治疗反应以及治疗耐药性的形成机制。 体外 推动卵巢癌研究中精准医学领域的发展21.

由于上皮性卵巢癌在晚期阶段具有异质性的临床表现以及较高的复发率，其临床管理仍然具有挑战性1。要深入理解卵巢癌的发生发展及生物学行为，需要采用能够针对患者个体差异的研究方法，涵盖疾病进程、治疗反应以及组织病理学和分子特征等方面的变异2。
生物样本库通过系统性地收集和长期保存来自卵巢癌患者的肿瘤样本及其临床信息，能够保存涵盖不同疾病阶段的大规模患者队列样本，包括初次肿瘤减灭术、新辅助化疗后以及复发性疾病所获取的肿瘤样本。生物样本库在推动癌症研究方面具有重要价值，可作为有前景的预后生物标志物和治疗靶点的资源3。然而，传统的生物样本保存方法，如福尔马林固定和冷冻保存，由于导致细胞活性丧失以及原生三维组织结构的破坏，难以用于对原始肿瘤样本进行功能性研究4,5。
分子机制的研究，无论是在肿瘤学领域还是其他领域，都高度依赖于使用能够真实反映疾病生物学特性并维持其特征的适当实验模型 体外 组织观察到的特性 体内基于保留自我更新潜能的特性，患者来源的类器官可在实验室中重现上皮组织的原始结构与功能，并支持在个体化背景下进行检测。因此，类器官已成为癌症研究与个性化医疗中极具前景的工具，有效弥合了临床多样性与实验室研究之间的鸿沟6,7,8,9基于类器官系对药物的个体化反应来定制治疗策略，并验证分子谱型的功能相关性，有望直接应用于患者诊疗。10,11长期培养具有患者特异性特征的细胞并随时间收集相关前瞻性临床数据的可能性，为识别疾病进展和耐药机制中新的预后与预测因子提供了广阔前景3,9.
然而，建立一个包含来自不同肿瘤样本类器官的生物样本库，需要严格遵循复杂的方法学，并制定便于维护的操作流程12。流程的标准化可确保经过培训的工作人员即使在人员流动较高的情况下，也能高效地建立和维护生物样本库，同时符合最高质量标准13。已有多个研究报道成功建立了稳定的卵巢癌类器官细胞系，这些细胞系在突变特征和表型特征上与原始肿瘤一致，但建系效率存在差异。尽管如此，在实践中常规的生物样本保藏仍面临挑战，特别是细胞系的长期稳定生长，而这是实现大规模扩增或成功进行基因组编辑的前提条件。
特别是，类器官领域中关于可扩展性的问题仍未明确界定，因为一些生长缓慢且增殖能力有限的类器官偶尔也被视为已建立的稳定细胞系。正如Hoffmann等人最初所展示的那样，在为本优化方案奠定基础的关键研究中表明，卵巢癌组织的最佳处理需要采用独特策略，以应对肿瘤的异质性14。通过该方法获得的类器官的表型特征，以及其与亲本肿瘤组织的高度相似性，已通过成熟培养物（培养4-10个月）的DNA测序 panel 和转录组学分析得到验证，证实了该模型的稳定性8,9,12,14。
与调节健康输卵管稳态的旁分泌环境不同，可能产生高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）、具有癌症再生潜能和类器官形成能力的上皮层对外源性Wnt补充的依赖性较低。此外，活跃的骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic Protein, BMP）信号通路——以类器官培养基中不含Noggin为特征——被证明有利于从卵巢癌实体组织沉积物中建立长期培养体系14,15。在对卵巢癌实体沉积物进行系统性生物样本库建设过程中，我们验证了这些发现，并建立了本方案中详述的技术流程，可在大多数情况下确保持续的长期扩增。我们发现，在处理原代分离物时，平行测试不同培养基成分和接种方式对于提高长期稳定类器官系的建立效率、增加产量，以及实现下游实验所需的多孔板格式的稳健传代和扩增至关重要16。
此外，手术期间采集样本的纯度和质量对于卵巢癌类器官在基础研究和分子诊断中的转化潜力至关重要。高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）临床表现的复杂性要求外科医生、肿瘤科医生与实验室科研人员密切合作，以确保正确识别相关组织材料、保持恒定的运输条件，并高效建立能够代表每位患者疾病最重要特征的类器官细胞系。本方案提供了一个标准化且可灵活调整的框架，旨在充分挖掘卵巢癌类器官的潜力，同时考虑到卵巢癌所具有的异质性16,17。值得注意的是，该方案能够可靠地对卵巢癌广泛的临床表现进行生物样本库保藏，包括不同组织学类型（高级别和低级别卵巢癌、LGSOC）、同一患者中表现出干细胞调控差异的不同病灶、新辅助治疗后手术获取的组织、活检材料，以及疾病复发阶段手术所获得的样本。

<table><tbody><tr><td>100 Sterican 26 G</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>4657683</td><td></td></tr><tr><td>100 Sterican 27 G</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>293T HA Rspo1-Fc</td><td>R&amp;D systems, Minneapolis, USA</td><td>3710-001-01</td><td>替代品：表达 R-Spondin1 的细胞系，Sigma-Aldrich, SC111</td></tr><tr><td>A-83-01（TGF-b RI 激酶抑制剂 IV）</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>616454</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12 培养基&amp;nbsp;</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>抗 p53 抗体（DO1）</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA</td><td>sc-126</td><td></td></tr><tr><td>抗 PAX8 抗体</td><td>Proteintech, Manchester, UK&amp;nbsp;</td><td>10336-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>B-27 添加剂（50 倍浓缩）</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>瓶顶式真空滤器，0.2 &amp;micro;m</td><td>Corning, Berlin, Germany&amp;nbsp;</td><td>430049</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 细胞培养瓶，175 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Greiner Bio-one, Kremsm&amp;uuml;nster, Austria</td><td>661175</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 细胞培养瓶，25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Greiner Bio-one, Kremsm&amp;uuml;nster, Austria</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 细胞培养瓶，75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Greiner Bio-one, Kremsm&amp;uuml;nster, Austria</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 I</td><td>Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>Costar 48 孔透明 TC 处理培养板&amp;nbsp;</td><td>Corning, Berlin, Germany&amp;nbsp;</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>Cryo SFM</td><td>PromoCell &amp;ndash; Human Centered Science, Heidelberg, Germany</td><td>C-29912</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 低生长因子基底膜提取物，2 型，Pathclear</td><td>R&amp;D systems, Minneapolis, USA</td><td>3533-005-02</td><td>替代品：Matrigel，低生长因子基底膜基质&amp;nbsp; Corning, 356231&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure 驴抗小鼠 IgG</td><td>Jackson Immuno</td><td>715-175-151</td><td></td></tr><tr><td>DAKO&amp;nbsp;柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0，10 倍抗原修复液</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany</td><td>C9999-1000ML</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>驴抗兔 Alexa Fluor Plus 555</td><td>Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>A32794</td><td></td></tr><tr><td>驴抗山羊 IgG Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>A32814</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;acute;s 磷酸盐缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel</td><td>Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>Epredia HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24 孔聚苯乙烯培养板&amp;nbsp;</td><td>Corning, Berlin, Germany&amp;nbsp;</td><td>351447</td><td></td></tr><tr><td>Feather 手术刀&amp;nbsp;</td><td>Pfm medical, Cologne, Germany</td><td>200130010</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>37% 无酸甲醛，稳定型</td><td>Morphisto, Offenbach am Main, Germany</td><td>1019205000</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>HEPES（1 M）</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>156630080</td><td></td></tr><tr><td>人 EpCAM/TROP-1 抗体</td><td>R&amp;D systems, Minneapolis, USA</td><td>AF960</td><td></td></tr><tr><td>人 FGF10</td><td>Peprotech, NJ, USA</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>人重组 BMP2</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>PHC7146</td><td></td></tr><tr><td>人重组 EGF</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>PHG0311L</td><td></td></tr><tr><td>人重组 Heregulin beta-1</td><td>Peprotech, NJ, USA</td><td>100-03</td><td></td></tr><tr><td>LAS X 核心软件</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/</td></tr><tr><td>Leica TCS SP8 X&amp;nbsp;白光激光共聚焦显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-2 添加剂（100 倍浓缩）</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Omnifix 1 mL</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>3570519</td><td></td></tr><tr><td>石蜡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Omnilab, Munich, Germany</td><td>5170002</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛&amp;nbsp;</td><td>Morphisto, Offenbach am Main, Germany</td><td>1176201000</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（Pen Strep）</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany</td><td>P4333-100</td><td></td></tr><tr><td>PluriStrainer 400 &amp;micro;m</td><td>PluriSelect, Leipzig, Germany</td><td>43-50400-01</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen, Toulouse, France</td><td>ant-pm-05</td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>Roticlear</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>A538.5</td><td></td></tr><tr><td>Surgipath Paraplast</td><td>Leica, Wetzlar, Germany</td><td>39602012</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nunc 冻存管</td><td>Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>375418PK</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝染色液</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express 酶&amp;nbsp;</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>PanReac AppliChem, Darmstadt, Germany</td><td>A4974-0100</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>R25001</td><td></td></tr></tbody></table>

卵巢癌类器官生物样本库构建策略：应对不同组织学亚型及疾病阶段间的患者间异质性

Strategy for Biobanking of Ovarian Cancer Organoids: Addressing the Interpatient Heterogeneity across Histological Subtypes and Disease Stages

尽管建立包含患者来源类器官及其临床背景信息的卵巢癌生物样本库有望推动研究和患者诊疗的发展，但由于这种致命恶性肿瘤的异质性以及类器官技术本身固有的复杂性，标准化仍面临挑战。本可调整的实验方案提供了一个系统性框架，能够在考虑前体细胞个体差异的基础上，充分释放卵巢癌类器官的潜力。通过实施结构化的实验流程，筛选最佳培养条件和接种方法，并平行测试直接3D接种与2D/3D途径，我们在大多数情况下均可获得稳定、可长期扩增的类器官细胞系，适用于多种下游应用。
值得注意的是，该方案已在大量（N = 120）高度异质性的起始材料中经过测试并证明有效，包括高级别和低级别卵巢癌，以及接受过初次肿瘤减灭术、复发性疾病和新辅助化疗后手术标本的不同疾病阶段。在低Wnt、高BMP的外源性信号环境中，我们观察到前体细胞对Heregulin 1 ß（HERß-1）通路的激活表现出不同的敏感性，HERß-1在某些样本中促进类器官形成，而在其他样本中则抑制其形成。对于部分患者的样本，最佳的类器官形成和长期生长需要在培养基中添加成纤维细胞生长因子10和R-Spondin 1。
此外，我们强调了组织消化和前体细胞分离的关键步骤，并举例说明在塑料培养皿上进行短暂的二维培养有利于后续在基底膜提取物2型基质中形成类器官。总体而言，实现最佳生物样本保存需要系统地平行测试所有主要条件，以确定适合各个细胞系的适宜生长环境。本方案还描述了高效包埋、切片和染色的操作流程，以获得高分辨率的类器官图像，这对于全面的表型分析至关重要。

在完成初始的组织解离、过滤和计数后，细胞被平行接种于3D培养体系中（如上所述），同时部分细胞接种于培养瓶中进行短暂的2D扩增。在某些情况下，短暂的2D扩增对类器官的形成具有积极影响，通过该途径可成功建立长期培养的细胞系，而平行进行的3D直接接种则可能导致生长停滞（图1）。对于每一份处理的供体组织，细胞均根据培养基矩阵进行测试。通过这一策略，我们的生物样本库目前已包含代表每种标准生长条件的细胞系，如图2所示。通过严格实施该微型筛选平台，对不同培养基及接种方式进行测试，我们已成功从卵巢癌的不同组织学类型及疾病发展阶段中建立了类器官细胞系，包括原发性高级别浆液性癌、新辅助化疗后间期手术样本以及复发性疾病样本（图3）。通过免疫荧光染色对类器官细胞系的主要标志物进行表型表征，并与亲本组织进行比较，结果有力地表明，类器官模型中保留了上皮肿瘤区室的关键特征：由EpCAM标记的上皮结构和黏附特性、PAX8标记的谱系身份，以及HGSOC典型的TP53点突变，后者导致蛋白在细胞核内积聚（图4）。
在类器官生物样本库的高效决策过程中，还需考虑一些重要的方法学要点。类器官的生长潜力不仅由类器官直径的增加决定，其表型特征如颜色、深浅和轮廓完整性也决定了扩增潜力。细胞质应激空泡的形成提示培养条件不理想。由于组织运输条件不当或组织处理延迟，可能在初期出现生长及类器官形成潜力方面的问题。鉴于肿瘤细胞系间扩增潜力存在较高的个体间差异，我们建议至少等待14天后再对生长潜力做出最终判断。如果在不同培养基中初期观察到相似的生长模式，应同时扩大多种培养条件进行培养。根据我们的经验，通常只有在数周甚至数月的培养后，才能明确区分出长期稳定的生长潜力。
<img alt="显示2D单层和3D培养发育的细胞培养过程示意图及显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66467/66467fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：原代分离物在2D中短暂接种对后续类器官生成的益处。（A）实验设计示意图，显示两种平行接种策略：2D/3D接种与直接3D接种，使用四种不同的培养基。（B）胰蛋白酶消化前贴壁生长的原代分离物图像。（C）一个原代分离物示例，平行接种结果明确显示出2D/3D路径的优势，因为只有最初在塑料培养皿上分离的前体细胞才能实现长期类器官扩增。左上方图像显示在第0代（P0）分离后7天的3D培养物，左下方图像显示在第1代（P1）时类器官形成不足。而在塑料培养皿上进行2D接种（参见图1B）并转移至3D培养后，P0时已可见较好的类器官形成，且在第4代（P4）时确认具备长期扩增潜能。比例尺 = 200 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="细胞培养形态、显微镜图像、OCM1与OCM2比较、生长分析，500 μm比例尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66467/66467fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：患者特异性培养基需求。 四种不同长期稳定扩增细胞系的示例，每种细胞系在不同的培养基中生长。比例尺 = 500 µm。缩写：OCM = 卵巢癌培养基；her = 乙酰肝素调节蛋白1β（heregulin 1β）；HGSO = 高级别浆液性卵巢癌。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示高级别浆液性卵巢癌和低级别浆液性卵巢癌原发及复发肿瘤细胞培养的显微镜图像；比例尺分别为 500 μm 和 200 μm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66467/66467fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：从疾病各个阶段生成的类器官。 来自原发性高级别浆液性卵巢癌和低级别浆液性卵巢癌、中间手术（新辅助化疗后）以及复发性癌组织的长期稳定扩增细胞系的图像。比例尺 = 500 µm。缩写：HGSOC = high-grade serous ovarian cancer；LGSOC = low-grade serous ovarian cancer；NACT = neoadjuvant chemotherapy。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="组织和类器官的免疫荧光分析；EPCAM、TP53、PAX8 标记物；显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66467/66467fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：类器官与其来源癌组织表型高度一致。 共聚焦显微镜图像显示（A）癌组织和（B）配对的类器官系在所有标记物的染色模式和表达水平上均表现出高度相似性，包括 EpCAM（绿色）、PAX8（红色）、TP53（洋红色）。比例尺 = 20 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：本实验方案中所用培养基和消化混合液的成分。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467_Table%201.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

本方案为从不同疾病阶段建立卵巢癌类器官提供了一个系统性框架，并针对患者个体差异带来的挑战，提高了类器官的得率，实现了稳定且长期的扩增，以满足后续应用需求。方案涵盖了组织处理、接种、培养基条件优化以及免疫荧光染色等详细操作步骤。

尽管建立来自患者源性类器官及其临床背景信息的卵巢癌生物样本库有望推动……

对于晚期卵巢癌患者，我们机构始终将尖端转化研究中的最佳临床管理置于最高优先级。通过患者来源类器官的生物样本库建设，我们在实现个体化治疗管理方面取得了重大进展。这使我们能够评估患者的特异性特征，并鉴定出具有预测价值的生物标志物。近年来，我们在改善晚期卵巢癌患者的根治性多脏器切除手术、化疗、抗血管生成治疗以及PARP抑制剂治疗方面取得了显著进展，甚至提高了患者的生存率。而下一步的重大进展将是更好地预测哪些患者能够从特定治疗中获益。目前，临床治疗决策主要依据一般的组织病理学特征，以及对石蜡包埋肿瘤组织中同源重组缺陷的检测信息。目前，用于评估化疗和靶向治疗特定反应的生物学模型尚未在临床常规中得到应用。我们已鉴定出卵巢癌组织的关键特征，特别是体外维持其自我更新潜能所需的培养条件，并利用这些知识实现了类器官系的稳定长期生长，从而建立了涵盖疾病不同阶段样本的生物样本库。我们在卵巢癌类器官生物样本库日常工作中观察到，这种恶性肿瘤在生物学上具有显著的异质性，这可能为新的分类方法提供依据，或为靶向干性潜能的新型治疗策略奠定基础。首先，取 freshly isolated 卵巢癌组织。在培养皿中使用不含钙和镁的 PBS 充分清洗新鲜组织。使用一次性手术刀和剪刀，将培养皿中的组织切割成小块。将组织收集到冻存管中，随后将这些冻存管转移至装有液氮的容器中进行速冻。接着，取2至3毫米的组织放入组织学标本容器中，然后将组织置于福尔马林固定液中固定24小时。使用手术刀在酶消化前对组织进行匀浆，以最大程度实现机械解离。随后在37摄氏度水浴中孵育1.5小时。孵育结束后，向试管中加入15毫升冷的基礎培养基。将离心管在300 ×g条件下离心5分钟，弃去上清液，加入5 mL新鲜基础培养基。然后使用400 µm滤膜将细胞悬液过滤至新的15 mL离心管中。为去除红细胞，向细胞沉淀中加入5 mL红细胞裂解缓冲液，在37 °C水浴中孵育5分钟。孵育后，加入5 mL基础培养基以终止裂解反应。通过离心收集细胞沉淀，并向细胞沉淀中加入3 mL基础培养基。随后，将悬浮于基础培养基中的所需数量的细胞转移至新离心管中。将细胞离心，弃去上清液后，将细胞沉淀与预冷的BME 2基质在冰上充分混匀。将细胞以BME 2基质液滴的形式接种至预热的空48孔板中，移液时需交替吹打以确保细胞均匀分布。随后，向各对应孔中加入250微升卵巢癌培养基。为了从剩余的分离细胞开始建立二维培养，将细胞在300 ×g 条件下离心5分钟，并将细胞沉淀加入二维培养基中。使用相差显微镜获取高质量的二维和三维培养物以及直接接种培养板的图像。使用4倍物镜对培养板进行成像以概览各孔情况，使用10倍和20倍物镜记录类器官的形态特征。将图片按不同细胞系分别存放在专用的文件夹中。在分离培养约14至21天后，评估类器官的形成能力，包括数量、大小和细胞表型。观察特定特征，如无空泡形成、细胞膜出芽、黏附能力丧失以及细胞变圆等现象。已成功从不同组织学类型和分期的卵巢癌中建立了类器官系，包括原发性高级别浆液性癌、新辅助化疗后间隔手术样本以及复发性疾病样本。首先，取培养于24孔或48孔板中的卵巢癌类器官，加入预冷的基础培养基，通过移液或刮擦孔板底部，使每个BME 2基质液滴破碎分散。然后将细胞悬液转移至15毫升离心管中，置于冰上保存。加入1毫升预冷的基础培养基。合并2到3个技术重复孔以进行均一化扩增后，在300 ×g条件下离心5分钟。将悬液置于光线下观察，确认其中无 BME 2 凝胶存在。进行类器官冷冻保存时，按前述方法制备细胞沉淀，并将细胞沉淀重悬于 1 毫升预冷的冷冻保存液中。将细胞悬液转移至预先标记的 1.8 毫升冻存管中。首先，取培养的卵巢癌类器官并收集。向类器官中加入三毫升含4%多聚甲醛的PBS溶液，在室温下孵育一小时。用五毫升PBS洗涤类器官两次。在300 ×g条件下离心三分钟。弃去上清液后，向沉淀中加入4 mL新鲜PBS。混匀后，于4°C保存直至包埋。将组织学凝胶在65摄氏度下加热以使其液化。随后识别沉降到管底的固定类器官，并移除上清液。用移液器将沉淀物重悬于100微升预热的凝胶中。将液滴转移至一片封片膜上，在室温下静置约15分钟，使其凝固。将凝固后的凝胶小滴移至组织包埋盒中，并按照标准的组织包埋流程进行操作。使用切片工具将包埋的组织切成5至10微米厚的切片。将这些切片置于组织学载玻片上。在65摄氏度下干燥1小时，然后存放在干燥处。

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