生成人胰腺组织切片以研究内分泌和外分泌胰腺生理学

我们的研究重点是1型糖尿病，强调调节免疫系统并恢复β细胞和α细胞功能的治疗方法。我们已开发出一种独特的研究平台，利用器官捐献所得的活体人胰腺切片，以补充孤立胰岛的研究。该方法能够对重要的细胞相互作用和功能进行详细分析。

我们与一个胰腺器官捐献者网络的合作为科研人员提供了获取胰腺组织样本的机会。然而，培养这些组织样本存在挑战，因为消化酶可能降解组织并降低其活性。因此，迫切需要建立能够维持组织活性及生理环境的培养条件，以开展准确的功能研究。

我们的方案能够获取胰腺内所有细胞的功能数据，因此研究者可将其用于多种研究。我们自身的研究重点是建立1型糖尿病模型并评估药物的作用机制。我的一个关键问题是探讨α细胞的功能及其在1型糖尿病中的作用。

我们的实验方案不仅克服了分离胰岛所伴随的存活偏差问题，还能独特地促进对1型糖尿病相关关键免疫细胞的研究。通过研究完整的胰腺组织，我们可以评估更接近体内环境的功能与反应。我们致力于与他人分享胰腺组织切片技术平台的最新进展。

通过 Ampod，我们的目标是促进协作，通过模拟疾病机制并测试潜在的治疗药物，更有效地解决关键科学问题，从而为推动新型治疗方法的发展做出重要贡献。首先，将人胰腺组织和基础缓冲液置于体视显微镜下，使用镊子和剪刀轻柔地去除结缔组织、纤维化组织和脂肪组织。用剪刀将组织切成多个面积约为 0.5 立方厘米的组织块。

然后用纸巾将组织块吸干。接着将四个组织块转移至一个35毫米的培养皿中。加入3.8%琼脂糖溶液，直至所有组织块完全浸没。

琼脂糖溶液凝固后，切出组织块。用手术刀沿培养皿边缘划开，去除琼脂糖，并小心分离组织块。为切片组织，需将组织块粘附于振动切片机的金属板上。

将切片盘安装到仪器的载物台上，然后向盘中加入基础缓冲液。将振动切片机设置为自动切片，厚度为120微米，并调整起始和终止位置。现在将刀片移至组织上方稍高处。

以0.8毫米的振幅在低速下开始切片。使用小刷子将切片收集到含有抑肽酶的对照缓冲液中，孵育1小时。将切片置于低速旋转的摇床上，以充分洗去切片过程中释放的酶类物质。

为检测组织活性，将单个组织切片转移至含有990微升基础缓冲液的12孔板的一个孔中。随后用移液器将荧光素二乙酸酯加入该孔中。向组织切片中加入10微升碘化丙啶，该碘化丙啶已用990微升磷酸盐缓冲液（PBS）稀释。

然后将切片浸入另一孔中的 PBS 中，持续一分钟。最后，将切片置于载玻片上，加盖盖玻片用于成像。在新切割的胰腺组织中观察到 80% 至 90% 的存活率。

由于细胞损伤，切割表面的细胞活力降低。延迟切片导致活力下降。开始时，先打开灌流装置，启动灌流软件，输入腔室数量，然后标记输入溶液。

现在连接灌注装置的流入和流出管路。接着，在体视显微镜下放置三个包埋在琼脂糖中的人胰腺组织切片。使用毛刷和手术刀将组织周围的琼脂糖尽可能修剪至最少。

在切片室的网格上加入一滴基础缓冲液。轻轻地将每个切片转移至各自的网格上。从上到下组装切片室的各个部件。

为研究分离的胰岛，每次胰岛素分泌实验至少使用每列30个胰岛，胰高血糖素检测则需100个胰岛，并将胰岛加入盛有基础缓冲液的腔室中。拧紧盖子以封闭胰岛腔室。接着，点击“步骤”选项卡，输入行数，将每步时间设置为90分钟，然后点击“应用”。

添加所有溶液的步骤后，点击“概览”选项卡以查看实验方案的概览。点击“板图”选项卡以查看板的可视化图示。开始使用加载溶液对细胞进行预处理。

灌流过程中使用腔室加热和托盘冷却泵。监测腔室以确保准确的流速和气泡情况。在实验方案进行过程中更换收集板。

将托盘置于 4 摄氏度保存，用于当天定量分析。灌注完成后，拆卸灌流室，将各部件轻轻翻转至含有基础缓冲液的培养皿中以收集脑片。随后将脑片转移至离心管中，用于裂解或固定。

用清水、10% 次氯酸钠溶液以及水和空气的组合冲洗仪器以进行清洁。将制备好的钙染料溶于3厘米宽的培养皿中的3毫升基础HEPES缓冲液中，并在稀释后的染料溶液中加入抑肽酶。然后将单个脑片转移至该溶液中。

将切片置于室温下，在避光环境中于旋转摇床上孵育30分钟至1小时。在此期间，连接装满灌注液的注射器和管路。打开仪器加热器，并将泵的流速调节至0.5毫升每分钟。

现在，轻轻地将一片样本放入共聚焦显微镜的成像室中。用网格固定器固定切片。将进液和出液管路连接到成像室，然后启动泵。

使用反射模式在低倍镜下确定成像区域，然后切换至高倍物镜并相应调整位置。将分辨率设置为至少256×256，成像时间间隔设为5-10秒，Z轴扫描范围设为30-60微米，层间间隔为10微米。根据实验要求，在开始成像时切换溶液。

在活性脑片中观察到动态的激素分泌，从而引起显著的胰岛素分泌。组织质量较差且切片时间延迟的样本，对高浓度葡萄糖和膜去极化的反应减弱或完全消失。通过钙成像过程中荧光强度变化生成的热图显示，在切换至高浓度葡萄糖后出现了响应性细胞。