Name: 生成人胰腺组织切片以研究胰腺内分泌和外分泌生理学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 了解利用器官捐献者的人胰腺组织切片研究1型糖尿病的方法。该技术通过振动切片制备活体组织切片，可维持80-90%的细胞活性，用于分析胰岛细胞相互作用、α细胞功能及免疫反应，为疾病机制研究和药物开发提供接近生理条件的实验模型。

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本研究是在胰腺器官捐献者糖尿病网络（nPOD；RRID:SCR_014641）的支持下完成的，nPOD 是一个由 JDRF（nPOD：5-SRA-2018-557-Q-R）和 Leona M. &amp; Harry B. Helmsley 慈善信托基金（Grant#2018PG-T1D053，G-2108-04793）资助的协作型 1 型糖尿病研究项目。文中所述内容和观点由作者负责，不一定反映 nPOD 的官方立场。与 nPOD 合作提供研究资源的器官获取组织（OPO）列于&#160;http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/。作者衷心感谢捐献者及其家属所做出的宝贵贡献。本工作得到了美国糖尿病协会 4-22-PDFPM（J.K.P.）以及 Leona M. 和 Harry B. Helmsley 慈善信托基金（资助编号 2015-PG-T1D-052）的支持。

来自两性组织捐献者的胰腺组织切片通过佛罗里达大学的糖尿病胰腺器官捐献者网络（nPOD）组织库获得。根据器官捐献相关法律和法规，佛罗里达大学机构审查委员会（IRB；IRB编号392-2008）已确定，来自无标识符的已故个体的器官组织不属于人类受试者研究，归类为非人类受试者研究，因此免除知情同意要求。本项目所使用的nPOD组织已获得佛罗里达大学IRB批准，确认为非人类来源（IRB20140093）。
注意：对于初次接触脑片技术及其应用（如灌流和钙成像）的读者，建议先通过小鼠或大鼠脑片积累实践经验并掌握基本操作技能，再进行人源样本的操作3,28。
1. 准备工作
注意：这些准备工作应在组织到达之前完成。
<ol>
	<li>通过混合 125 mM NaCl、5.9 mM KCl、2.56 mM CaCl2、1 mM MgCl2、25 mM HEPES、0.1% BSA、2 mM L-丙氨酸、L-精氨酸和L-谷氨酰胺来配制HEPES缓冲液。调节pH至7.4，并过滤除菌。</li>
	<li>向缓冲液中加入葡萄糖或其他刺激物，以制备用于灌流实验的溶液。基础缓冲液中加入5.5 mM葡萄糖。该缓冲液将用于脑片制备、脑片收集及灌流实验前处理。</li>
	<li>准备至少两个用于脑片收集的培养皿，在基础缓冲液中加入抑肽酶（10 µg/mL）。</li>
	<li>在不含BSA和氨基酸的HEPES缓冲液（125 mM NaCl、5.9 mM KCl、2.56 mM CaCl2、1 mM MgCl2、25 mM HEPES）中配制3.8%低熔点琼脂糖溶液，并保持在37 °C。</li>
	<li>安装振动切片机，将新刀片放入刀架中。如适用，将刀片角度设置为15°（若使用Leica VT1200S）。如适用，校准振动切片机。</li>
	<li>打开灌流仪，选择腔室数量并设置程序方案。</li>
	<li>将所有必要的溶液放入灌流仪中，预冲系统并保持溶液加热。仪器会自动计算实验方案中每种溶液所需的体积。</li>
</ol>
2. 组织处理
注意：切片应在收到样本后立即制备。任何延迟都可能导致操作困难并引起组织降解。
<ol>
	<li>将胰腺组织置于体视显微镜下的培养皿中，加入基础缓冲液（图1A）。使用镊子和剪刀轻轻去除结缔组织、纤维化组织和脂肪组织。</li>
	<li>使用剪刀或解剖刀将组织切成多个约0.5 cm3的小块（图1B）。用纸巾轻轻吸干胰腺组织块表面液体。</li>
	<li>将4个组织块转移至一个35 mm的培养皿中，并加入琼脂糖溶液直至完全浸没所有组织块。待琼脂糖充分凝固。</li>
	<li>小心地从琼脂糖中切出组织块。沿培养皿边缘用解剖刀划开以取出琼脂糖，并仔细分离组织块。确保每个组织块周围包裹有一层薄薄的琼脂糖。</li>
</ol>
3. 切片
<ol>
	<li>将组织块倒置并粘附在振动切片机的金属板上。</li>
	<li>将金属板安装到切片槽中，并向槽内加入基础缓冲液（含5.5 mM基础葡萄糖的HEPES缓冲液）。</li>
	<li>设置振动切片机自动切片厚度为120 µm，并调整起始和终止位置。</li>
	<li>将刀片移至组织上方稍高处，以慢速（0.1 mm/s）和0.8 mm振幅开始切片。若组织允许，可适当提高切片速度（图1C）。</li>
	<li>使用弯头镊子或小毛刷收集切片。将切片收集至含有抑肽酶的基础缓冲液中（图1D）。</li>
	<li>将切片置于含抑肽酶的基础缓冲液中静置至少1小时。将切片放置于缓慢振荡的轨道摇床上，以促进切割过程中释放的酶类物质被冲洗出来。</li>
</ol>
4. 活/死细胞检测
注意：本实验为可选检测，用于显示组织切片在处理后的存活情况。然而，切片一旦染色后便不可再次使用。
<ol>
	<li>将单个切片转移至含有基础缓冲液的孔中。</li>
	<li>加入荧光素二乙酸酯（Fluorescein diacetate, FDA，50 µg/mL），室温避光孵育1分钟。</li>
	<li>加入碘化丙啶（Propidium iodide, PI，50 µg/mL），室温避光孵育1分钟。</li>
	<li>将切片转移至另一含有PBS的孔中，洗涤1分钟。</li>
	<li>将切片转移至培养皿中，或置于载玻片上加盖盖玻片后进行成像（图2A，B）。</li>
</ol>
5. 灌流
注意：本方案描述了如何对组织切片进行动态灌流，但也适用于分离的胰岛。在装载胰岛之前，需根据仪器用户手册中的说明，使用滤纸和微珠溶液对胰岛腔室进行预处理。然而，胰岛腔室与切片腔室可在同一实验中同时使用。
<ol>
	<li>在体视显微镜下使用毛刷和手术刀选取3个切片，并将琼脂糖修剪至最小程度。</li>
	<li>在切片室网格上滴加一滴基础缓冲液（含5.5 mM基础葡萄糖的HEPES缓冲液），然后将一个切片轻轻放置于网格上。对3个切片依次重复此操作（图3A）。若切片非常小，可堆叠超过3个切片室以增加胰岛数量。每个切片室中不得放置超过一个切片。 
	注意：每个切片所含胰岛数量因供体而异，且取决于切片大小（每切片10–100个胰岛）。已有研究证实，3个切片足以用于胰岛素和胰高血糖素分泌的测定。</li>
	<li>对于分离的胰岛，每列至少使用30个胰岛用于胰岛素分泌检测；建议使用100个胰岛用于胰高血糖素检测。按从上到下的顺序组装单个切片室组件。</li>
	<li>将切片室连接至仪器的进液和出液管路，并启动程序（图3C）。</li>
	<li>在程序运行期间启用切片室加热和托盘冷却泵。在程序过程中更换收集板，若当天进行定量分析，则将样品置于4 °C保存；否则保存于-80 °C直至分析。</li>
	<li>程序结束后，移除切片室，拆卸组件，并收集切片用于裂解（含3% HCl的无水乙醇）或固定（4%多聚甲醛）。</li>
	<li>通过用水、10%次氯酸钠溶液、水和空气依次冲洗的方式清洁仪器。</li>
	<li>使用市售检测试剂盒对激素分泌量进行定量分析。 
	注意：图4展示了3个切片胰岛素和胰高血糖素分泌的绝对水平，可用于估计浓度范围。</li>
</ol>
6. 钙成像
<ol>
	<li>根据制造商说明配制钙离子染料（例如 Fluo4-AM、Calbryte）溶液。</li>
	<li>用基础 HEPES 缓冲液稀释染料，并加入抑肽酶（10 µg/mL）。</li>
	<li>转移一片脑片，在室温下于摇床上避光孵育 30–60 分钟。</li>
	<li>在孵育期间，通过填充灌流注射器并预冲管路来准备脑片成像装置（图 5A、B）。</li>
	<li>连接所有设备，打开加热器，并启动泵流。建议同时使用管路内加热和平台加热，流速设为 0.5 mL/min。</li>
	<li>将一片脑片轻柔地放入成像腔室，并用网格固定器固定。</li>
	<li>使用低倍物镜确定成像区域。利用反射光有助于识别胰岛区域（图 5C）。</li>
	<li>切换至高倍物镜（例如 20x 或 40x），并根据实验设置调整位置。 
	注意：为确保细胞活性和胰岛结构完整性，建议光学切片位置应位于切割表面下方 1–2 个细胞层处。</li>
	<li>设定 z 轴层扫或拼接扫描位置，设置成像时间间隔和记录时长。本实验中采用的分辨率为至少 256 × 256，以区分单个细胞；成像时间间隔为 5–10 秒；z 轴层扫范围（如适用）为 30–60 µm，层间间隔为 10 µm（相当于一个细胞层）。详细的成像参数设置见图 6。 
	注意：应设置成像参数以获得最佳分辨率和最大成像面积，同时避免样品漂白。</li>
	<li>开始成像，并根据实验需求切换灌流溶液。成像结束后，收集脑片并进行固定，用于后续免疫组织化学分析。</li>
</ol>

Slicing Human Pancreas for Islet Function Research

<ol><li>Abdelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+stress+signaling+pathways+activated+during+human+islet+preparation+and+following+acute+cytokine+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Intracellular stress signaling pathways activated during human islet preparation and following acute cytokine exposure.</a> Diabetes. 53 (11), 2815-2823 (2004).</li>
<li>Lyon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research-focused+isolation+of+human+islets+from+donors+with+and+without+diabetes+at+the+alberta+diabetes+institute+isletcore%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Research-focused isolation of human islets from donors with and without diabetes at the alberta diabetes institute isletcore.</a> Endocrinology. 157 (2), 560-569 (2016).</li>
<li>Speier, S., Rupnik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+in+situ+characterization+of+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells.</a> Pflugers Arch. 446 (5), 553-558 (2003).</li>
<li>Cohrs, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel+network+architecture+of+adult+human+islets+promotes+distinct+cell-cell+interactions+in+situ+and+is+altered+after+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Vessel network architecture of adult human islets promotes distinct cell-cell interactions in situ and is altered after transplantation.</a> Endocrinology. 158 (5), 1373-1385 (2017).</li>
<li>Marolt, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+in+intact+mouse+acinar+cells+in+acute+pancreas+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging in intact mouse acinar cells in acute pancreas tissue slices.</a> PLoS One. 17 (6), 0268644(2022).</li>
<li>Stozer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+laser+scanning+microscopy+of+calcium+dynamics+in+acute+mouse+pancreatic+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in acute mouse pancreatic tissue slices.</a> J Vis Exp. (170), e62293(2021).</li>
<li>Stozer, A., Dolensek, J., Rupnik, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-stimulated+calcium+dynamics+in+islets+of+langerhans+in+acute+mouse+pancreas+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of langerhans in acute mouse pancreas tissue slices.</a> PLoS One. 8 (1), e54638(2013).</li>
<li>Weitz, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+pancreatic+islet+macrophages+use+locally+released+atp+to+monitor+beta+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Mouse pancreatic islet macrophages use locally released atp to monitor beta cell activity.</a> Diabetologia. 61 (1), 182-192 (2018).</li>
<li>Speier, S., Yang, S. B., Sroka, K., Rose, T., Rupnik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Katp-channels+in+beta-cells+in+tissue+slices+are+directly+modulated+by+millimolar+atp%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Katp-channels in beta-cells in tissue slices are directly modulated by millimolar atp.</a> Mol Cell Endocrinol. 230 (1-2), 51-58 (2005).</li>
<li>Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+beta+cell+mass+and+function+in+diabetes%3A+Recent+advances+in+knowledge+and+technologies+to+understand+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Metab%22%5BJournal%5D)">Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis.</a> Mol Metab. 6 (9), 943-957 (2017).</li>
<li>Cohrs, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunction+of+persisting+beta+cells+is+a+key+feature+of+early+type+2+diabetes+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Dysfunction of persisting beta cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis.</a> Cell Rep. 31 (1), 107469(2020).</li>
<li>Marciniak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+pancreas+tissue+slices+for+in+situ+studies+of+islet+of+langerhans+and+acinar+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of langerhans and acinar cell biology.</a> Nat Protoc. 9 (12), 2809-2822 (2014).</li>
<li>Panzer, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+tissue+slices+from+organ+donors+enable+in+situ+analysis+of+type+1+diabetes+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis.</a> JCI Insight. 5 (8), e134525(2020).</li>
<li>Campbell-Thompson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+for+pancreatic+organ+donors+with+diabetes+%28npod%29%3A+Developing+a+tissue+biobank+for+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Network for pancreatic organ donors with diabetes (npod): Developing a tissue biobank for type 1 diabetes.</a> Diabetes Metab Res Rev. 28 (7), 608-617 (2012).</li>
<li>Kaddis, J. S., Pugliese, A., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+run+on+the+biobank%3A+What+have+we+learned+about+type+1+diabetes+from+the+npod+tissue+repository%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Endocrinol+Diabetes+Obes%22%5BJournal%5D)">A run on the biobank: What have we learned about type 1 diabetes from the npod tissue repository.</a> Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 22 (4), 290-295 (2015).</li>
<li>Pugliese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insight+on+human+type+1+diabetes+biology%3A+Npod+and+npod-transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Diab+Rep%22%5BJournal%5D)">New insight on human type 1 diabetes biology: Npod and npod-transplantation.</a> Curr Diab Rep. 14 (10), 530(2014).</li>
<li>Pugliese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+juvenile+diabetes+research+foundation+network+for+pancreatic+organ+donors+with+diabetes+%28npod%29+program%3A+Goals%2C+operational+model+and+emerging+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Diabetes%22%5BJournal%5D)">The juvenile diabetes research foundation network for pancreatic organ donors with diabetes (npod) program: Goals, operational model and emerging findings.</a> Pediatr Diabetes. 15 (1), 1-9 (2014).</li>
<li>Liang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+human+pancreatic+slice+preparations+offer+a+valuable+model+for+studying+pancreatic+exocrine+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology.</a> J Biol Chem. 292 (14), 5957-5969 (2017).</li>
<li>Qadir, M. M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+human+pancreatic+slices+as+a+model+to+study+real-time+islet+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration.</a> Nat Commun. 11 (1), 3265(2020).</li>
<li>Huber, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+islet+function+and+islet-immune+cell+interactions+in+live+pancreatic+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Observing islet function and islet-immune cell interactions in live pancreatic tissue slices.</a> J Vis Exp. (170), e62207(2021).</li>
<li>Panzer, J. K., Tamayo, A., Caicedo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoring+glutamate+receptor+signaling+in+pancreatic+alpha+cells+rescues+glucagon+responses+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Restoring glutamate receptor signaling in pancreatic alpha cells rescues glucagon responses in type 1 diabetes.</a> Cell Rep. 41 (11), 111792(2022).</li>
<li>Mateus Goncalves, L., Almaca, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+human+islet+microvasculature+using+living+pancreas+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the human islet microvasculature using living pancreas slices.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 11, 602519(2020).</li>
<li>Doke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+scrna-seq+of+live+human+pancreatic+slices+reveals+functional+endocrine+cell+neogenesis+through+an+intermediate+ducto-acinar+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Dynamic scrna-seq of live human pancreatic slices reveals functional endocrine cell neogenesis through an intermediate ducto-acinar stage.</a> Cell Metab. 35 (11), 1944-1960 (2023).</li>
<li>Mateus Goncalves, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte+dysfunction+and+impaired+vasomotion+are+hallmarks+of+islets+during+the+pathogenesis+of+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Pericyte dysfunction and impaired vasomotion are hallmarks of islets during the pathogenesis of type 1 diabetes.</a> Cell Rep. 42 (8), 112913(2023).</li>
<li>Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+and+isolation+variables+predicting+human+islet+isolation+success%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Donor and isolation variables predicting human islet isolation success.</a> Transplantation. 85 (7), 950-955 (2008).</li>
<li>Hart, N. J., Powers, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+human+islets+to+understand+islet+biology+and+diabetes%3A+Progress%2C+challenges+and+suggestions%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Use of human islets to understand islet biology and diabetes: Progress, challenges and suggestions.</a> Diabetologia. 62 (2), 212-222 (2019).</li>
<li>Henquin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+correctly+reporting+hormones+content+and+secretion+in+isolated+human+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Metab%22%5BJournal%5D)">The challenge of correctly reporting hormones content and secretion in isolated human islets.</a> Mol Metab. 30, 230-239 (2019).</li>
<li>Panzer, J. K., Caicedo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+to+generate+and+utilize+pancreatic+tissue+slices+to+study+endocrine+and+exocrine+physiology+in+situ+from+mouse+and+human+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol to generate and utilize pancreatic tissue slices to study endocrine and exocrine physiology in situ from mouse and human tissue.</a> STAR Protoc. 4 (3), 102399(2023).</li>
<li>Toso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+human+islet+of+langerhans+isolation+yields%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Factors affecting human islet of langerhans isolation yields.</a> Transplant Proc. 34 (3), 826-827 (2002).</li>
<li>Hamilton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenaline+stimulates+glucagon+secretion+by+tpc2-dependent+ca%282%2B%29+mobilization+from+acidic+stores+in+pancreatic+alpha-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Adrenaline stimulates glucagon secretion by tpc2-dependent ca(2+) mobilization from acidic stores in pancreatic alpha-cells.</a> Diabetes. 67 (6), 1128-1139 (2018).</li>
<li>Adriaenssens, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+profiling+of+pancreatic+alpha%2C+beta+and+delta+cell+populations+identifies+delta+cells+as+a+principal+target+for+ghrelin+in+mouse+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic profiling of pancreatic alpha, beta and delta cell populations identifies delta cells as a principal target for ghrelin in mouse islets.</a> Diabetologia. 59 (10), 2156-2165 (2016).</li>
<li>Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+pancreas+tissue+slice+culture+facilitates+long-term+studies+of+exocrine+and+endocrine+cell+physiology+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ.</a> PLoS One. 8 (11), e78706(2013).</li>
<li>Gal, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+situ+approach+to+studying+pancreatic+ducts+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice.</a> Front Physiol. 10, 938(2019).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种制备具有活性的胰腺组织切片及其用于动态激素分泌和功能成像等功能性检测的实验方案。与人胰岛分离类似，组织切片制备的成功率受多种因素影响，包括供体特征、组织运输时间以及组织质量25,29。因此，实验中必须谨慎选择组织样本，并尽量缩短缺血时间。在此背景下，除尸体供体外，其他潜在的人体组织来源也应被认真考虑。纳入手术供体可将功能性切片数据与同一位患者相关的in vivo信息相结合，从而增强研究的转化价值11。然而，此类组织来源也带来其他因素的影响，因为手术活检通常来自因局部肿瘤而接受胰腺切除术的老年患者。值得注意的是，胰腺活检并非在糖尿病背景下进行的。
进行实际切片操作时，及时处理组织至关重要。根据本方案，切片可保存数小时，或如Qadir等人19所述进行长期培养。目前，该方案是唯一能够长期维持切片活性的方法，但未来的研究应评估不同培养时间下的功能变化，并与同一供体的分离胰岛进行比较。
该过程中最关键的步骤是在将组织包埋于琼脂糖之前进行细致的组织制备。较大的导管和纤维化组织可能会使切片过程复杂化，并可能导致组织块从琼脂糖中脱落。如果发生此类情况且脱落的组织碎片仍具有合适大小，可对其进行重新处理并再次包埋以进行切片。保持良好的组织质量和精细的操作可显著提高切片过程的效率，并获得最大数量和最佳质量的切片。从组织制备到切片生成的时间不应超过2-3小时，因为更长的间隔会显著影响组织的活性。
在切片灌流过程中，一个简单但关键的步骤是精确修剪切片，以确保其能完美地放入灌流室中。这有助于组织得到充分灌注，并维持稳定的液体流动。一旦启动实验方案，应避免对灌流室进行任何进一步操作，以防止激素释放出现不必要的波动。应准备充足的缓冲液，且灌流管应伸至液面底部，以防止吸入空气导致灌流室干涸。
进行钙成像时，应根据实验需求和设计仔细选择感兴趣区域。通过选择能够减少光照暴露或缩短整体实验时间的成像参数，以尽量减少光漂白至关重要。与动态激素分泌类似，维持适当的溶液流速和加热环境十分关键，因为脑片需要接近生理条件才能发挥最佳功能（例如 37 °C）。
胰腺组织切片能有效维持胰腺的结构完整性，保留其多种细胞类型之间的细胞间连接。因此，它们为分离胰岛的研究提供了替代方案，有助于同时探索内分泌和外分泌功能及其相互作用。为了评估不同细胞类型之间的相互作用，关键是要能够区分这些细胞类型。染色是一种可行方法，但在可用的荧光探针数量以及准确定位特定细胞层方面存在局限性。因此，建议在实验方案中加入细胞特异性刺激物，以便根据细胞的反应实现细胞类型的区分。在小鼠或人源组织切片中，可用于区分细胞类型的刺激物包括：肾上腺素用于α细胞21,30，饥饿素用于δ细胞31，胆囊收缩素用于腺泡细胞5,32，胆汁酸用于导管细胞33，去甲肾上腺素用于血管细胞22。类似的刺激物也可用于测量分泌反应。成像研究通常聚焦于单个细胞，而分泌研究则分析群体反应。因此，必须包含足够数量的切片以检测预期结果。所需切片的最佳数量可能因细胞类型而异，对于内分泌细胞，三个切片可能已足够；但为确保结果可检测，避免遗漏重要信息，建议使用更多切片。
与其他方法一样，组织切片在结果解读时也存在需要考虑的局限性。针对特定细胞类型的刺激可能会对切片中的其他细胞类型产生影响，从而可能触发反馈回路。然而，这些效应同样具有研究价值，因此所测得的反应可能更能代表生理状态下的真实反应。对于选择性细胞靶向，可采用传统的体外（in vitro）实验方案。值得注意的是，腺泡细胞含有胰酶，可降解蛋白质并消化组织切片，导致细胞在数小时内发生退化。为了维持切片的活性，当切片处于静置状态时，必须持续使用胰蛋白酶抑制剂，尽管这类抑制剂的使用可能干扰用于标记目的的病毒的有效转导。
与胰岛分离相比，供体差异性和组织质量可能影响所获得胰岛片的产量和活性。切片后活性不足可能导致胰岛片寿命较短，并阻碍其培养能力。此外，不同供体之间的胰岛数量可能存在显著差异，使得在开展实验前难以准确估计胰岛含量。因此，谨慎选择供体纳入标准，并采用适当的归一化方法（如以激素含量百分比表示分泌水平，或以相对于基线的倍数变化表示）至关重要。为了获得一致的结果，建议在实验前评估组织切片的活性。此外，推荐在实验中加入相应的对照刺激物（例如 KCl）。在进行单细胞分析（如成像）时，可根据细胞对这些对照刺激的反应预先进行细胞分选。尽管存在上述挑战，胰岛片仍为当前研究方法提供了重要的补充手段。
本方案可作为多种应用的起点，胰腺切片可在多种刺激后进行操作并检测其反应。我们还引导读者参考大量利用小鼠或人胰腺切片的研究，为计划开展实验的研究人员提供有价值的参考。未来，有可能利用胰腺切片研究潜在的治疗方法，或建立疾病机制的模型。

对胰岛生理学的研究对于理解糖尿病的发病机制以及开发新的治疗方法至关重要。迄今为止，相关研究主要依赖于分离的胰岛，这一过程会使胰岛暴露于机械和酶解应激之下，可能导致细胞生理状态的改变；此外，无法在胰岛所处的天然组织微环境中评估其功能，而该微环境很可能受到外分泌细胞、血管细胞等多种细胞的影响1在研究来自1型糖尿病（T1D）供体的胰腺时，存在一个挑战：这些供体的胰岛难以分离，且在分离过程中容易发生断裂，可能导致对胰岛产生选择性效应，从而无法代表整体胰岛群体 体内2此外，胰岛将与其复杂的微环境及细胞间连接被分离开来，尤其是与存在于发炎胰岛中、且在胰岛周边更为丰富的浸润性免疫细胞分离。因此，尽管分离的胰岛是糖尿病研究中的关键工具，但仍存在局限性。为此，我们提出一种开创性的活体胰腺切片制备方案，以应对这些挑战。
近年来胰腺组织切片技术的发展与应用被视为探索胰腺复杂生物学特性与功能的一项突破。该创新为在天然解剖环境中动态研究胰岛生理学以及内分泌、外分泌、神经、血管和免疫细胞之间的相互作用开辟了新途径。与传统方法不同，这种技术 体外 该方法在很大程度上保留了器官的细胞结构，使其生物学特性更接近天然状态。该技术最初由 Speier 和 Rupnik 于 2003 年在小鼠中建立。3该方法已证明可用于评估细胞内和细胞间信号传导中的钙成像、电生理学及激素分泌4,5,6,7,8,9随后将胰腺切片平台应用于通过手术活检获取的人类胰腺组织的研究4,10,11,12我们的研究团队通过糖尿病胰腺器官捐献者网络（nPOD）的活动，证明了从遗体器官捐献者获取并利用胰腺组织切片的可行性。13nPOD 向经批准的从事人类1型糖尿病研究的研究人员提供胰腺组织，自采用胰腺切片技术平台以来，nPOD 常规制备并分发活体胰腺切片14,15,16,17自2020年胰腺组织切片平台实施以来，nPOD已成功向众多研究人员分发了来自43位供体（包括12位1型糖尿病供体）的组织切片。研究人员利用这些切片，针对胰岛功能的关键方面开展了开创性研究，并探索了在1型糖尿病背景下胰岛与血管系统、神经系统及免疫细胞之间的相互作用。13,18,19,20,21,22,23,24许多研究强调了传统方法的局限性，并凸显了能够捕捉胰腺内部动态相互作用的技术的重要性25,26,27将小鼠胰腺切片技术灵活应用于人胰腺组织，并将其整合到“糖尿病胰腺器官捐献者网络”（nPOD）等项目中，充分体现了该方法在揭示1型糖尿病等疾病重要信息方面的潜力正日益受到认可。

<table><tbody><tr><td>丙氨酸</td><td>Sigma</td><td>A7627</td><td>氨基酸</td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 山羊抗豚鼠抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A11073</td><td>二抗</td></tr><tr><td>AlexaFluor 546 山羊抗大鼠抗体</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11077</td><td>二抗</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 山羊抗小鼠抗体</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21235</td><td>二抗</td></tr><tr><td>抑肽酶</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td>抑制剂</td></tr><tr><td>精氨酸</td><td>Sigma</td><td>A5006</td><td>氨基酸</td></tr><tr><td>Calbryte 520 AM</td><td>AAT Bioquest</td><td>20651</td><td>钙离子荧光染料</td></tr><tr><td>Fluo4-AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td>钙离子荧光染料</td></tr><tr><td>荧光素二乙酸酯</td><td>Sigma</td><td>F7378</td><td>细胞活性标记物</td></tr><tr><td>胰高血糖素</td><td>Sigma</td><td>G2654</td><td>一抗</td></tr><tr><td>胰高血糖素 ELISA（人源试剂盒）</td><td>Mercodia</td><td>10-1271-01</td><td>用于激素检测的 ELISA 试剂盒</td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>Sigma</td><td>G3126</td><td>氨基酸</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Dako</td><td>A-0546</td><td>一抗</td></tr><tr><td>胰岛素 ELISA（人源）</td><td>Mercodia</td><td>10-1113-01</td><td>用于激素检测的 ELISA 试剂盒</td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>LSM 900</td><td>Zeiss</td><td></td><td>共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>胰腺切片灌流室</td><td>Biorep Technologies</td><td>PERI-PSC-001</td><td>用于灌流实验的切片室</td></tr><tr><td>胰腺切片灌流室扩展套件</td><td>Biorep Technologies</td><td>PERI-PSC-EXT</td><td>用于灌流实验的切片室</td></tr><tr><td>胰腺切片灌流室穿孔板</td><td>Biorep Technologies</td><td>PERI-PSC-PP</td><td>用于灌流实验的切片室</td></tr><tr><td>带自动托盘处理功能的灌流系统</td><td>Biorep Technologies</td><td>PERI4-02-230-FA</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Life technologies</td><td>P1304MP</td><td>死细胞标记物</td></tr><tr><td>半自动振动切片机 VT1200S</td><td>Leica</td><td>14048142066</td><td></td></tr><tr><td>生长抑素</td><td>Millipore</td><td>MAB354</td><td>一抗</td></tr></tbody></table>

生成人胰腺组织切片以研究内分泌和外分泌胰腺生理学

Generating Human Pancreatic Tissue Slices to Study Endocrine and Exocrine Pancreas Physiology

研究人类胰腺对于理解1型（T1D）和2型糖尿病（T2D）相关的病理生理机制，以及胰腺内分泌和外分泌的生理功能及其相互作用至关重要。尽管通过分离胰岛的研究已获得大量知识，但这种方法无法在完整组织背景下考察其功能和相互作用。胰腺组织切片技术为在天然微环境中研究正常、炎症状态及结构受损的胰岛生理特性提供了独特机会，从而能够探究内分泌与外分泌区域之间的相互作用，以更深入地解析胰腺组织的复杂动态。因此，活体胰腺切片平台的应用代表了该领域的一项重要进展。本实验方案详细描述了如何利用 deceased 器官捐献者的胰腺组织，通过琼脂糖包埋和振动切片机制备活体组织切片，并进一步用于评估动态分泌和活细胞成像等功能性读数。

当实验方案成功执行时，1 g 胰腺组织可获得约 100–200 片组织切片。随后应使用体视显微镜检查这些切片，筛选出富含胰岛的切片，再进行功能评估。通过荧光素二乙酸酯（Fluorescein Diacetate, FDA）和碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）染色测定的存活率预计可达 80%–90%（图 2A）。由于切割过程中造成的细胞损伤，切片表面的细胞存活率可能明显较低。在存活良好的切片中可观察到动态激素分泌（图 2B），在高浓度葡萄糖刺激及氯化钾（KCl）引起膜去极化后，可引发强烈的胰岛素释放。
相反，如果在切片过程中出现延迟或组织质量不理想，则结果会有显著差异。获得的切片数量可能减少，活率评估可能显示被碘化丙啶（PI）标记的非活细胞比例升高（图2C）。在这些情况下，功能评估表明组织对高浓度葡萄糖和膜去极化的反应减弱甚至完全缺失（图2D）。来自非理想实验的数据凸显了及时、精确操作以及组织质量的重要性，因为这些因素可能影响组织的存活率和功能完整性。这些负面结果为成功实施该方法所需考虑的关键因素提供了重要的警示。
钙成像中的常见结果可呈现为热图（如图5D所示），或显示为单个细胞的独立信号轨迹（如图5E所示）。需要强调的是，染料会无差别地标记所有细胞类型，因此必须依赖特定刺激，才能根据细胞的反应差异进行区分。为了鉴定活细胞，我们使用KCl进行刺激，并筛选出反应幅度超过平均基线反应两倍标准误以上的细胞。此外，脑片可进行固定和染色处理，以实现对细胞类型的鉴定。
<img alt="植物组织培养过程；示意图；外植体准备；培养皿；组织生长培养基。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66468/66468fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：组织处理与切片。（A）1 g未处理的胰腺组织。（B）已清洗的胰腺组织块，准备进行琼脂糖包埋。（C）使用振动切片机进行切片的操作过程。（D） freshly cut human pancreas slices。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66468/66468fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="胰岛反应；显微图像、刺激指数图表；葡萄糖、KCl效应；示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66468/66468fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：组织活性与胰岛素分泌数据。（A）具有活性的组织切片代表性图像。反射激光的最大强度投影（灰色，左上），PI标记死亡细胞（红色，左下），FDA标记活细胞（绿色，右下），以及活细胞与死细胞的合并图像（右上）。虚线表示胰岛。比例尺为50 µm。（B）来自单一非糖尿病供体的人胰腺组织切片的动态胰岛素分泌。胰岛素动力学显示，在高浓度葡萄糖刺激6分钟后出现第一时相峰值反应，随后进入平台期的第二时相。数据已归一化至5.5 mM葡萄糖下的平均基础分泌水平（刺激指数，倍数变化）。胰岛素分泌实验所用切片来自与（A）中相同的供体。（C）无活性组织切片的代表性图像。反射激光的最大强度投影（灰色，左上），PI标记死亡细胞（红色，左下），FDA标记活细胞（绿色，右下），以及活细胞与死细胞的合并图像（右上）。虚线表示胰岛。比例尺为50 µm。（D）来自单一非糖尿病供体的人胰腺组织切片的动态胰岛素分泌。胰岛素动力学显示，葡萄糖刺激的胰岛素分泌以及KCl引起的膜去极化均明显丧失。数据已归一化至5.5 mM葡萄糖下的平均基础分泌水平（刺激指数，倍数变化）。胰岛素分泌实验所用切片来自与（C）中相同的供体。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66468/66468fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于细胞培养分析的微流控系统装置及腔室和管路细节特写" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66468/66468fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：动态灌注中的组织装载。（A）堆叠式切片腔室。单个组织切片如插图所示装载在金属网格上。（B）将分离的胰岛装载至胰岛腔室中。切片腔室和胰岛腔室连接至灌注装置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66468/66468fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="不同葡萄糖水平下胰岛素和胰高血糖素分泌的图表；激素反应分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66468/66468fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：胰岛组织切片与分离胰岛中的激素分泌。 图中（A）和（B）面板的数据来源于一位不同于（C）和（D）面板所用的供体。（A）来自一位非糖尿病供体的3个胰腺组织切片的绝对激素分泌量。胰岛素分泌以绿色表示，胰高血糖素分泌以品红色表示。（B）将（A）中所示激素分泌量归一化为总激素含量（占含量的百分比）。含量测定来自实验中使用的全部3个切片。（C）来自同一位非糖尿病供体的分离胰岛（100个胰岛）和胰腺组织切片（3个切片）的动态胰岛素分泌。数据以绝对数值（mU/L）表示。（D）将（C）中所示胰岛素分泌量归一化为总胰岛素含量（占含量的百分比）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66468/66468fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜与葡萄糖反应；成像装置、细胞反射、ΔF/F 热图、强度图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66468/66468fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5成像装置设置与预期结果 (A) 直立式共聚焦显微镜与灌流系统联用的功能成像装置。B连接进液和出液管路的成像室。C健康人供体胰腺组织切片中胰岛的共聚焦图像Z轴层扫结果，显示反射光（上图）和Fluo4信号（下图）。利用反射光识别切片中的胰岛（虚线所示）。D热图显示 体外 Ca2+ 胰岛细胞动态变化以Fluo4荧光强度表示，该强度已归一化为5.5 mM葡萄糖条件下的基础信号强度，并在高葡萄糖（16.7 mM）刺激下进行检测。每一行代表一个随时间追踪的单个细胞，横轴表示时间，颜色标尺显示其相对于基线的荧光强度变化幅度（%）（dF/F），颜色从蓝色（低强度）到红色（高强度）表示响应强度。E4 个单个细胞对高浓度葡萄糖产生反应的代表性轨迹。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66468/66468fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="共聚焦显微镜装置、胰岛及外分泌细胞分析、光学激发方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66468/66468fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：钙成像设置。 用于进行40 µm（XYZT成像）延时记录的代表性软件设置截图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66468/66468fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案描述了如何利用已故器官捐献者的胰腺制备人胰腺切片，以在接近生理条件下研究细胞功能。这一创新方法能够实现对正常及结构受损胰岛的检测，并深入探究内分泌与外分泌区域之间的复杂相互作用。

研究人类胰腺对于理解与1型（T1D）和2型糖尿病（T2D）相关的病理生理机制至关重要，以及……

我们的研究重点是1型糖尿病，强调调节免疫系统并恢复β细胞和α细胞功能的治疗方法。我们已开发出一种独特的研究平台，利用器官捐献所得的活体人胰腺切片，以补充孤立胰岛的研究。该方法能够对重要的细胞相互作用和功能进行详细分析。我们与一个胰腺器官捐献者网络的合作为科研人员提供了获取胰腺组织样本的机会。然而，培养这些组织样本存在挑战，因为消化酶可能降解组织并降低其活性。因此，迫切需要建立能够维持组织活性及生理环境的培养条件，以开展准确的功能研究。我们的方案能够获取胰腺内所有细胞的功能数据，因此研究者可将其用于多种研究。我们自身的研究重点是建立1型糖尿病模型并评估药物的作用机制。我的一个关键问题是探讨α细胞的功能及其在1型糖尿病中的作用。我们的实验方案不仅克服了分离胰岛所伴随的存活偏差问题，还能独特地促进对1型糖尿病相关关键免疫细胞的研究。通过研究完整的胰腺组织，我们可以评估更接近体内环境的功能与反应。我们致力于与他人分享胰腺组织切片技术平台的最新进展。通过 Ampod，我们的目标是促进协作，通过模拟疾病机制并测试潜在的治疗药物，更有效地解决关键科学问题，从而为推动新型治疗方法的发展做出重要贡献。首先，将人胰腺组织和基础缓冲液置于体视显微镜下，使用镊子和剪刀轻柔地去除结缔组织、纤维化组织和脂肪组织。用剪刀将组织切成多个面积约为 0.5 立方厘米的组织块。然后用纸巾将组织块吸干。接着将四个组织块转移至一个35毫米的培养皿中。加入3.8%琼脂糖溶液，直至所有组织块完全浸没。琼脂糖溶液凝固后，切出组织块。用手术刀沿培养皿边缘划开，去除琼脂糖，并小心分离组织块。为切片组织，需将组织块粘附于振动切片机的金属板上。将切片盘安装到仪器的载物台上，然后向盘中加入基础缓冲液。将振动切片机设置为自动切片，厚度为120微米，并调整起始和终止位置。现在将刀片移至组织上方稍高处。以0.8毫米的振幅在低速下开始切片。使用小刷子将切片收集到含有抑肽酶的对照缓冲液中，孵育1小时。将切片置于低速旋转的摇床上，以充分洗去切片过程中释放的酶类物质。为检测组织活性，将单个组织切片转移至含有990微升基础缓冲液的12孔板的一个孔中。随后用移液器将荧光素二乙酸酯加入该孔中。向组织切片中加入10微升碘化丙啶，该碘化丙啶已用990微升磷酸盐缓冲液（PBS）稀释。然后将切片浸入另一孔中的 PBS 中，持续一分钟。最后，将切片置于载玻片上，加盖盖玻片用于成像。在新切割的胰腺组织中观察到 80% 至 90% 的存活率。由于细胞损伤，切割表面的细胞活力降低。延迟切片导致活力下降。开始时，先打开灌流装置，启动灌流软件，输入腔室数量，然后标记输入溶液。现在连接灌注装置的流入和流出管路。接着，在体视显微镜下放置三个包埋在琼脂糖中的人胰腺组织切片。使用毛刷和手术刀将组织周围的琼脂糖尽可能修剪至最少。在切片室的网格上加入一滴基础缓冲液。轻轻地将每个切片转移至各自的网格上。从上到下组装切片室的各个部件。为研究分离的胰岛，每次胰岛素分泌实验至少使用每列30个胰岛，胰高血糖素检测则需100个胰岛，并将胰岛加入盛有基础缓冲液的腔室中。拧紧盖子以封闭胰岛腔室。接着，点击“步骤”选项卡，输入行数，将每步时间设置为90分钟，然后点击“应用”。添加所有溶液的步骤后，点击“概览”选项卡以查看实验方案的概览。点击“板图”选项卡以查看板的可视化图示。开始使用加载溶液对细胞进行预处理。灌流过程中使用腔室加热和托盘冷却泵。监测腔室以确保准确的流速和气泡情况。在实验方案进行过程中更换收集板。将托盘置于 4 摄氏度保存，用于当天定量分析。灌注完成后，拆卸灌流室，将各部件轻轻翻转至含有基础缓冲液的培养皿中以收集脑片。随后将脑片转移至离心管中，用于裂解或固定。用清水、10% 次氯酸钠溶液以及水和空气的组合冲洗仪器以进行清洁。将制备好的钙染料溶于3厘米宽的培养皿中的3毫升基础HEPES缓冲液中，并在稀释后的染料溶液中加入抑肽酶。然后将单个脑片转移至该溶液中。将切片置于室温下，在避光环境中于旋转摇床上孵育30分钟至1小时。在此期间，连接装满灌注液的注射器和管路。打开仪器加热器，并将泵的流速调节至0.5毫升每分钟。现在，轻轻地将一片样本放入共聚焦显微镜的成像室中。用网格固定器固定切片。将进液和出液管路连接到成像室，然后启动泵。使用反射模式在低倍镜下确定成像区域，然后切换至高倍物镜并相应调整位置。将分辨率设置为至少256×256，成像时间间隔设为5-10秒，Z轴扫描范围设为30-60微米，层间间隔为10微米。根据实验要求，在开始成像时切换溶液。在活性脑片中观察到动态的激素分泌，从而引起显著的胰岛素分泌。组织质量较差且切片时间延迟的样本，对高浓度葡萄糖和膜去极化的反应减弱或完全消失。通过钙成像过程中荧光强度变化生成的热图显示，在切换至高浓度葡萄糖后出现了响应性细胞。

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