高速原子力显微镜成像技术用于DNA三点星形结构自组装的光热非共振轻敲模式研究

在我们的实验室中，我们致力于开发用于纳米尺度生物学的新测量技术。特别是，我们专注于高速原子力显微镜的开发，以研究纳米尺度下的动态生物过程。为此，我们近期开发了一种新的成像模式，称为光热非共振轻敲模式（Photothermal Off Resonance Tapping，简称 PORT）。

在此模式下，我们使用专用的驱动激光器以高速精确控制悬臂的运动，从而实现比传统非共振轻敲模式快两个数量级的数据采集速度。高速原子力显微镜的金标准是共振模式成像。在此模式中，悬臂在其共振频率下被激发，这意味着无法控制悬臂的具体位置，只能控制其振荡幅度。

对于常规速度的原子力显微镜（AFM），非共振模式正变得越来越常见。然而，此处的驱动频率受到限制，导致这类成像模式速度较慢。通过使用第二束激光来驱动悬臂，可以实现更高的驱动频率，从而获得更高的成像速度。

这种方法使我们能够保持与其他非共振工作模式相关的优点，意味着可以优化成像灵敏度与速度之间的平衡。成像速度受限于最高的图像分辨率。如果我们希望提高分辨率，则需要增加激光功率，以维持相同的驱动振幅。

这可能导致力控不佳并对样品造成损伤。通过减小悬臂梁尺寸并提高激光吸收效率来提升其带宽，将使我们能够在确保足够样品间距的同时实现更高的通量速率。这一进步将有助于实现更快的成像速度，这对于研究组装动力学的复杂细节至关重要。

首先，清洁并准备悬臂梁。将悬臂梁安装在与扫描电子显微镜（SEM）系统兼容的样品 holder 上。然后加热气体注入系统中用于生长新探针尖端的前驱气体。

当真空度达到低于10的负5次方毫巴时，对气体注入管线进行10次 purge 操作，每次持续2秒，以清除喷嘴管线中的任何残余空气。使用扫描电子显微镜（SEM）定位悬臂的末端。倾斜样品台至适当角度，以正确对齐悬臂，便于进行原子力显微镜成像。

调整扫描电镜（SEM）的位置和焦距，以清晰观察将在其上生长碳纳米尖的悬臂梁尖端。接着，在软件中设置沉积参数以生长新的尖端。启动沉积过程，通过电子束辐照悬臂梁尖端的同时注入前驱气体，待沉积完成后停止气体注入。

进行生长后扫描电镜成像，以评估新生长尖端的质量和特征，包括其半径和长度。从扫描电镜腔室中取出样品台。首先，准备一台高速原子力显微镜。

使用镊子将超短悬臂梁置于悬臂梁支架的弹簧夹下方。用注射器通过左侧液体入口加入 50 µL 液体。然后调节原子力显微镜头部的三个旋钮，使读出激光对准悬臂梁。

在最大化总和的同时，观察悬臂在白纸上的阴影。然后使用两个专用旋钮将激光光斑居中对准光电二极管。接下来，在激励VI中勾选“启用激励”复选框，以打开并准直驱动激光，使悬臂被激励并产生振荡。

在示波器上显示悬臂梁的激发和偏转信号。使用阴影法，并通过调节驱动激光的旋钮使振荡幅度最大化。若需在端口内调节悬臂梁振荡幅度，可在激发VI的配置箱中向激光二极管控制电路添加直流电压，并输入激光二极管控制电路的交流峰峰值输入信号。

为了获得相互作用曲线，将Z控制器VI设置为接触模式，然后单击“开始”以接近样品表面。一旦接触到表面，使用斜坡VI进行力-距离曲线扫描，以校准悬臂梁偏转灵敏度。单击“撤回”以将Z压电元件从表面 retract，使探针无法再次接触表面。

完全回缩后，在Z控制器VI中切换至端口模式，并在激发VI中打开激发激光器。将端口模式设置为所需频率。通过从接触振荡中减去自由振荡来获得清晰的相互作用曲线，这对于非破坏性生物样品成像至关重要。在100千赫兹端口速率下，获得了良好的成像质量。

然而，当激发频率接近悬臂梁共振频率时，反馈控制性能下降，导致相互作用曲线模糊，成像质量降低。首先，配制10毫摩尔的乙酸镁溶液。使用汉密尔顿注射器将50微升该溶液注入悬臂梁支架的流体通道中，形成一滴液体包裹住悬臂梁。

将扫描VI中的扫描尺寸设置为800乘以800纳米，扫描线速率为100赫兹。为扫描表面，点击帧箭头以检查成像质量。扫描完成后，点击Z控制器VI中的“withdraw”按钮，使悬臂从表面 retract。

使用 Hamilton 注射器从悬臂梁支架中移除缓冲液。然后制备稀释的 DNA 三点星形结构溶液，并向悬臂梁支架中注入 50 µL 该溶液。以 800 × 800 纳米的扫描区域和默认 100 赫兹的扫描速率进行成像。

完成初始扫描后，调整成像尺寸和速度，并将 VI 设置为指定值以进行进一步的数据采集。在整个成像过程中，保持 Z 控制器 VI 设定点框中设定点输入处于准确跟踪所需的最低水平。对所有需要的样品区域重复此操作。通过使用本方案，利用高速原子力显微镜实时观察了 DNA 三点星形结构单元组装成稳定岛状结构的过程。

在100千赫兹端口速率下，以100赫兹和200赫兹的行速率获得了清晰的图像。然而，在不提高端口速率的情况下进一步提高成像速度，由于表面形貌快速变化，导致图像质量下降。DNA三点星结构在最低峰峰值交流输入下的成像结果显示结构完整，而最高峰峰值交流输入则因作用力较大导致样品出现可观察到的损伤。

类似地，最低的直流偏置输入显示出完整的结构，而最高的直流偏置输入则导致了结构损伤。