利用光热非共振敲击对 DNA 三点星基序自组装进行高速原子力显微镜成像
March 22nd, 2024
在这里，我们展示了观察生物分子与光热非共振敲击 （PORT） 相互作用的成像方案，其中我们优化了成像参数，确定了系统限制，并研究了成像三点星 DNA 基序组装的潜在改进。
在我们的实验室，我们为纳米级生物学开发新的测量技术。我们特别专注于开发高速原子力显微镜，以研究纳米级的动态生物过程。为此，我们最近开发了一种新的成像模式，我们称之为光热关闭共振轻敲或 PORT。
在这种模式下，我们使用专用的驱动激光器以非常高速的方式驱动悬臂，这使我们能够获得数据，并且比传统的非谐振攻丝快两个数量级。高速 AFM 的黄金标准是共振模式成像。在这种模式下，悬臂以这个谐振频率驱动，这意味着悬臂位置无法控制，只能控制其振荡幅度。
对于正常速度 AFM，非谐振模式越来越常见。但是，这里的驱动频率是有限的，这使得这种成像模式非常慢。通过使用辅助激光器来驱动悬臂，我们可以实现更高的驱动频率，这意味着更高的成像速度。
这种方法使我们能够保持与其他非谐振人员配置模式相关的优势，这意味着我们可以优化成像灵敏度和速度之间的平衡。我们的成像速度受到最高肖像的限制。如果我们想增加肖像，我们需要增加激光功率以保持相同的驱动幅度。
这可能导致力控制不佳和样品损坏。通过减小悬臂尺寸和提高激光吸收效率来增强悬臂的带宽，这将使我们能够获得更高的端口速率，同时确保足够的样品间隙。这一进步将促进更快的成像速率，这对于研究装配动力学的复杂性至关重要。
首先，清洁并准备悬臂。将悬臂安装在与扫描电子显微镜或 SEM 系统兼容的支架上。然后加热要用于气体喷射系统的前驱体气体，以长出新的尖端。
一旦真空度低于 10 到负 5 毫巴的幂，吹扫气体喷射管路 10 次，每次 2 秒钟，以去除喷嘴管路上的任何残留空气。使用 SEM 找到悬臂的末端。将支架倾斜一定角度，以正确对准悬臂以进行原子力显微镜成像。
调整 SEM 的位置和焦点，以便清楚地看到悬臂尖端将生长碳纳米尖端的位置。接下来，在软件中设置沉积参数以长出新针尖。在注入前驱体气体的同时，通过悬臂尖端上的电子束辐射启动沉积过程以长出尖端，并在沉积完成后停止气体注入。
进行生长后 SEM 成像，以评估新生长的尖端的质量和特性，包括其半径和长度。从 SEM 腔室中取出支架。首先，准备一台高速原子力显微镜。
使用镊子将超短悬臂放在悬臂支架上的弹簧夹下方。使用注射器，通过左侧液体进路端口加入 50 μL 液体。然后使用 AFM 头上的三个旋钮将读出激光器对准悬臂上。
观察白纸上悬臂的阴影，同时最大化总和。然后使用两个专用旋钮将激光光斑置于光电二极管的中心。接下来，选中激发 VI 中的激发启用框，以打开并对齐驱动激光器，驱动和振荡悬臂。
在示波器上显示悬臂激励和偏转信号。使用阴影方法，并通过驱动激光调节旋钮最大化振荡幅度。要调整端口中的悬臂振荡幅度，请在激励VI的配置框中为半导体激光管控制电路添加直流电压，并输入半导体激光管控制电路的峰峰值交流输入。
要获得交互曲线，请将 Z 控制器 VI 设置为接触模式，然后单击开始以接近样品表面。到达表面后，在斜坡 VI 中执行力与距离曲线，以进行悬臂偏转灵敏度校准。单击 Withdraw（撤回）以将 Z 压电陶瓷从尖端无法触及的表面缩回。
完全缩回后，在 Z 控制器 VI 中切换到端口模式，并在激发 VI 中打开激发激光器。通过从接触振荡中减去对无损生物样品成像至关重要的自由振荡，获得清晰的相互作用曲线。在 100 kHz 端口速率下，实现了良好的成像质量。
然而，当激励频率接近悬臂谐振时，反馈控制恶化，导致相互作用曲线模糊和图像质量下降。首先，制备 10 毫摩尔的乙酸镁溶液。使用 Hamilton 注射器，将 50 微升溶液注入悬臂支架的流体通道中，形成一滴包裹悬臂的液体。
将扫描 VI 中的扫描大小设置为 800 x 800 纳米，将线速设置为 100 赫兹。要扫描表面，请单击框架箭头以检查质量。扫描后，单击 Z 控制器 VI 中的撤回，将悬臂从表面缩回。
使用 Hamilton 注射器，从悬臂支架中取出缓冲溶液。然后制备稀释的 DNA 三点星形溶液，并将 50 μL 该溶液注入悬臂支架中。以 100 赫兹的默认线速率执行 800 x 800 纳米区域的成像。
初始扫描后，调整成像大小和速度，并将扫描 VI 调整到指定值以进行进一步数据采集将 Z 控制器 VI 设定点框中的设定值输入保持在整个成像过程中准确跟踪所需的最低水平。对所有必需的样品区域重复此作。使用该协议，通过高速端口 AFM 观察到 DNA 三点星形基序实时组装成稳定岛。
在 100 和 200 赫兹线路速率下，以 100 kHz 的端口速率获得清晰的图像。但是，由于地形的快速变化，在不增加端口速率的情况下提高成像速度会降低图像质量。最低峰峰值 AC 输入的 DNA 三点星成像结果显示结构完整，而最高峰峰值 AC 输入由于更大的力导致可观察到的样品损坏。
同样，最低的 DC 偏移输入显示结构完整，而最高的 DC 偏移输入会导致结构损坏。
概述
本文介绍了一种用于观察生物分子相互作用的成像协议，使用光热非共振敲击（PORT）。该研究集中在优化成像参数和探索三点星形DNA基序组装中的潜在改进。
关键研究组成部分
科学领域
- 纳米生物学
- 高速原子力显微镜
- 生物分子相互作用
背景
- 生物过程的新测量技术的开发。
- 重点关注高速原子力显微镜（AFM）。
- 引入一种新的成像模式，称为PORT。
- 与传统的非共振敲击技术的比较。
研究目的
- 优化PORT的成像参数。
- 确定成像过程中的系统限制。
- 探究DNA基序组装成像的改进。
使用的方法
- 高速原子力显微镜。
- 光热非共振敲击（PORT）成像模式。
- 使用专用驱动激光控制弹簧片的驱动。
- 以比传统方法显著更快的速度进行数据采集。
主要结果
- 成功实施PORT用于生物分子相互作用成像。
- 确定了最佳成像参数。
- 对三点星形DNA基序的组装有了洞察。
- 展示了成像速度和控制的改进。
结论
- PORT增强了高速AFM在研究生物分子相互作用方面的能力。
- 优化的成像参数可以带来对DNA组装的更好理解。
- 未来的改进可以进一步增强纳米生物学中的成像技术。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-speed atomic force microscopy (HS-AFM) with Photothermal Off-Resonance Tapping (PORT) enables real-time visualization of biomolecular assembly under physiological conditions, addressing a critical need for dynamic, quantitative imaging in early discovery. The ability to directly control tip-sample forces and optimize imaging parameters supports predictive confidence in molecular interaction studies, facilitating robust target validation and mechanistic de-risking. This capability strengthens the translational bridge from molecular discovery to preclinical model development, enhancing portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of biomolecular assembly dynamics at the single-molecule level.
- Supports mechanistic de-risking by revealing real-time structural changes during motif formation.
- Provides quantitative force and topography data for functional target validation.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of molecular pathways relevant to disease mechanisms.
Screening & Assay Development
- Delivers reproducible, high-speed imaging of delicate biomolecular structures for assay standardization.
- Enables optimization of imaging parameters to ensure reliable, quantitative outputs for downstream workflows.
- Supports scalability and platform reuse by defining operational limits and minimizing sample damage.
- Prepares validated biological systems for compound screening and evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant biomolecular assemblies for translational continuity.
- Provides high-resolution data to inform preclinical model selection and validation.
- Reduces risk of late-stage failure by clarifying molecular mechanisms underlying assembly processes.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative, real-time imaging data.
Pipeline & Workflow Integration
PORT-enabled HS-AFM integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, supporting iterative optimization and cross-functional data sharing.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by visualizing assembly events in real time.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging outputs for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Generates force and topography measurements to compare experimental conditions and optimize protocols.
- Translational Research: Connects molecular assembly data to disease-relevant systems for preclinical alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable imaging capability for repeated use across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of molecular imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs based on real-time molecular insights.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanoscale imaging and force spectroscopy for optimal parameter selection.
- Demands specialized instrumentation, including high-speed AFM and photothermal actuation systems.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data analysis workflows.
- May require adaptation of imaging parameters for different biomolecular systems or sample types.
- Thermal effects from drive laser and sample area limitations must be managed to prevent sample damage.
