表征多重耐药外排系统 鲍曼不动杆菌 利用外排系统-缺陷型细菌菌株与单拷贝-单拷贝基因表达系统

我们研究革兰氏阴性细菌中的多药耐药外排系统。我们关注这些外排泵的天然功能，以及它们如何可作为潜在的药物靶点。多药耐药外排系统的表达受到严格调控，这使得研究其功能变得困难。

因此，在表征这些泵时，绕过调控系统的表达系统可能非常有用。本方案可实现基因在通常自然条件下所见水平的表达，从而使其基因产物的活性与自然界中观察到的情况相似。

首先，将所有无菌的1.5毫升微量离心管和无菌电穿孔杯置于冰上。然后将保存在4摄氏度的无菌水瓶也放在冰上。取1.5毫升过夜培养的细菌培养物，转移至其中一个1.5毫升微量离心管中，在13,000 G离心2分钟，使细胞形成沉淀。

使用1毫升移液器，去除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。向同一微型离心管中加入1.5毫升细菌培养物。在13,000 G条件下离心2分钟，然后去除上清液。

向细胞沉淀中加入1毫升冰上预冷的无菌水，轻轻吹打重悬，直至沉淀不再沉积在微量离心管底部。将重悬的细胞在13,000 G离心2分钟，然后用1毫升移液器小心吸除上清液。用200微升冰上预冷的无菌水轻轻重悬最终的细胞沉淀，并将100微升最终细胞悬液转移至另一支预冷的1.5毫升微量离心管中。

将每份样品和对照的1毫升LB液体培养基以及含庆大霉素的LB琼脂平板置于37摄氏度的静止培养箱中预热。在总体积不超过5微升的条件下，向一份电转化感受态细胞中加入100至200纳克的pTNS2辅助质粒和100至200纳克的pUC18T-mini-Tn7 tlac 庆大霉素AdeIJK插入质粒。用手指轻轻弹击管壁，确保质粒与电转化感受态细胞充分混匀，同时避免产生气泡。

向阴性对照细胞等分试样中加入等体积的无菌蒸馏水，并如前所述轻轻混匀。将样品置于冰上孵育20分钟。将全部细胞样品转移至预冷的电穿孔比色皿中，然后将比色皿放回冰上。

为了对细胞样品进行电穿孔，打开电穿孔仪并将其设置为两千伏。用柔软的纸巾擦拭电穿孔杯表面，以去除附着的冰或水分。将电穿孔杯插入电穿孔仪中，并施加电脉冲。

立即将 0.9 毫升预热的 LB 肉汤加入电转杯中的细胞中，轻轻吹打混匀细胞与培养基。将全部细胞悬液转移至一支新的 1.5 毫升离心管中，于室温下放置。然后检查电穿孔仪上的时间常数数值。

为了获得最佳结果，该值应介于四到六之间。将电穿孔后的样品在37摄氏度、250 RPM条件下孵育一小时，以促进细胞恢复。一小时后，使用接种涂布器将每个样品的100微升涂布于预热的LB加庆大霉素平板上。

将平板在 37 摄氏度下孵育 16 至 18 小时。检查电穿孔平板。使用无菌牙签，从 LB 加庆大霉素琼脂平板上挑取最多 10 个单菌落，并将其转接到新的 LB 加庆大霉素琼脂平板上。

将平板在 37 摄氏度下孵育 16 至 18 小时。将转化平板上的菌落转接到选择性培养基上，可保存转化菌株，并为菌落 PCR 筛选提供起始材料。筛选引物 ABglmS2 正向新引物与 Tn7 反向引物的 PCR 产物为 382 个碱基对。

该反应的阴性对照包括野生型鲍曼不动杆菌ATCC 17978、AB 258以及无模板对照。