Name: 小鼠锁骨上棕色脂肪组织的解剖、组织学处理及基因表达分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-29T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: 学习小鼠锁骨上棕色脂肪组织的解剖、组织学处理及基因表达分析方法。该方案利用显微镜精确分离组织，并通过苏木精-伊红染色和定量PCR技术，为研究棕色脂肪在代谢中的功能提供可靠实验基础。

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本研究由美国国立卫生研究院国家糖尿病、消化及肾脏疾病研究所（NIDDK）资助项目编号 R01DK116899、美国农业部/农业研究局（USDA/ARS）资助项目编号 3092-51000-064-000D，以及贝勒医学院心血管研究所的试点项目资助。流程图使用 BioRender 软件制作。

动物实验程序已获得贝勒医学院机构动物护理和使用委员会的批准。所有实验均在3周龄和3月龄的C57BL/6J雄性小鼠上进行。在解剖前，所有小鼠均采用经批准的啮齿类动物二氧化碳安乐死程序实施安乐死。有关本实验方案中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息，请参见材料表。
1. scBAT 的分离
<ol>
	<li>将小鼠尸体置于工作台，用70%乙醇清洁手术剪和超细尖镊子。</li>
	<li>用70%乙醇喷洒小鼠腹侧颈部，润湿毛发，以减少毛发污染。</li>
	<li>沿锁骨做约1.5 cm的双侧切口。</li>
	<li>从上一切口两端向耳朵方向纵向剪开，长约1 cm，形成围绕颈部的方U形切口（图1A、B）。 
	注意：scBAT位于颈部中间层。此步骤暴露的是表层结构，包括皮肤、皮下脂肪组织和唾液腺。中间层包含颈静脉和颈部肌肉，scBAT即位于此层。去除骨骼肌后可暴露颈部深层结构，包括深层颈BAT、动脉和颈静脉。</li>
	<li>将小鼠置于解剖显微镜下，调焦使暴露的颈部清晰可见（图1C）。 
	注意：此额外步骤可显著提高组织采集的精确度，鉴于scBAT体积较小，该步骤十分必要。</li>
	<li>用镊子提起切开的皮肤部分，充分暴露唾液腺。</li>
	<li>使用手术剪和镊子，分离唾液腺与锁骨周围组织之间的连接，以及唾液腺彼此之间的连接。</li>
	<li>提起唾液腺以暴露scBAT脂肪库。沿外颈静脉寻找BAT，其可能与唾液腺底面相连。根据其橙色外观识别，该颜色与周围组织形成明显对比。</li>
	<li>用镊子夹住目标脂肪组织，轻轻从唾液腺上剥离。</li>
	<li>一旦与唾液腺分离，继续将scBAT从外颈静脉和颈部肌肉中分离，直至可完整取出颈部两侧的脂肪库。</li>
	<li>在解剖显微镜下检查每份分离的scBAT样本（图1D、E），使用镊子去除任何残留的结缔组织。</li>
	<li>将每份样本放入含有10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）的玻璃闪烁瓶中，并将小鼠移出显微镜下。</li>
</ol>
2. scBAT 的处理及苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色（见图2A）
<ol>
	<li>用 10 mL 冷的 4% 多聚甲醛（PFA）替换 PBS（步骤 1.12），将小瓶置于摇床上，4 °C 条件下轻轻摇动过夜，以固定 scBAT。 
	注意：当需要对出生后尤其是成年小鼠进行免疫组织化学分析时，可采用灌注固定法。</li>
	<li>次日，用无菌移液管从小瓶中移除 PFA 溶液，并加入 10–15 mL PBS。将小瓶置于摇床上，室温摇动 30 分钟。随后用 0.85% 盐水溶液替换 PBS，并继续在室温下摇动 30 分钟。 
	注意：该盐水溶液为 0.85%（w/v）NaCl 溶于 DEPC 处理水（无 RNase）中。在此步骤及后续步骤中，可用 PBS 替代盐水溶液。</li>
	<li>用移液管移除 0.85% 盐水，向小瓶中加入 10 mL 70% 乙醇/0.85% 盐水溶液。将小瓶置于 4 °C 冰箱中过夜或保存至准备进行石蜡包埋。 
	注意：若无 0.85% 盐水，可用 PBS 替代。scBAT 应尽快处理，以便于切片并更好地保持组织形态。</li>
	<li>在进行石蜡包埋前，通过一系列乙醇置换步骤对 scBAT 进行脱水，以去除组织中的水分。
	<ol>
		<li>首先，用移液管从小瓶中移除 70% 乙醇/0.85% 盐水，加入 10–15 mL 95% 脱水酒精，在摇床上室温摇动 1 小时。重复此步骤一次。 
		注意：可使用乙醇替代脱水酒精溶液。</li>
		<li>接着，将 95% 脱水酒精替换为 10–15 mL 100% 脱水酒精，继续在摇床上摇动 1 小时。更换新的 100% 脱水酒精后，根据小瓶中 scBAT 的数量，继续摇动数小时或过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为便于包埋，向小瓶中加入 10 mL 二甲苯，继续在摇床上摇动，直至 scBAT 变得透明，约需 6–8 小时。 
	注意：达到理想透明效果所需时间取决于 scBAT 的大小。建议清晨开始透明处理，以便下午进行浸蜡和包埋。</li>
	<li>将 scBAT 进行石蜡包埋时，先移除二甲苯，加入 10 mL 熔化的浸蜡石蜡，将小瓶置于 65 °C 烤箱中 1 小时。更换新石蜡后重复此步骤一次。 
	注意：建议在包埋前一晚将石蜡颗粒放入烤箱中熔化，以确保石蜡完全液化。</li>
	<li>将浸蜡石蜡替换为包埋石蜡，将小瓶在相同温度下放置 1 小时。重复此步骤一次。 
	注意：浸蜡步骤可中断并在之后继续。将小瓶从烤箱中取出，室温保存，待准备继续时再进行操作。</li>
	<li>进行组织包埋时，先将组织放入组织包埋模具中，加入熔化的包埋石蜡，并在体视显微镜下调整组织方向。然后将包埋盒置于石蜡上方，并继续倾倒包埋石蜡直至填满，将包埋盒盖固定在石蜡块上。将石蜡块转移至 4 °C 冰箱中过夜，使石蜡硬化并收缩，之后再移除金属模具。</li>
	<li>使用切片机将 scBAT 切成 5–6 µm 厚度18，每张载玻片贴 3–4 片切片，并将载玻片放入约 42 °C 的温热石蜡切片漂浮浴中，使组织切片展平。</li>
	<li>将切片转移至载玻片上，并将载玻片垂直靠在漂浮浴旁，使水分从载玻片上滴落。</li>
	<li>将载玻片转移至不锈钢染色架上，并将染色架置于载玻片干燥台上过夜干燥。 
	注意：石蜡切片可在室温下长期保存，直至进行后续处理。</li>
	<li>进行 H&amp;#38;E 染色19。首先将载玻片放入染色架中，再将染色架浸入含二甲苯的染色缸中 40 秒。重复此步骤一次。 
	注意：若经过两步处理后仍可见石蜡残留，需等待其完全溶解后再继续操作。</li>
	<li>为使组织复水，将染色架依次浸入盛有 100% 脱水酒精的染色缸中两次，每次 20 秒；随后在 95% 脱水酒精中处理 15 秒，最后用 ddH2O 冲洗 15 秒。</li>
	<li>将载玻片放入盛有苏木精染液的染色皿中染色 75 秒以实现细胞核染色，然后在另一盛有 ddH2O 的染色皿中冲洗 45 秒。 
	注意：可根据所需染色深浅调整染色时间。</li>
	<li>通过将载玻片浸入盛有盐酸乙醇溶液的染色皿中 15 秒进行分化，然后将载玻片转移至另一 ddH2O 中冲洗 15 秒。 
	注意：盐酸乙醇溶液的配制方法依据已发表文献19。</li>
	<li>为进行细胞质染色，将载玻片浸入伊红 Y 复染液中 15 秒。</li>
	<li>通过将载玻片依次浸入三缸 95% 脱水酒精溶液中（每缸 15 秒）进行脱水，随后再依次浸入两缸 100% 脱水酒精中——第一缸 15 秒，第二缸 45 秒——完成脱水过程。</li>
	<li>最后，将载玻片转移至二甲苯中浸泡 45 秒，使组织重新适应有机溶剂。此步骤完成后即完成染色；将组织从溶液中取出。</li>
	<li>在每张载玻片上滴加封片剂，并在化学通风橱内加盖盖玻片。过夜干燥后进行成像。成像结果见 图 2B。</li>
</ol>
3. scBAT 的基因表达分析
<ol>
	<li>组织采集（研磨）
	<ol>
		<li>解剖获取scBAT后，立即将组织放入微量离心管中，用无菌针头在管盖顶部刺一个小孔，随后在液氮中快速冷冻。 
		注意：此处概述的实验方案主要步骤已在图中示意。 图3A在将试管放入液氮之前，先在管盖顶部戳一个小孔，以防止因压力骤变导致试管破裂。</li>
		<li>将液氮倒入塑料烧杯中，并将研钵和薄刮勺浸泡其中。 
		注意：在整个操作过程中，必须尽可能保持所有工具和组织样本处于接近液氮温度的低温状态，以防止组织解冻。解冻后的脂肪组织具有很强的黏附性，会增加研磨成粉的难度。工具和样本仅可在使用前立即从液氮中取出。</li>
		<li>一次取一个速冻组织样本，将其从微量离心管中倒入研钵中。</li>
		<li>向研钵中加入少量液氮，然后用研杵研磨冷冻组织，直至完全粉碎。 
		注意：如果组织在任何阶段开始变软或发黏，说明正在解冻；此时应向研钵中倒入更多液氮。</li>
		<li>使用细刮勺小心刮取研磨后的组织，并转移回微量离心管中。刮取时向研钵中倒入液氮，以收集残留的组织碎片，再用刮勺一并转移。重复上述转移步骤，直至将研钵中的所有组织完全移出。</li>
		<li>使用轻质擦拭纸和70%乙醇在研磨下一个样品前清洁研钵。将粉末状组织长期保存于-80 °C冰箱中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>总RNA提取
	<ol>
		<li>准备
		<ol>
			<li>用70%乙醇和表面去污染剂清洁工作台、移液器、吸头架和试管架，以去除RNase。</li>
			<li>启动离心机，使温度降至 4 °C。</li>
			<li>将洗脱液预热至 70 °C。</li>
			<li>将DNase I工作液与DNase稀释液按每份样品5 μL重组DNase I加75 μL DNase稀释液的比例混匀稀释。稀释后的DNase I溶液置于冰上，待用。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>实验步骤
		<ol>
			<li>为每个样本标记两个微量离心管、两个柱保留管（两个无盖带刻度的微量离心管）和一个结合微型柱。</li>
			<li>向每个样品中加入500 μL RNA提取液，并使用研磨杵电机超声处理30 s。</li>
			<li>为每个样品准备一支注射器，上下吹打10次以进一步裂解组织。确保注射器处理后无可见固体残留。</li>
			<li>加入250 μL氯仿，室温孵育5分钟，期间偶尔涡旋振荡。</li>
			<li>21,000 × 离心 g 4 °C 下孵育 20 分钟。</li>
			<li>将上层水相转移至新的微量离心管中，并加入等体积的70%乙醇（约500 μL）。 
			注意：上层水相应为澄清，下层应为红色的RNA分离溶液，两层之间可能存在一些不需要的固体物质。</li>
			<li>将500 μL新鲜裂解液转移至结合柱中。在18,000 × g 60秒后弃去滤液。</li>
			<li>用剩余的裂解液重复上一步骤，以将所有RNA转入结合柱中。</li>
			<li>向结合柱中加入700 μL低严谨性洗涤液，离心30 s，弃去滤液。</li>
			<li>向每个结合柱中加入 80 μL 稀释的 DNase I。室温孵育 15 分钟。</li>
			<li>加入700 μL高严谨性洗涤液，离心30秒，弃去滤液。</li>
			<li>加入700 μL低严谨性洗涤液，离心60秒，弃去滤液。</li>
			<li>将结合柱转移至2nd 更换无盖收集管，离心2分钟，以确保从结合柱中完全去除所有液体。</li>
			<li>将结合柱转移至新的微量离心管中，加入30 μL预热的洗脱液。室温孵育1分钟。</li>
			<li>离心2分钟，使洗脱的RNA聚集于微量离心管底部。</li>
			<li>使用分光光度计测定总RNA浓度。 
			注意：如果总RNA纯度较低，表现为260/280比值低于2.0或260/230比值低于1.8，则在步骤3.2.2.12之后，可先用低严谨性洗涤液再洗涤一次，随后用80%乙醇洗涤，然后继续进行步骤3.2.2.13。</li>
			<li>将RNA储存于-80 °C冰箱中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>逆转录（RT）
		<ol>
			<li>在PCR管条中，将用DEPC处理水稀释的0.5–1 μg总RNA分别加入不同的孔中，每份RNA样本总体积为8 μL。 
			注意：反转录所用RNA的量可根据制造商说明书进行相应调整。</li>
			<li>向每个PCR管中的样品加入1 μL Oligo dT和1 μL dNTPs，确保每个样品的总体积为10 μL。</li>
			<li>将PCR管条放入热循环仪中，设置为65 °C反应5分钟，随后降至4 °C并无限期保持。</li>
			<li>65 °C孵育5分钟后，取出PCR管条，将管子置于冰上至少2分钟。冰上孵育后，加入五种试剂：4 μL 5x第一链缓冲液、2 μL 25 mM MgCl₂、1 μL 100 mM DTT、1 μL 10 mM dNTP混合物和1 μL（200单位）逆转录酶。2，向每个样品中加入2 μL 0.1 M DTT、1 μL RNase抑制剂和1 μL逆转录酶。确保每个样品的总体积为20 μL。</li>
			<li>将PCR管条放回热循环仪中，设置程序为50 °C反应50分钟，然后85 °C反应5分钟，最后4 °C持续保温。</li>
			<li>当程序降至 4 °C 时，取出反应条，加入 1 μL 核糖核酸酶 H（RNase H）。 
			注意：RNase H 用于去除反转录反应中残留的任何RNA模板；在此步骤中，目标RNA应已转化为cDNA。</li>
			<li>将条带放回热循环仪，于37 °C反应20分钟，随后在4 °C无限期保存。</li>
			<li>反转录完成；使用分光光度计测定cDNA浓度。</li>
			<li>将cDNA稀释至250 ng/μL；将cDNA储存于-80 °C或-20 °C冰箱中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>定量聚合酶链式反应（qPCR）
		<ol>
			<li>制作一个电子表格，用于整理每个引物和样本在96孔qPCR板上的位置。 
			注意：其中一个引物需要针对参考基因，用于标准化所有其他目标基因的表达，例如 36B4.</li>
			<li>为每个样本配制引物主混合液 &#34;引物 + 样本&#34; 组合。向每个qPCR反应孔中加入3 μL分子生物学级水、5 μL qPCR酶预混液、0.5 μL正向引物和0.5 μL反向引物，每孔总体积为9 μL。再向每孔加入1 μL cDNA，使每孔反应总体积达到10 μL。 
			注意：每个样本的标准设置为三个技术重复 &#34;引物 + 样本&#34; 因此，每种混合液的配制量应为上述试剂用量的4倍。</li>
			<li>每个重复取1 μL cDNA加入相应的引物预混液中。如果每种预混液为4倍浓度，则将4 μL的每种样本cDNA移液至各自标记的离心管中。</li>
			<li>最后，根据电子表格确定的位置，将每种反应混合物各10 μL用移液器加入96孔qPCR板中。</li>
			<li>用厚胶粘封板膜密封，然后在450 × g 在 20 °C 下孵育 2 分钟。 
			注意：必须确保板完全密封，以防止样品在热循环过程中蒸发。使用轻质擦拭纸将密封膜压紧到板上，尤其是边缘部分。</li>
			<li>在实时荧光定量PCR仪中运行PCR反应板。根据试剂盒说明书设置PCR反应程序：50 °C孵育2 min，随后95 °C孵育2 min，最后进行40个循环，每个循环包括95 °C变性15 s和60 °C退火延伸30 s。qPCR基因表达分析结果如图所示 图3B.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Morphological and Molecular Characterization of the scBAT in Mice

<ol><li>Boutari, C., Mantzoros, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+2022+update+on+the+epidemiology+of+obesity+and+a+call+to+action%3A+as+its+twin+COVID-19+pandemic+appears+to+be+receding%2C+the+obesity+and+dysmetabolism+pandemic+continues+to+rage+on%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">A 2022 update on the epidemiology of obesity and a call to action: as its twin COVID-19 pandemic appears to be receding, the obesity and dysmetabolism pandemic continues to rage on.</a> Metabolism. 133, 155217(2022).</li>
<li>Hales, C. M., Carroll, M. D., Fryar, C. D., Ogden, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+obesity+and+severe+obesity+among+adults%3A+United+States%2C+2017-2018%5BTitle%5D)+AND+%22NCHS+Data+Brief%22%5BJournal%5D)">Prevalence of obesity and severe obesity among adults: United States, 2017-2018.</a> NCHS Data Brief. (360), 1-8 (2020).</li>
<li>Berry, D. C., Stenesen, D., Zeve, D., Graff, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+origins+of+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The developmental origins of adipose tissue.</a> Development. 140 (19), 3939-3949 (2013).</li>
<li>Wang, W., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+brown+and+beige+fat+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of brown and beige fat development.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (11), 691-702 (2016).</li>
<li>Maliszewska, K., Kretowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue+and+its+role+in+insulin+and+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue and its role in insulin and glucose homeostasis.</a> Int J Mol Sci. 22 (4), 1530(2021).</li>
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<li>Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sectioning+mammary+gland+whole+mounts+for+lesion+identification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Sectioning mammary gland whole mounts for lesion identification.</a> J Vis Exp. (125), e55796(2017).</li>
<li>Berry, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Imaging of adipose tissue.</a> Methods Enzymol. 537, 47-73 (2014).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

在本实验方案中，我们详细介绍了用于H&amp;#38;E染色和基因表达分析的scBAT解剖与处理步骤。由于scBAT位于颈部的中间层，并沿大静脉分布，因此分离该脂肪组织需要精确的操作技术。具体而言，为清晰观察该组织，建议在打开小鼠颈部后，将其置于体视显微镜下进行操作。使用超细尖镊子将scBAT从唾液腺及周围静脉上剥离时，应小心避免刺破静脉，过度出血会增加定位scBAT的难度。为进行H&amp;#38;E染色处理，我们参考了一项已发表的方案19，并稍作修改，包括在组织处理过程中使用4%多聚甲醛（PFA）、脱水用醇类以及有机溶剂甲苯，具体步骤见方案部分。整个流程约需6天完成，染色结束后次日即可对H&amp;#38;E染色切片进行成像。
以RNA为起始材料的逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）是脂肪组织生物学领域中最常用的基因表达分析方法。由于肩胛下棕色脂肪组织（scBAT）相对于肩胛间棕色脂肪组织（iBAT）体积较小，获取足量RNA用于基因表达分析较为困难。为提高RNA得率，我们建议按照本方案部分所述，采用逐步裂解液制备步骤，首先在组织仍处于冷冻状态时使用研钵和研杵将其研磨成粉。通过该裂解液制备方法，我们已成功从一只成年小鼠的scBAT中获得高产量、高质量的RNA样本，可用于基因表达分析。该裂解液制备方法也可用于制备高质量的scBAT蛋白裂解液，只需使用蛋白裂解缓冲液，即可用于后续的蛋白质印迹（western blotting）分析。
利用小鼠的肩胛间棕色脂肪组织（iBAT），研究人员已深入了解棕色脂肪组织在产热和代谢中的功能。近期在小鼠和人类中发现了一些先前未被识别的棕色脂肪组织库，包括皮下棕色脂肪组织（scBAT），这表明在全面理解棕色脂肪组织在小鼠和成年人体内的生理作用之前，仍需开展更多研究。特别是，有必要开展研究阐明这些新发现的棕色脂肪组织库的起源、功能及其在产热以及局部或全身代谢中的参与机制。

美国及全球肥胖症患病率的不断上升，引发了人们对了解其病因并寻找潜在治疗方法的极大兴趣1,2。脂肪组织在代谢过程中发挥着关键作用，脂肪组织功能失调可导致肥胖的发生。通常，脂肪组织分为两种类型：白色脂肪组织和棕色脂肪组织。白色脂肪组织（WAT）能够储存化学能并分泌内分泌因子，而棕色脂肪组织（BAT）则能够利用化学能产热，以在寒冷环境中维持体温3,4。由于这一独特功能，激活棕色脂肪组织还可增加能量消耗，并改善胰岛素敏感性5。
棕色脂肪组织（BAT）通过非颤抖性产热发挥作用，该过程由解偶联蛋白1（UCP1）介导6。包括小鼠和人类在内的哺乳动物体内含有数量不等的BAT。传统观点认为，这类脂肪组织在小鼠和婴儿中比在成人中更为丰富。位于肩胛间背部上方的iBAT是小鼠中最常被研究的BAT储存部位。通过放射性同位素成像和活检检测，近期研究在成人人体中鉴定出多个BAT储存部位。其中一些部位，如位于颈部深部和锁骨上区域的BAT，在小鼠或其他模式动物中此前并未发现7,8,9,10,11。在这些BAT储存部位中，锁骨上BAT（scBAT）是成人中最常见的部位。为了更好地理解人类中这些新发现BAT储存部位的起源及其分子贡献，关键在于在小鼠中鉴定出相应的等效部位，以便通过遗传和分子操作来追踪并验证这些部位的功能作用。因此，我们及其他研究者在小鼠不同解剖位置中鉴定出若干此前未知的BAT储存部位，包括scBAT12,13、胸主动脉周围血管BAT14,15、肾周BAT16以及主动脉周围BAT17。小鼠的scBAT在解剖位置上与人类scBAT相似，在形态上则类似于经典的iBAT，并高表达UCP112。
与易于分离的小鼠iBAT不同，scBAT位于小鼠颈部的中间层，处于唾液腺下方并沿颈外静脉分布。对该脂肪库进行组织学和分子分析的分离操作具有挑战性。本文中，我们详细描述了从小鼠出生后及成年小鼠中解剖scBAT并对其进行组织学和基因表达分析处理的实验步骤。

<table><tbody><tr><td>95% 脱水酒精（Flex 95）</td><td>Epredia</td><td>8201</td><td></td></tr><tr><td>100% 脱水酒精（Flex 100）</td><td>Epredia</td><td>8101</td><td></td></tr><tr><td>96 孔 PCR 板</td><td>Bio-Rad</td><td>MLL9601</td><td></td></tr><tr><td>Aurum 结合微型离心柱</td><td>Bio-Rad</td><td>7326826</td><td></td></tr><tr><td>Aurum 高严谨性洗涤液</td><td>Bio-Rad</td><td>7326803</td><td></td></tr><tr><td>Aurum 低严谨性洗涤液</td><td>Bio-Rad</td><td>7326804</td><td></td></tr><tr><td>包埋用基础模具（Base Molds）</td><td>Tissue-Tek</td><td>4122</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide 针头 21g x 1 1/2&quot;</td><td>Becton Dickinson</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch 梯度 PCR 仪</td><td>Bio-Rad</td><td>1840148</td><td></td></tr><tr><td>无盖微量离心管 2 mL</td><td>Fisherbrand</td><td>02-681-453</td><td></td></tr><tr><td>离心机&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td></td></tr><tr><td>CFX Opus 96 实时荧光定量 PCR 仪</td><td>Bio-Rad</td><td>12011319</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>383760010</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60 低黏度封片介质</td><td>Epredia</td><td>83104</td><td></td></tr><tr><td>DEPC 处理水</td><td>Ambion</td><td>AM 9906</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>DNase 稀释液</td><td>Bio-Rad</td><td>7326805</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Bio-Rad</td><td>7326828</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Invitrogen</td><td>18427013</td><td></td></tr><tr><td>洗脱液</td><td>Bio-Rad</td><td>7326801</td><td></td></tr><tr><td>EM 400 包埋介质石蜡</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801320</td><td></td></tr><tr><td>伊红 Y（0.5% w/v）</td><td>RICCA</td><td>2858-16</td><td></td></tr><tr><td>Formula R 浸润介质石蜡</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801470</td><td></td></tr><tr><td>Genemark Nutator Gyromixer 349</td><td>Bio Express</td><td>S-3200-2</td><td></td></tr><tr><td>Gill #3 苏木精</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GHS332-1L</td><td></td></tr><tr><td>HCl（用于 HCl-乙醇）</td><td>Fisher Chemical</td><td>A142212</td><td></td></tr><tr><td>IP VI 包埋盒</td><td>Leica Biosystems</td><td>39LC-550-5-L</td><td></td></tr><tr><td>Koptec 纯乙醇 - 200 证明（用于 70% 乙醇）</td><td>Decon Labs</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;（25 mM）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0971</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管 1.7 mL</td><td>Avantor</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Microseal 'B' 密封膜（粘性密封）</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>切片机</td><td>Leica Biosystems</td><td>RM2245</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学级水</td><td>Corning</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>研钵 Coors Tek</td><td>Thomas Scientific</td><td>60310</td><td></td></tr><tr><td>NaCl（用于 0.85% 生理盐水）</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 分光光度计</td><td>NanoDrop Technologies</td><td>ND-1000 UV/Vis</td><td></td></tr><tr><td>oligo dT</td><td>Invitrogen</td><td>18418020</td><td></td></tr><tr><td>石蜡切片漂浮浴</td><td>Boekel Scientific</td><td>14792V</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td></td></tr><tr><td>PCR 管条</td><td>Avantor</td><td>76318-802</td><td></td></tr><tr><td>Coors Tek 研杵</td><td>Thomas Scientific</td><td>60311</td><td></td></tr><tr><td>研杵电动研磨机</td><td>Kimble</td><td>749540-0000</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Precision Model 19 真空烘箱&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CAT# 51221162</td><td></td></tr><tr><td>引物：36B4&amp;nbsp;（正向）10 &amp;mu;M&lt;br/&gt; 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3&amp;rsquo;</td><td></td><td></td><td>Chen 实验室寡核苷酸数据库</td></tr><tr><td>引物：36B4（反向）10 &amp;mu;M&lt;br/&gt; 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3&amp;rsquo;</td><td></td><td></td><td>Chen 实验室寡核苷酸数据库</td></tr><tr><td>引物：Fabp4（正向）10 &amp;mu;M&lt;br/&gt; 5&amp;rsquo; ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3&amp;rsquo;</td><td></td><td></td><td>Chen 实验室寡核苷酸数据库</td></tr><tr><td>引物：Fabp4（反向）10 &amp;mu;M&lt;br/&gt; 5&amp;rsquo; CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3&amp;rsquo;</td><td></td><td></td><td>Chen 实验室寡核苷酸数据库</td></tr><tr><td>引物：Glut 4（正向引物）10 &amp;mu;M&lt;br/&gt; 5&amp;rsquo; CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3&amp;rsquo;</td><td></td><td></td><td>Chen 实验室寡核苷酸数据库</td></tr><tr><td>引物：Glut 4（反向）10 &amp;mu;M&lt;br/&gt; 5&amp;rsquo; GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3&amp;rsquo;</td><td></td><td></td><td>Chen 实验室寡核苷酸数据库</td></tr><tr><td>引物：PPARg（正向）10 &amp;mu;M&lt;br/&gt; 5&amp;rsquo; AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3&amp;rsquo;</td><td></td><td></td><td>Chen 实验室寡核苷酸数据库</td></tr><tr><td>引物：PPARg（反向）10 &amp;mu;M&lt;br/&gt; 5&amp;rsquo; AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3&amp;rsquo;</td><td></td><td></td><td>Chen 实验室寡核苷酸数据库</td></tr><tr><td>引物：Ppargc1a（反向）10 &amp;mu;M&lt;br/&gt; 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3&amp;rsquo;</td><td></td><td></td><td>Chen 实验室寡核苷酸数据库</td></tr><tr><td>引物：Ppargc1a（正向）10 &amp;mu;M&lt;br/&gt; 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3&amp;rsquo;</td><td></td><td></td><td>Chen 实验室寡核苷酸数据库</td></tr><tr><td>引物：Ucp1（正向）10 &amp;mu;M&lt;br/&gt; 5&amp;rsquo; AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3&amp;rsquo;</td><td></td><td></td><td>Chen 实验室寡核苷酸数据库</td></tr><tr><td>引物：Ucp1（反向）10 &amp;mu;M&lt;br/&gt; 5&amp;rsquo; ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3&amp;rsquo;</td><td></td><td></td><td>Chen 实验室寡核苷酸数据库</td></tr><tr><td>RNA 提取液（PureZol）</td><td>Bio-Rad</td><td>7326880</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away（表面去污剂）</td><td>Thermo Scientific</td><td>1437535</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>NEB</td><td>M0297S</td><td></td></tr><tr><td>RNase 抑制剂（RNase Out）</td><td>Invitrogen</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>闪烁瓶（玻璃）</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72632</td><td></td></tr><tr><td>载玻片干燥台&amp;nbsp;</td><td>Electrothermal（Cole-Parmer）</td><td>MH6616</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢染色架</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70312-54</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜（用于包埋）</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>外科剪刀</td><td>McKesson</td><td>43-1-104</td><td></td></tr><tr><td>超细尖直头解剖镊</td><td>Avantor</td><td>82027-402</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 显微载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III 逆转录酶（包含 5x 第一链缓冲液和 0.1M DTT）&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>SUR-VET 注射器配 25G x 5/8&quot; 针头，1 mL</td><td>Terumo</td><td>100281</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green（qPCR 酶预混液）</td><td>Applied Biosystems</td><td>A25778</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek 手动载玻片染色套装（染色缸）</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>SKU: 62540-01</td><td></td></tr><tr><td>甲苯</td><td>Fisher Chemical</td><td>T324-1</td><td></td></tr><tr><td>移液吸头</td><td>Avantor</td><td>414004-005</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Fisher Chemical</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠锁骨上棕色脂肪组织的解剖、组织学处理及基因表达分析

Dissection, Histological Processing, and Gene Expression Analysis of Murine Supraclavicular Brown Adipose Tissue

棕色脂肪组织（BAT）介导的产热在调节代谢过程中发挥着重要作用，其形态和功能会受到环境刺激的显著影响，这在小鼠和人类中均有体现。目前，研究实验室主要利用小鼠肩胛间棕色脂肪组织（iBAT）来研究BAT的功能，该组织位于小鼠背部上方两个肩胛骨之间的区域。最近，研究人员在小鼠中鉴定出若干此前未知的棕色脂肪组织储存部位，其中包括一个类似于人类锁骨上棕色脂肪组织的部位。与iBAT不同，小鼠锁骨上棕色脂肪组织（scBAT）位于颈部的中间层，因此难以直接获取。
为了促进对新鉴定的小鼠scBAT的研究，本文提供了一种详细的操作方案，用于从新生期及成年小鼠中分离完整的scBAT组织。由于scBAT相对于其他脂肪组织库体积较小，相关操作步骤已针对性地进行了修改和优化。其中一项改进是在组织采集过程中使用解剖显微镜，以提高冷冻scBAT样本取材的精确性和均一性，从而提升后续qPCR分析的效率。通过这些优化措施，可在小鼠中实现对scBAT的鉴定、形态学观察及其分子特征的分析。

与位于肩胛骨之间背部皮下层的iBAT不同，scBAT位于颈部中间层，随着外颈静脉的走向深入分布于骨骼肌层和唾液腺之间（图1A）。scBAT的解剖比iBAT更为复杂。本文提供了一种详细的解剖方法，包括从新生期及成年小鼠中完整分离scBAT的关键步骤（图1B、C）。按照所提供的方案打开颈部后，可在解剖显微镜下识别出一层薄薄的scBAT组织，并用镊子将其从相连的唾液腺和外颈静脉上剥离（图1D、E）。为评估该脂肪库的形态结构，将新鲜分离的scBAT组织按照所提供的处理流程结合先前发表的H&amp;E染色方法19进行处理（图2A）。如图2B所示，在健康的新生期和成年小鼠中，scBAT具有典型的棕色脂肪组织结构特征，由大量体积较小、多房脂滴的脂肪细胞组成。为检测scBAT中的基因表达水平，采用所提供的方法从分离的scBAT脂肪库中提取RNA（图3A）。随后可通过标准的RT-qPCR方法检测目的基因的表达水平（图3A）。如图3B所示，参与调控scBAT功能的关键基因的差异表达水平可被清晰检测，包括作为棕色脂肪发育主调控因子的Pparg；两个营养物质转运蛋白基因Fabp4和Glut4；以及两个参与产热过程的基因Ucp1和Ppargc1a。作为对照，同样采用所提供的方法从分离的iBAT中提取RNA，并检测上述基因的表达水平（图3A）。结果显示，这两类脂肪库中这些基因的表达水平相对相似（图3B）。
<img alt="小鼠颈部解剖结构及实验；3月龄小鼠的皮下棕色脂肪组织（scBAT）" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66475/66475fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：scBAT的解剖位置及其分离过程。（A）scBAT位于颈部中间层的位置。（B）去除皮肤前后颈部浅层的图像。比例尺 = 250 μm。黄色虚线标示出U形切口后应暴露的区域。（C）将小鼠尸体置于体视显微镜下拍摄的图像，以提高解剖过程中的视觉清晰度。（D、E）3周龄和3月龄小鼠在移除scBAT前后颈部中间层的代表性图像。比例尺 = 250 μm。黄色虚线标示出暴露的双侧scBAT脂肪库；n = 2。缩写：scBAT = 锁骨上棕色脂肪组织；sfi = 浅层；sg = 唾液腺；tr = 气管；jv = 颈外静脉；sm = 骨骼肌。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66475/66475fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="scBAT石蜡包埋和H&amp;E染色流程图，含组织样本放大结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66475/66475fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：scBAT的H&amp;E染色处理流程。（A）scBAT组织进行H&amp;E染色的主要步骤流程图。组织经解剖后，依次进行固定、脱水、包埋、切片和染色。（B）3周龄和3月龄小鼠scBAT的H&amp;E染色代表性图像；每个发育阶段n = 3；低倍镜图像比例尺 = 250 µm；高倍镜图像比例尺 = 50 µm。缩写：scBAT = 锁骨上棕色脂肪组织；PFA = 多聚甲醛；H&amp;E = 苏木精和伊红。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66475/66475fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="scBAT研磨及基因表达分析；液氮中scBAT组织制备，qPCR，mRNA表达图谱" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66475/66475fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3: 用于基因表达分析的scBAT RNA制备 (A) 流程图展示了scBAT基因表达的RNA提取及RT-qPCR分析各阶段。由于scBAT组织体积小且质地柔软，将其脂肪库迅速冷冻并在液氮中研磨，对成功提取RNA至关重要。 (B) 标记基因的相对表达水平，包括 Pparg, Fabp4, Glut4, Ucp1，以及 Ppargc1a，来自3月龄雄性小鼠的scBAT和iBAT，n = 5。数据以均值 ± 标准误表示。 36B4 用作标准化的看家基因。缩写：scBAT = 锁骨上棕色脂肪组织；RT-qPCR = 反转录定量 PCR；LN2 = 液氮 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66475/66475fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本文提供了一种实用的小鼠锁骨上棕色脂肪组织解剖及其组织学与基因表达分析的操作流程。

由棕色脂肪组织（BAT）介导的产热作用在代谢调控中发挥重要作用，其形态和功能可发生显著改变……

我们的实验室致力于将锁骨上棕色脂肪组织（scBAT）确立为棕色脂肪分析的一个有价值的研究位点，因其在解剖学上与人类棕色脂肪组织具有相似性。本方案旨在提高scBAT研究的可及性。由于该脂肪组织体积较小且邻近颈部的大静脉，可能给操作带来挑战，因此提供一种简便的scBAT提取与处理方法至关重要。我们的方法首先在提取scBAT时使用解剖显微镜，这一点尤为突出。这提高了操作的精确性和提取效率，而在处理如此微小的组织样本时，这两点均至关重要。其次，我们在进行基因表达分析之前，先对冷冻的scBAT样本进行匀浆处理，以提高RNA得率，从而弥补可用组织量极少的不足。我们目前致力于定义scBAT的遗传谱系，鉴定调控其发育的转录调控网络，并开发一种体外模型以探索其在人类中的生理功能。首先，将小鼠尸体置于工作台面上。用70%乙醇喷洒小鼠腹侧颈部，以尽量减少毛发污染。沿锁骨做长约1.5厘米的双侧切口。从双侧切口的末端开始，向耳朵方向纵向切开约1厘米，形成围绕颈部的方U形切口。将小鼠置于解剖显微镜下，并使暴露的颈部处于焦点位置。使用镊子提起切开的皮肤部分，以暴露唾液腺。接着使用手术剪和镊子，分离唾液腺与周围锁骨区域以及彼此之间的连接组织。提起唾液腺，以暴露锁骨上棕色脂肪组织（scBAT）储存区域。沿外颈静脉观察棕色脂肪组织（BAT），其可能与唾液腺下表面相连。用镊子夹住目标脂肪组织，轻轻将其从唾液腺上剥离。去除脂肪组织后，继续将颈部棕色脂肪组织（scBAT）从外颈静脉和颈部肌肉组织上分离，直至完全移除颈部两侧的脂肪沉积物。检查解剖后的肩胛间棕色脂肪组织（scBAT）样本，使用镊子去除任何残留的结缔组织。首先，将装有小鼠scBAT并盛有PBS的玻璃闪烁瓶放置于工作台面上，随后用10毫升冰冷的4%多聚甲醛替换PBS。将小瓶置于摇床上，4摄氏度下轻轻摇动过夜，以固定scBAT。次日，用10至15毫升PBS替换多聚甲醛溶液。将小瓶置于摇床上，室温下摇动30分钟。将 PBS 替换为 0.85% 生理盐水，继续振荡 30 分钟。然后将生理盐水替换为 10 毫升 70% 乙醇与 0.85% 生理盐水的混合溶液。将小瓶置于 4 °C 冰箱中过夜，或保存至准备进行石蜡包埋为止。第二天，从样品瓶中移除70%乙醇生理盐水混合液，加入10至15毫升95%脱水酒精。在室温下将样品瓶置于摇床上振荡一小时。第二次洗涤后，加入10至15毫升100%脱水酒精，继续在摇床上振荡一小时。为了使scBAT透明以便包埋，向小瓶中加入10毫升甲苯，并继续在旋转摇床上轻轻摇动，直至scBAT变得透明。然后将scBAT包埋于石蜡中，使用切片机对scBAT进行切片，并进行苏木精和伊红染色。苏木精和伊红染色证实，scBAT 包含典型的棕色脂肪组织结构，包括在新生期和成年小鼠中均可见的大量小型多房脂肪细胞。从小鼠体内解剖出 scBAT 后，立即将组织放入微量离心管中。用无菌针头在管盖顶部刺一个小孔，并在液氮中快速冷冻。将研杵和细刮勺浸入液氮中。将速冻的组织样本从微量离心管中倒入研钵。向研钵中加入少量液氮，用研杵彻底研磨组织，直至完全粉碎。使用细刮勺刮取并转移研磨后的组织回到微量离心管中。待所有组织转移完毕后，向管中加入 500 µL RNA 提取液，使用 Pellet 捣碎机头超声处理 30 秒。接着，用注射器反复吹打 10 次，以进一步裂解组织，确保无可见固体颗粒。加入 250 微升氯仿，在室温孵育 5 分钟期间偶尔涡旋振荡。在 4 摄氏度下以 21,000 G 离心 20 分钟。将上层水相转移至新管中，并加入等体积的 70% 乙醇。将500微升裂解液转移至结合柱中。在18,000 G条件下离心60秒，弃去滤液。进行逆转录时，将0.5至1微克溶于DEPC处理水中的RNA加入PCR管条中。然后用经DEPC处理的水将cDNA稀释至250纳克/微升，并进行定量PCR。参与介导scBAT功能的标志基因在scBAT与肩胛间BAT之间的表达水平相对相似。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

在本视频中，我们演示了从新生小鼠分离皮下白色脂肪组织和肩胛间棕色脂肪组织的手术操作过程。...

小鼠幼崽白色与棕色脂肪组织库的采集：一种获取小鼠幼崽白色脂肪组织和棕色脂肪组织的手术操作

由于肥胖与其他共病之间存在显著且负面的关联，研究脂肪组织在疾病和整体健康中的作用具有重要意义。本文介绍了一种分离和切除脂肪组织库的实验方案，可用于通过原位（in situ）和体外（in...

小鼠脂肪组织的定位、鉴定与切除

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单只小鼠骨骼肌连续区域的冷冻切片用于基因表达与组织学分析

本文介绍了一种高效染色质免疫沉淀（ChIP）后接高通量DNA测序（ChIP-seq）的实验方案，适用于从小鼠分离的棕色脂肪组织（BAT）样本。该方案可用于全基因组范围内组蛋白修饰的定位分析，以及非组蛋白目标蛋白的全基因组定位研究。 体内.

小鼠棕色脂肪组织的染色质免疫沉淀

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小鼠不同脂肪组织库的鉴定与分离

从主动脉周围脂肪组织中分离、培养及诱导神经嵴来源的脂肪干细胞向脂肪细胞分化

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从小鼠肩胛间棕色脂肪组织中分离棕色脂肪细胞用于基因和蛋白质表达分析

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使用[18F]FDG微正电子发射断层扫描/磁共振成像对小鼠棕色和米色脂肪组织进行可视化与定量分析

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从新生小鼠肩胛间脂肪组织基质血管组分中分化与成像棕色脂肪细胞

本方案描述了从小鼠脂肪组织中半自动化分离基质血管组分（SVF）以获取前脂肪细胞并实现脂肪细胞分化的步骤...

使用组织解离仪半自动化分离小鼠白色脂肪组织中的基质血管组分

学习小鼠锁骨上棕色脂肪组织的解剖、组织学处理及基因表达分析方法。该方案利用显微镜精确分离组织，并通过苏木精-伊红染色和定量PCR技术，为研究棕色脂肪在代谢中的功能提供可靠实验基础。

小鼠锁骨上棕色脂肪组织的解剖、组织学处理及基因表达分析

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