小鼠锁骨上棕色脂肪组织的解剖、组织学处理及基因表达分析

我们的实验室致力于将锁骨上棕色脂肪组织（scBAT）确立为棕色脂肪分析的一个有价值的研究位点，因其在解剖学上与人类棕色脂肪组织具有相似性。本方案旨在提高scBAT研究的可及性。由于该脂肪组织体积较小且邻近颈部的大静脉，可能给操作带来挑战，因此提供一种简便的scBAT提取与处理方法至关重要。

我们的方法首先在提取scBAT时使用解剖显微镜，这一点尤为突出。这提高了操作的精确性和提取效率，而在处理如此微小的组织样本时，这两点均至关重要。其次，我们在进行基因表达分析之前，先对冷冻的scBAT样本进行匀浆处理，以提高RNA得率，从而弥补可用组织量极少的不足。

我们目前致力于定义scBAT的遗传谱系，鉴定调控其发育的转录调控网络，并开发一种体外模型以探索其在人类中的生理功能。首先，将小鼠尸体置于工作台面上。用70%乙醇喷洒小鼠腹侧颈部，以尽量减少毛发污染。

沿锁骨做长约1.5厘米的双侧切口。从双侧切口的末端开始，向耳朵方向纵向切开约1厘米，形成围绕颈部的方U形切口。将小鼠置于解剖显微镜下，并使暴露的颈部处于焦点位置。

使用镊子提起切开的皮肤部分，以暴露唾液腺。接着使用手术剪和镊子，分离唾液腺与周围锁骨区域以及彼此之间的连接组织。提起唾液腺，以暴露锁骨上棕色脂肪组织（scBAT）储存区域。

沿外颈静脉观察棕色脂肪组织（BAT），其可能与唾液腺下表面相连。用镊子夹住目标脂肪组织，轻轻将其从唾液腺上剥离。去除脂肪组织后，继续将颈部棕色脂肪组织（scBAT）从外颈静脉和颈部肌肉组织上分离，直至完全移除颈部两侧的脂肪沉积物。

检查解剖后的肩胛间棕色脂肪组织（scBAT）样本，使用镊子去除任何残留的结缔组织。首先，将装有小鼠scBAT并盛有PBS的玻璃闪烁瓶放置于工作台面上，随后用10毫升冰冷的4%多聚甲醛替换PBS。

将小瓶置于摇床上，4摄氏度下轻轻摇动过夜，以固定scBAT。次日，用10至15毫升PBS替换多聚甲醛溶液。将小瓶置于摇床上，室温下摇动30分钟。

将 PBS 替换为 0.85% 生理盐水，继续振荡 30 分钟。然后将生理盐水替换为 10 毫升 70% 乙醇与 0.85% 生理盐水的混合溶液。将小瓶置于 4 °C 冰箱中过夜，或保存至准备进行石蜡包埋为止。

第二天，从样品瓶中移除70%乙醇生理盐水混合液，加入10至15毫升95%脱水酒精。在室温下将样品瓶置于摇床上振荡一小时。第二次洗涤后，加入10至15毫升100%脱水酒精，继续在摇床上振荡一小时。

为了使scBAT透明以便包埋，向小瓶中加入10毫升甲苯，并继续在旋转摇床上轻轻摇动，直至scBAT变得透明。然后将scBAT包埋于石蜡中，使用切片机对scBAT进行切片，并进行苏木精和伊红染色。

苏木精和伊红染色证实，scBAT 包含典型的棕色脂肪组织结构，包括在新生期和成年小鼠中均可见的大量小型多房脂肪细胞。从小鼠体内解剖出 scBAT 后，立即将组织放入微量离心管中。用无菌针头在管盖顶部刺一个小孔，并在液氮中快速冷冻。

将研杵和细刮勺浸入液氮中。将速冻的组织样本从微量离心管中倒入研钵。向研钵中加入少量液氮，用研杵彻底研磨组织，直至完全粉碎。

使用细刮勺刮取并转移研磨后的组织回到微量离心管中。待所有组织转移完毕后，向管中加入 500 µL RNA 提取液，使用 Pellet 捣碎机头超声处理 30 秒。接着，用注射器反复吹打 10 次，以进一步裂解组织，确保无可见固体颗粒。

加入 250 微升氯仿，在室温孵育 5 分钟期间偶尔涡旋振荡。在 4 摄氏度下以 21,000 G 离心 20 分钟。将上层水相转移至新管中，并加入等体积的 70% 乙醇。

将500微升裂解液转移至结合柱中。在18,000 G条件下离心60秒，弃去滤液。进行逆转录时，将0.5至1微克溶于DEPC处理水中的RNA加入PCR管条中。

然后用经DEPC处理的水将cDNA稀释至250纳克/微升，并进行定量PCR。参与介导scBAT功能的标志基因在scBAT与肩胛间BAT之间的表达水平相对相似。