穿刺伤止血及用于拼接大范围电子显微镜分析的样品制备

我们实验室致力于通过大体积电子显微镜（volume EM）进行结构研究，以阐明血小板如何被激活、如何聚集、如何形成血栓从而实现止血，以及在过度激活的情况下，如何导致闭塞性凝血。开展这项研究的基本前提是：如果我们能够了解其结构基础，就能更精准地设计靶向药物，从而获得更好的治疗效果。在研究中，我们采用小鼠模型，这与许多研究人员的做法一致。然而，我们都面临一个共同的挑战：如何将我们在小鼠身上获得的研究发现——特别是关于小鼠动脉和静脉中的机制——外推到人类更大尺寸的动脉和静脉中相应的机制。

我们都希望小鼠和人类的原理是相同的。如果采用我们的研究成果并结合体积电子显微镜技术，我们所做出的重要贡献之一就是指出：血小板不仅仅是“自杀式炸弹手”，它们会保留颗粒。

它们会响应信号而发挥作用。它们具有稳定的状态，这些稳定状态既是正常血栓的一部分，也是闭塞性血凝块的一部分。第二，我们已经认识到所形成的血栓确实具有特定的结构。

它不仅仅是一堆砖块，而是一种有序结构，其中血小板的排列与其活化状态等相关。第三，我们提出了一种理念，即应当能够从结构出发，理解需要激活哪些因素以获得良好结果，或需要抑制哪些因素以避免不良后果，从而保护个体。我们在接近纳米级的分辨率下，对近毫米距离范围内的样本采集连续图像。

我们将这些图像组合成单幅拼接图。因此，可以在近纳米到近毫米的尺度范围内观察图像中的任意位置，足以将血栓整体中的各个结构精确定位。研究人员现在拥有一种强大的工具，可以提出新的科学问题：凝血级联反应、细胞信号或药物在血栓中如何从局部到整体水平上发挥空间作用？

首先，使用剪刀和钝头镊子，提起并剪开麻醉小鼠右侧颈静脉上方的皮肤。在皮肤上剪出一个圆形窗口，大小足以暴露颈静脉及部分周围组织。采用钝性分离技术，轻轻推开脂肪组织、淋巴结和结缔组织。

接下来，用37摄氏度的预温生理盐水填充一支20毫升的注射器。将注射器装入注射泵中，然后将27号蝶形针头及配套管路连接到注射器上。将注射泵设置为0.5毫升/分钟的流速，以冲洗穿刺的静脉或动脉中的血液。

将生理盐水液流置于穿刺部位侧方数毫升处，而非直接对准穿刺点。颈静脉清洁后，立即启动计时器。分别准备30号和33号皮下注射针头，用于颈静脉和股动脉。

将针尖斜面朝上，然后以25度角置于颈静脉或股动脉上方。记录时间后，迅速刺穿血管顶部。记录出血完全停止所需的时间。

在开始灌注固定前，需等待血栓形成。灌注完成后，解剖出带有穿刺部位和血栓的颈静脉段。使用一把锋利的剪刀，在血管段远端做斜切，在血管段近端做平直切口。

接下来，将固定好的组织置于 4 摄氏度环境中 24 小时。第二天，将二甲胂酸钠缓冲液倒入含有 5 毫米厚硅胶垫的 35 毫米培养皿中。小心地将组织转移至缓冲液中，确保其完全浸没于缓冲液内。

使用不锈钢显微针和一对精细镊子，小心地将血管两端固定在硅胶垫上。仔细清理颈静脉。用显微剪刀沿穿刺点对侧的血管壁纵向剪开。

轻轻打开血管，然后将其内腔面向上固定在硅胶垫上。移除培养皿中的缓冲液，加入1%多聚甲醛以浸没血管。立即盖上培养皿盖子，防止干燥。