构建人阴道芯片中的健康与菌群失调阴道微环境模型

我们成功开发了一种支持鳞状分层阴道上皮自发分化的仿生人阴道芯片。该芯片可对激素产生强烈的屏障反应，并形成支持微生物组生长的氧浓度梯度。目前，二维培养和类器官培养被用于研究阴道菌群失调，但由于其静态特性，无法模拟阴道微环境的生理复杂性。

动物模型同样无法模拟人类月经周期中存在的相同激素变化，且不同动物物种与人类之间的阴道微生物组也存在差异。我们着手探索器官芯片技术是否可用于开发一种人源阴道微生物组相互作用的临床前模型，该模型有望用于基于微生物组的潜在治疗手段的发现与评估。阴道芯片可实现阴道上皮与间质之间的动态液体流动，从而延长其与阴道微生物群落的共培养时间，并维持一个符合生理特征的微环境。

“人类阴道芯片”是一种令人兴奋的工具，可用于研究女性生殖道的各种疾病，并验证新的生物治疗手段。首先，取一培养瓶中70%至90%汇合度的人类子宫成纤维细胞。吸除培养瓶中的培养基。

用五毫升预热的不含钙和镁的 DPBS 洗涤细胞。吸除 DPBS 后，向每个培养瓶中加入四毫升预热的胰蛋白酶 EDTA。于 37 摄氏度孵育细胞 3 至 5 分钟，直至细胞脱落。

接下来，向每个锥形瓶中加入6毫升滴液和中和溶液。然后将细胞悬液转移至15毫升锥形离心管中。使用移液器充分混匀悬液，并取10 µL细胞悬液用于细胞计数。

取10微升细胞悬液与10微升台盼蓝混合。将染色后的细胞悬液转移至血细胞计数板进行细胞计数。随后，将细胞悬液在室温下以300 ×g离心5分钟。

吸出上清液后，将沉淀物重悬于温热的成纤维细胞培养基中。随后用200微升成纤维细胞培养基清洗微流控器官芯片的基底通道。然后用200微升预热的阴道上皮细胞培养基清洗顶端通道。

向顶端通道入口加入 200 微升完全阴道上皮培养基，同时用移液器吸头堵住出口。加入培养基直至入口和出口的吸头体积相等。然后将移液器吸头从移液器上卸下，使其保留在入口处。

将人子宫成纤维细胞悬液缓慢吹打50微升至基底通道入口，同时从出口端进行抽吸。当移液器吸头内剩余约2微升细胞悬液时，将吸头从入口处移开。将插头芯片倒置放置于15毫升离心管架上。

孵育后检查芯片上的细胞贴壁情况。接着，用移液枪头堵住基底通道的出口。然后，向基底通道入口加入 200 µL 成纤维细胞培养基，加入时不要按压移液枪的活塞。

将吸头从移液器上取下，使培养基在重力作用下自由流经通道，到达出口端的吸头。将接种成纤维细胞的芯片置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜。首先，分别取50毫升成纤维细胞培养基和阴道上皮细胞培养基，加入两个独立的50毫升锥形管中。

在无菌条件下，将预热的培养基置于真空环境中脱气5分钟。接着，使用CaviCide和乙醇对动态流模块的洁净托盘进行消毒。从包装中取出微载体小室（pods），并将其放入动态流模块的托盘中。

用移液器将两毫升脱气的阴道上皮细胞培养基加入顶端入口储液槽中，并向基底入口储液槽中加入三毫升脱气的成纤维细胞培养基。向顶端出口储液槽中加入500微升脱气的阴道上皮细胞培养基，向基底出口储液槽中加入500微升脱气的成纤维细胞培养基。

将装有微滴生成单元的托盘滑入动态流模块中。现在运行两次启动循环。如果经过四次启动循环后仍未形成液滴，请将出口储液池内的端口直接接触。

用移液器吸取200微升相应的培养基，使其在通道的储液池之间流动，以手动预启动微柱。接着，从接种了人子宫成纤维细胞的器官芯片上移除移液器吸头。在每块芯片的所有端口上方滴加一滴相应的培养基。

将芯片滑入载片盒中，并将载片盒放置到托盘上。吸除芯片表面的任何培养基。然后将每个托盘滑入动态流体模块中。

接下来，在模块上将顶部和底部设置为液体，顶端流速设为 15 微升/小时，基底流速设为 30 微升/小时，拉伸设为 0%，频率设为 0 赫兹。运行模块的调节循环，并让液体持续流动过夜。在器官芯片装置上观察到阴道上皮细胞形成连续的细胞层，并在分化后逐渐形成多层结构。

首先，将每种细菌菌株按计算量混合，使总体浓度达到每毫升约五百万个菌落形成单位。在4°C条件下，以7,000 G离心7分钟。随后，小心吸取上清液。

用低缓冲能力并含有葡萄糖的汉克斯平衡盐溶液重悬沉淀。现在接触含有来自微孔的分化人阴道上皮细胞的器官芯片。用移液器吸头堵住芯片基底通道的出口。

向基底通道入口加入 200 微升不含抗生素的分化培养基，操作时不要按压移液器的推杆。将移液器吸头从移液器上取下，使培养基自由流过通道。接着，在从出口端抽吸的同时，向芯片的顶端通道入口移取 37 微升细菌接种液。

拉动尖端，然后用移液枪头堵住顶端通道的入口和出口。对于对照芯片，向顶端通道入口加入37微升低缓冲能力并含有葡萄糖的汉克平衡盐溶液。吸取芯片表面残留的任何培养基后，将芯片置于150毫米的培养皿中。

接种后48小时内检测到卷曲乳杆菌（L.crispatus）和阴道加德纳菌（G.vaginalis）的菌落，证实健康和失调相关细菌均已在阴道芯片中定植。接种卷曲乳杆菌的阴道芯片pH值与未接种的对照芯片相似，而与阴道加德纳菌共培养时，pH值显著升高。