Name: 微流控方法解决单个多功能细胞的同时和连续细胞因子分泌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-08T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 了解微流控技术如何同时定量检测单个免疫细胞分泌IL-6、TNF-α和IL-1β等多种细胞因子的动态变化。该方法为免疫学研究提供了重要的单细胞分析工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本项目得到了瑞士联邦理工学院（ETH）领域个性化健康与相关技术（PHRT）战略重点领域的资助（项目编号 #2021-349）、欧洲研究委员会启动资助（项目编号 #803,336）以及瑞士国家科学基金会（项目编号 #310030_197619）的支持。此外，我们感谢 Guilhem Chenon 和 Jean Baudry 在初始 DropMap 分析仪开发工作中所做出的贡献。

Microfluidic Droplet Assay for Single-Cell Cytokine Secretion Analysis

<ol><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+responses+and+inflammation-associated+diseases+in+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Inflammatory responses and inflammation-associated diseases in organs.</a> Oncotarget. 9 (6), 7204-7218 (2017).</li>
<li>Cicchese, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+balance+of+pro-+and+anti-inflammatory+signals+controls+disease+and+limits+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Dynamic balance of pro- and anti-inflammatory signals controls disease and limits pathology.</a> Immunol Rev. 285 (1), 147-167 (2018).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines%3A+From+clinical+significance+to+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytokines: From clinical significance to quantification.</a> Adv Sci. 8 (15), e2004433(2021).</li>
<li>Rojas, J. M., Avia, M., Martín, V., Sevilla, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-10%3A+A+multifunctional+cytokine+in+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">IL-10: A multifunctional cytokine in viral infections.</a> J Immunol Res. 2017, 6104054(2017).</li>
<li>Kohanawa, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+effect+of+the+balance+between+TNF-%CE%B1+and+IL-6+in+the+granulomatous+and+inflammatory+response+to+Rhodococcus+aurantiacus+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A regulatory effect of the balance between TNF-α and IL-6 in the granulomatous and inflammatory response to Rhodococcus aurantiacus infection in mice.</a> J Immunol. 177 (1), 642-650 (2006).</li>
<li>Geginat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+human+CD4+T+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of human CD4 T cell subsets.</a> Front Immunol. 5, 630(2014).</li>
<li>Sallusto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+CD4%2B+T+cells+against+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human CD4+ T cells against microbes.</a> Ann Rev Immunol. 34 (1), 317-334 (2016).</li>
<li>Chetaille Nézondet, A. L., Poubelle, P. E., Pelletier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evaluation+of+cytokines+to+help+establish+diagnosis+and+guide+treatment+of+autoinflammatory+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukocyte+Biol%22%5BJournal%5D)">The evaluation of cytokines to help establish diagnosis and guide treatment of autoinflammatory and autoimmune diseases.</a> J Leukocyte Biol. 108 (2), 647-657 (2020).</li>
<li>Sims, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+cytokine+storm+reflects+hyperinflammatory+endothelial+dysfunction+in+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the cytokine storm reflects hyperinflammatory endothelial dysfunction in COVID-19.</a> J Allergy Clin Immunol. 147 (1), 107-111 (2021).</li>
<li>Yasen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+reveals+the+heterogeneity+of+infiltrating+immune+cell+profiles+in+the+hepatic+cystic+echinococcosis+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing reveals the heterogeneity of infiltrating immune cell profiles in the hepatic cystic echinococcosis microenvironment.</a> Infection and Immunity. 89 (12), (2021).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+highlights+intratumor+heterogeneity+and+intercellular+network+featured+in+adamantinomatous+craniopharyngioma%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing highlights intratumor heterogeneity and intercellular network featured in adamantinomatous craniopharyngioma.</a> Sci Adv. 9 (15), (2023).</li>
<li>Tanguay, S., Killion, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparison+of+ELISPOT+and+ELISA-based+assays+for+detection+of+individual+cytokine-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphokine+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Direct comparison of ELISPOT and ELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells.</a> Lymphokine Cytokine Res. 13 (4), 259-263 (1994).</li>
<li>Bucheli, O. T. M., Sigvaldadóttir, I., Eyer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+single-cell+protein+secretion+in+immunology%3A+Technologies%2C+advances%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Measuring single-cell protein secretion in immunology: Technologies, advances, and applications.</a> Eur J Immunol. 51 (6), 1334-1347 (2021).</li>
<li>Brower, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+emulsion+flow+cytometry+with+high-throughput+single+droplet+isolation+and+nucleic+acid+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Double emulsion flow cytometry with high-throughput single droplet isolation and nucleic acid recovery.</a> Lab Chip. 20 (12), 2062-2074 (2020).</li>
<li>Brower, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+emulsion+picoreactors+for+high-throughput+single-cell+encapsulation+and+phenotyping+via+FACS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Double emulsion picoreactors for high-throughput single-cell encapsulation and phenotyping via FACS.</a> Anal Chem. 92 (19), 13262-13270 (2020).</li>
<li>Luo, X., Chen, J. Y., Ataei, M., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+compartmentalization+platforms+for+single+cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Microfluidic compartmentalization platforms for single cell analysis.</a> Biosensors. 12 (2), 58(2022).</li>
<li>Bounab, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+single-cell+phenotyping+of+immune+cells+using+the+microfluidic+platform+DropMap%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dynamic single-cell phenotyping of immune cells using the microfluidic platform DropMap.</a> Nat Protoc. 15 (9), 2920-2955 (2020).</li>
<li>Eyer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+deep+phenotyping+of+IgG-secreting+cells+for+high-resolution+immune+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single-cell deep phenotyping of IgG-secreting cells for high-resolution immune monitoring.</a> Nat Biotechnol. 35 (10), 977-982 (2017).</li>
<li>Gaa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+and+rapid+microfluidics-assisted+antibody+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">Versatile and rapid microfluidics-assisted antibody discovery.</a> mAbs. 13 (1), 198130(2021).</li>
<li>Gerard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single-cell+activity-based+screening+and+sequencing+of+antibodies+using+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-throughput single-cell activity-based screening and sequencing of antibodies using droplet microfluidics.</a> Nat Biotechnol. 38 (6), 715-721 (2020).</li>
<li>De Jonghe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((spinDrop%3A+a+droplet+microfluidic+platform+to+maximise+single-cell+sequencing+information+content%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">spinDrop: a droplet microfluidic platform to maximise single-cell sequencing information content.</a> Nat Comm. 14 (1), 4788(2023).</li>
<li>Wheeler, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+forward+genetic+screening+of+astrocyte-microglia+cross-talk%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Droplet-based forward genetic screening of astrocyte-microglia cross-talk.</a> Science. 379 (6636), 1023-1030 (2023).</li>
<li>Portmann, K., Linder, A., Oelgarth, N., Eyer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+deep+phenotyping+of+cytokine+release+unmasks+stimulation-specific+biological+signatures+and+distinct+secretion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep+Meth%22%5BJournal%5D)">Single-cell deep phenotyping of cytokine release unmasks stimulation-specific biological signatures and distinct secretion dynamics.</a> Cell Rep Meth. 3 (7), 100502(2023).</li>
<li>Portmann, K., Linder, A., Eyer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation-induced+cytokine+polyfunctionality+as+a+dynamic+concept%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Stimulation-induced cytokine polyfunctionality as a dynamic concept.</a> eLife. 12, 89781(2023).</li>
<li>Armbruster, D. A., Pry, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limit+of+blank%2C+limit+of+detection+and+limit+of+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Biochem+Rev%22%5BJournal%5D)">Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation.</a> Clin Biochem Rev. 29, S49-S52 (2008).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insight+into+neurological+degeneration%3A+Inflammatory+cytokines+and+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">New insight into neurological degeneration: Inflammatory cytokines and blood-brain barrier.</a> Front Mol Neurosci. 15, 1013933(2022).</li>
<li>Kim, P. S., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+responding+T+cells+in+cancer+and+chronic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Features of responding T cells in cancer and chronic infection.</a> Curr Opin Immunol. 22 (2), 223-230 (2010).</li>
<li>Becher, B., Spath, S., Goverman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+networks+in+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytokine networks in neuroinflammation.</a> Nat Rev Immunol. 17 (1), 49-59 (2017).</li>
<li>Cosenza, M., Sacchi, S., Pozzi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+release+syndrome+associated+with+T-cell-based+therapies+for+hematological+malignancies%3A+Pathophysiology%2C+clinical+presentation%2C+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytokine release syndrome associated with T-cell-based therapies for hematological malignancies: Pathophysiology, clinical presentation, and treatment.</a> Int J Mol Sci. 22 (14), 7652(2021).</li>
<li>Hu, B., Huang, S., Yin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytokine+storm+and+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">The cytokine storm and COVID-19.</a> J Med Virol. 93 (1), 250-256 (2021).</li>
<li>Marcuzzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoinflammatory+diseases+and+cytokine+storms-Imbalances+of+innate+and+adaptative+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Autoinflammatory diseases and cytokine storms-Imbalances of innate and adaptative immunity.</a> Int J Mol Sci. 22 (20), 11241(2021).</li>
</ol>

细胞的珠线测量等特定方面已获得专利。

细胞因子的释放与分泌在免疫学和临床医学中经常被研究3细胞因子分泌失衡不仅会对感染性疾病患者产生有害影响，还可能对神经系统疾病、炎症或癌症患者造成不良后果。26,27,28尽管细胞因子及其分泌细胞在健康与疾病中的重要性已得到充分证实，但由于现有技术方法无法以时间分辨的方式准确检测和定量单个细胞来源的细胞因子，对它们的研究仍然具有挑战性。本实验流程采用既定的PBMC刺激方案，并检测其分泌的IL-6、TNF-α和IL-1β。选择使用PBMC而非单独纯化的亚群，是基于此前对细胞因子释放综合征（CRS）的研究应用。23一种以血浆中促炎细胞因子（包括 IL-6、TNF-α 和 IL-1β）浓度显著升高为特征的病症29由于CRS通常不仅与单一人群相关，我们使用了外周血单个核细胞（PBMCs），因为它们在体内存在 体内然而，如果科学问题需要，可以对细胞亚群进行纯化并分别评估。孵育时间、刺激条件和动态检测范围均已优化，以测量三种目标细胞因子的分泌。本文展示的工作流程和数据说明了如何建立、校准、定量、测量和分析多种细胞因子的时间分辨单细胞分泌。该方案为多因子分泌功能分析提供了蓝图，有助于揭示患者体内分泌细胞因子的广泛功能与动态多样性。
所述检测方案的多个关键方面实现了独特的生物学读出。首先，通过微流控液滴对单个细胞进行封装，可获取每个单独细胞的数据。多重细胞封装事件可通过图像分析被检测并根据研究问题选择性地纳入或排除。其次，通过在液滴内引入多个独立的荧光免疫检测，并结合功能化纳米颗粒的有序排列，可同时定量测量多达三种细胞因子的浓度。这种多重检测能力使得在单细胞水平上分析细胞因子共分泌模式成为可能。第三，液滴的固定化处理允许对每个分泌细胞的细胞因子分泌进行时间序列上的测量与关联分析，从而能够区分同时发生与顺序发生的分泌事件。该时间分辨率独特地提供了关于分泌模式以及不同类型分泌细胞亚群的信息。最后，通过并行化的图像分析，能够高效地从包含超过20,000个单细胞的实验数据中提取和追踪大量信息。对单个分泌曲线的进一步分析还使得发现表型亚群及其功能特性成为可能。
除了其独特的检测读数外，该检测方法相较于标准的细胞因子分析还具有技术上的优势。由于包裹单元的体积很小，约为60 pL，因此可以直接从生物来源检测分泌细胞因子的绝对量，其检测限与细胞分泌水平相匹配。该检测方法的微型化还减少了昂贵生物试剂的使用量。此外，实验装置对专用设备的需求极少，而这些设备通常已在生物学和生物工程实验室中具备。荧光显微镜广泛可用，而注射泵在生物工程实验室中也常被使用，或可相对低成本购得。如果已有细胞培养设施，运行实验所需的全套设备成本约为148,000欧元，其中大部分费用来自自动倒置荧光显微镜（130,000欧元）。然而，此类仪器在生物实验室中通常已有配备，其余成本则主要来自注射泵（13,000欧元，但存在更便宜的替代方案）以及一些小型设备。液滴芯片和观察室的制备方法已有非常详尽的描述17，可在具备必要基础设施（如大多数生物工程实验室都配备的烘箱和等离子清洗仪）的非洁净室环境中完成。此外，也有不同的供应商可为有需求的实验室提供液滴发生芯片。由于所需体积很小，该检测方法成本低廉且易于建立。
为了确保最高程度的可重复性，我们确定了该方案成功实施的一些关键步骤。初次使用者常见的问题是测量过程中液滴发生移动。尽管分析软件能够在一定程度上追踪单个液滴，但过度移动会导致丧失单细胞分辨率并产生不准确的结果。通过使用密封性良好的测量腔室、合适的液滴尺寸与腔室尺寸、在开始测量前进行短暂的平衡，以及适当的表面活性剂浓度，可以避免液滴移动。另一个关键步骤是在开始测量前进行准确的聚焦。聚焦不当会显著降低荧光重定位值，从而低估分泌细胞因子的量。最后，根据具体的研究问题和实验方案，各步骤之间的时间间隔控制对于可重复性至关重要。特别是填充腔室与开始测量之间的时间间隔应保持一致，否则可能错过分泌细胞因子的检测时间窗口。
该技术的局限性包括细胞包封后难以对其进行进一步操作。因此，目前尚无法在包封后添加或去除刺激物、抗体或其他试剂。此外，由于细胞被封装在独立的生物反应器中，在检测过程中细胞之间无法发生相互作用（包括接触依赖性作用或旁分泌信号传递）。这一限制可通过预先进行整体孵育在一定程度上得以克服。同时，也不能排除分泌的细胞因子可能产生增强的自分泌效应，且这些效应无法被准确量化或排除，因为仅能检测到抗体可识别的分泌型细胞因子。因此，对细胞因子分泌的独立观察结果必须始终结合具体的研究问题和应用场景进行解读。然而，这一局限性也可被用于对封装的多细胞聚集体（如双细胞、三细胞）进行深入研究（如有此需求），从而为探究细胞间接触或旁分泌相关问题提供有价值的实验体系。最后，该检测方法的动态范围也有限，需根据具体应用进行优化调整。本文中，我们已将检测的动态范围调整至与预期分泌的细胞因子量相匹配的水平。
为了进一步提升该检测方法的能力和适用性，未来可在生物学、技术及数据分析等方面进行若干改进。在生物学方面，可通过调整该检测方法，整合更多细胞因子、其他分泌蛋白、代谢物或细胞表面标志物的检测。此外，该检测方法还可与其他基于细胞的检测方法结合，纳入统一的工作流程，以拓展检测读数（例如流式细胞术染色或测序）。同时，该检测方法的可用性也可进一步简化，例如开发用于液滴生成与观察的一体化微流控芯片，从而有望在临床环境中实现非生物工程实验室的更广泛应用。在数据分析方面，可通过增强自动化并采用机器学习方法，进一步扩展从图像中提取和追踪信息的能力，例如在无需荧光标记的情况下识别每个液滴中细胞（或细胞群）及微珠链的存在与位置。此举将释放额外的荧光通道，可用于免疫检测，从而实现更多细胞因子的并行检测。
本文所述的检测方法及其相关方案和分析可应用于与细胞因子分泌动态相关的多种潜在场景。更具体而言，该检测方法有望解决一些基础免疫学问题，例如鉴定特定细胞类型和激活状态下的细胞因子分泌谱、分泌细胞因子细胞的多功能性，或细胞因子平衡的时间特性及其维持机制。此外，在临床应用中，该平台可能有助于揭示细胞因子在急性或慢性炎症反应中的作用，例如在 COVID-1930 中所观察到的现象，或为基于独特分子特征（如自身炎症反应31）对患者进行分层和个体化治疗提供工具。总之，对单个细胞细胞因子分泌进行定量、时间分辨的评估是一种亟需的方法，因为它能够阐明特定药物、感染、基因改变或体外（ex vivo）刺激如何诱导特定的免疫应答。

感染通常会引起复杂的宿主反应，涉及先天免疫系统和适应性免疫系统1,2。在发生感染或识别病原体后，宿主细胞可产生多种趋化因子和细胞因子，这些小分子蛋白质被称为免疫系统的关键信号分子和调节因子3。促炎性细胞因子在感染早期释放，以启动免疫应答，随后释放抗炎性细胞因子，这对于防止组织损伤以及继发的慢性或自身炎症性疾病至关重要。这种在清除威胁与保护组织之间的平衡，表现为在感染过程中发挥不同功能的多种细胞因子谱型，从而实现免疫应答的精细调控4,5。在此类混合物中，根据病原体及其诱导的信号、组织部位以及来源的免疫细胞不同，可观察到独特的细胞因子特征。然而，细胞因子的释放似乎也是一种对每个细胞群体而言具有独特性的多功能生物学过程，在分泌动力学和个体反应方面表现出多样性。这种异质性已在文献中被描述多年，例如在T细胞亚群之间6,7，针对自身炎症性疾病和重症COVID-19感染的研究显示，患者体内及患者之间炎症标志物存在显著的功能多样性8,9。近年来，单细胞测序技术的出现揭示了免疫微环境中各亚群之间高度的可塑性和相互作用，这些此前并不明显，表明需要采用单细胞方法来捕捉这种异质性10,11。尽管目前正不断开发新方法用于转录组分析，表型分析仍然具有挑战性，因为它需要在单细胞水平上对蛋白质分泌进行同时、定量且具有时间分辨率的测量。此类测量使我们能够研究分泌细胞的身份、动力学特征以及分泌模式（快/慢、早/晚、同时/顺序）针对一组或一个面板的细胞因子。通过实现对免疫应答过程中细胞因子释放动力学的定量和时间分辨研究，所获得的见解可能有助于理解细胞群体行为及其诱导的应答机制。
在标准方案中，通常使用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测细胞悬液上清液和血清中的细胞因子，从而获得总体分泌量。总体测量方法无法量化每个细胞产生的细胞因子含量，这一问题在异质性细胞样本中尤为突出。其他替代方法，如细胞内细胞因子染色、酶联免疫斑点（ELISpot）检测或微刻蚀检测（例如 Isoplexis），虽可检测单个细胞表达的细胞因子，但仅能提供终点测量结果12,13。这意味着细胞在孵育期间分泌动力学及分泌模式可能发生的动态变化将被忽略。此外，终点测量无法区分细胞因子是同时分泌还是顺序分泌，因此通过这些方法仍无法明确免疫细胞在细胞因子分泌中真正的同时多效性程度。
利用液滴微流控技术生成和处理皮升级的物理隔室，可在单细胞水平上根据免疫细胞独特的细胞因子分泌表型对其进行研究，从而实现单细胞分辨率14,15。这些隔室由水包油乳液构成，可通过微流控芯片生成16,17。事实上，基于液滴的微流控检测方法在单细胞水平上展现出极强的灵活性，能够实现对不同生物样本和分子库的分析，并可与上游（细胞与试剂处理）和下游过程（单细胞分选、蛋白质组学或测序）整合18,19,20,21,22。特别是允许液滴固定的实验装置，可实现对单细胞功能随时间变化的动态监测，这对于蛋白质分泌分析具有重要价值18。此外，整合多重定量检测方法有助于在共分泌等此前难以触及的研究维度上开展进一步探索，并实现多功能免疫细胞的鉴定23,24。
本方案描述了一种基于固定化液滴的单细胞工作流程，用于并行检测、定量及时间分辨地测量单个细胞分泌最多三种细胞因子的情况17,23。该技术能够并行监测超过 20,000 个细胞的细胞因子反应。
所示工作流程包括将单个免疫细胞和功能化纳米颗粒在60 pL的水包油微滴中进行微流控封装。随后实现固定化 &gt;观察室中的一万个液滴及时间分辨荧光显微镜技术可实现对每个液滴内每种细胞因子分泌动态的测量图1A）。对于液滴中的每个单个细胞，通过夹心免疫测定法检测其分泌的细胞因子，其中连接有特异性捕获抗体的磁性纳米颗粒与分泌的细胞因子结合，从而导致荧光标记的检测抗体发生后续的迁移与结合图1B，C）。通过排列磁性纳米颗粒形成微珠线，可在细胞因子存在时定量荧光重定位现象。此处，荧光重定位定义为微珠线上平均荧光强度与液滴其余部分平均荧光强度的比值。通过混合不同功能化的纳米颗粒批次及相应标记在不同荧光通道的检测抗体，该检测可实现针对多种细胞因子的多重分析。23，导致不同通道中出现特定的荧光重定位现象。借助定制的分析脚本，可提取荧光重定位数值，并将图像转换为每个单细胞及每种细胞因子的分泌动态谱。因此，所得数据集可提供多种读数，例如随时间变化的定量分泌测量、共分泌亚群的鉴定，以及根据分泌量、分泌速率和细胞因子组合对细胞进行分布分析。
<img alt="单细胞分析工作流程；用于液滴生成的PDMS芯片；细胞因子检测；实验设置示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66492/66492fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：工作流程与检测原理。（A）刺激后分析分泌细胞因子的单细胞的工作流程概览。将单细胞悬液与磁性纳米颗粒混合，并封装成体积为60 pL的油/水乳液（液滴）。液滴在磁场中固定，纳米颗粒在其中排列，随后每30分钟进行一次测量，持续最长4小时。最后对图像进行分析，提取每个液滴在各个时间点及荧光通道中的参数。本图经修改自17。（B）液滴夹心生物检测原理。经功能化的纳米颗粒结合细胞分泌的细胞因子，促使荧光标记的检测抗体随之迁移至纳米颗粒表面。通过重组细胞因子的校准实验对荧光迁移信号进行量化与验证。使用不同功能化的纳米颗粒混合物，可实现最多三种细胞因子的多重同步检测。（C）在基于细胞的实验中，随测量时间推移追踪液滴，通过荧光信号在纳米颗粒上随时间增强的现象识别出分泌细胞。示意图未按比例绘制。图示使用BioRender.com创建。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66492/66492fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>008-FluoroSurfactant</td><td>RAN Biotechnologies</td><td>008-FluoroSurfactant-10G</td><td></td></tr><tr><td>双流聚焦液滴生成器，30 &amp;micro;m喷嘴，PFOS疏水表面处理</td><td>Wunderli 芯片</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 NHS 酯&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A20006</td><td>https://www.thermofisher.com/ch/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/fluorescent-amine-reactive-alexa-fluor-dye-labeling-of-igm-antibodies.html</td></tr><tr><td>抗人IL-1&amp;beta; （小鼠单克隆），AF647 体内标记</td><td>PeproTech</td><td>500-M01B</td><td></td></tr><tr><td>ARcare92524 双面胶带</td><td>粘附研究</td><td>ARcare92524</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Adembeads 链霉亲和素 plus 300 nm</td><td>Ademtech</td><td>货号#03233</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的山羊抗人IL-1&amp;beta;</td><td>PeproTech</td><td>500-P21BGBT</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>TPP</td><td>99002</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Violet 细胞增殖检测试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td>细胞染色液</td></tr><tr><td>Chromafil Xtra PTFE-45/25 注射器滤器</td><td>Macherey-Nagel</td><td>729205</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6孔透明平底超低吸附板</td><td>康宁</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Countess 细胞计数板载玻片</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>D-生物素</td><td>Fluorochem</td><td>M02926</td><td></td></tr><tr><td>不含钙、镁的DPBS</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>14196-094</td><td></td></tr><tr><td>epT.I.P.S.&amp;nbsp;标准 2-200 &amp;micro;l</td><td>Eppendorf</td><td>30000889</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3690</td><td></td></tr><tr><td>EZ-LINK-NHS-PEG4-生物素</td><td>ThermoFisher</td><td>A39259</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20217</td></tr><tr><td>人FcR封闭试剂</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>便捷洗洁精</td><td>Migros</td><td>5.01002×10¹¹</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>HFE-7500 油 3M™ Novec</td><td>Fluorochem</td><td>B40045191</td><td></td></tr><tr><td>Idex F-120 手拧一体式接头，标准滚花，天然聚醚醚酮（PEEK），1/16&quot; OD导管，10-32 锥形</td><td>Cole-Parmer</td><td>GZ-02014-15</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 单克隆抗体（MQ2-13A5 - 大鼠），FITC</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11-7069-81</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 单克隆抗体（MQ2-39C3），生物素标记</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>13-7068-85</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut血清替代物</td><td>ThermoFisher</td><td>10828-010</td><td></td></tr><tr><td>Loctite AA 3491 可紫外光固化的胶粘剂</td><td>Henkel AG &amp;amp; Co</td><td>3491</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片（76×26×1 mm，透明白色）</td><td>门策尔 Gl&amp;auml;血清</td><td></td><td></td></tr><tr><td>轻质矿物油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330779</td><td></td></tr><tr><td>NanoPort 无头组件，10-32 锥形，适用于 1/16&quot; 光密度</td><td>Idex</td><td>N-333</td><td></td></tr><tr><td>钕铁硼磁铁</td><td>K&amp;amp;J 磁性材料</td><td>BZX082</td><td></td></tr><tr><td>Omnifix-F 注射器，1 ml，LS</td><td>布劳恩</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>15140-122&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127, 0.2 &amp;micro;m 过滤（水中 10% 溶液）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>P6866</td><td></td></tr><tr><td>精密擦拭纸</td><td>Kimtech Science</td><td>5511</td><td></td></tr><tr><td>PTFE 微型管 0.30 &amp;times; 0.76 mm</td><td>FisherScientific</td><td>1191-9445</td><td></td></tr><tr><td>PTFE 微型管 0.56 &amp;times; 1.07 mm</td><td>FisherScientific</td><td>1192-9445</td><td></td></tr><tr><td>重组人 IL-1&amp;beta;</td><td>Peprotech</td><td>货号#200-01B</td><td></td></tr><tr><td>重组人 IL-6</td><td>Peprotech</td><td>货号#200-06</td><td></td></tr><tr><td>重组人血清白蛋白（HSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9731</td><td></td></tr><tr><td>重组人TNF-&amp;alpha;</td><td>Peprotech</td><td>货号#300-01A</td><td></td></tr><tr><td>可重复使用的活检穿孔器，直径分别为 0.75 mm 和 6 mm</td><td>施蒂费尔</td><td>&amp;nbsp;504529 和 504532</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基，无酚红</td><td>Gibco</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>标准LPS，大肠杆菌K12</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-eklps</td><td></td></tr><tr><td>23 号 Sterican 针头，适用于 0.56 mm 直径的微管</td><td>FisherScientific</td><td>15351547</td><td></td></tr><tr><td>27 号 Sterican 针头，适用于 0.30 mm 直径的微管</td><td>FisherScientific</td><td>15341557</td><td></td></tr><tr><td>TNF α 单克隆抗体（MAb11），PE标记</td><td>ThermoFisher</td><td>12-7349-81</td><td></td></tr><tr><td>TNF-α 单克隆抗体（MAb1），生物素化（实验室自制）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14-7348-85</td><td></td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝染色液，用于 Countess 自动细胞计数仪</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>真空过滤 &quot;快速&quot;-Filtermax</td><td>TPP</td><td>99500</td><td></td></tr><tr><td>设备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cameo 4 自动切割机</td><td>轮廓</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cetoni Base 120 + 3台NEMESYS低压注射泵</td><td>Cetoni</td><td>NEM-B101-03 A</td><td></td></tr><tr><td>Countess II 自动细胞计数仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒置落射荧光显微镜 Ti2</td><td>尼康</td><td>ECLIPSE Ti2-E，Ti2-E/B*1</td><td></td></tr><tr><td>OKO Lab 笼式培养箱，黑色面板</td><td>OKO Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Fusion 数字 CMOS 相机</td><td>滨松</td><td>C14440</td><td></td></tr><tr><td>SOLA 光源引擎</td><td>Lumencor</td><td>sola 80-10247</td><td></td></tr></tbody></table>

微流控方法解析单个多功能细胞同时与顺序性细胞因子分泌

Microfluidic Approach to Resolve Simultaneous and Sequential Cytokine Secretion of Individual Polyfunctional Cells

感染、自身免疫性疾病以及治疗过程中期望或不良的免疫学反应，均可引发体内复杂且动态的细胞因子反应。in vivo。该反应涉及多种免疫细胞分泌不同类型的细胞因子，以协调免疫应答。然而，由于缺乏合适的研究工具，目前对不同细胞亚群分泌细胞因子的动力学特征、分泌量及其共表达情况仍知之甚少。本文介绍了一种基于微流控液滴平台的实验方案，可在单细胞水平上实现对多种细胞因子分泌动力学的并行、时间分辨定量检测。该方法通过将单个细胞与多重免疫检测体系共同包裹于微流控液滴中，实现细胞因子浓度的并行定量；通过荧光成像对细胞因子进行固定和动态监测，并结合图像分析获取其分泌量与动力学参数。本方案以脂多糖刺激的人外周血单个核细胞为例，详细描述了功能化磁性纳米颗粒的制备、校准实验、细胞准备，以及细胞与纳米颗粒共同包裹进液滴后的荧光成像、图像处理与数据分析流程。该平台可识别单分泌与共分泌细胞之间不同的细胞因子分泌行为，刻画所测细胞样本中预期存在的表型异质性。此外，该检测方法具有模块化特性，可灵活调整并应用于多种蛋白质、细胞因子及细胞样本的研究，有望加深对不同免疫细胞类型之间相互作用，以及动态分泌的各类细胞因子在精细调控免疫应答中所起作用的理解。这些新见解在免疫失调相关研究、治疗靶向细胞群的识别及药物开发中可能具有重要意义。

本研究所展示的功能性单细胞平台能够测量多个参数。首先，与标准技术类似，测量结束时分泌细胞的频率如图所示（图4A）。外周血单个核细胞（PBMC）经1 µg/mL脂多糖（LPS）刺激6小时后，5.81%的细胞分泌IL-6（n=1270），4.55%分泌TNFα（n=995），6.06%分泌IL-1β（n=1326）。
为了定量细胞因子的分泌，使用已知浓度的重组细胞因子生成标准曲线（图 4B）。这些标准曲线可用于随时间定量液滴内细胞因子的浓度。以典型结果为例，LPS 刺激的外周血单个核细胞（PBMC）在液滴内的平均 IL-6 浓度在 90 分钟后达到平台期，而液滴内平均 IL-1β 浓度则从 90 分钟起上升更为迅速，体现了该平台的动态分辨率以及分离分泌特定细胞因子的细胞亚群的可能性（图 4C）。由于测量时间点之间的浓度发生变化，因此可计算每种细胞因子的动态分泌速率。根据每种细胞因子的平均分泌速率（图 4D），分泌 IL-6 的细胞表现出平均分泌速率持续下降的趋势，而分泌 TNFα 和 IL-1β 的细胞均在 90 分钟测量时间后分泌速率上升，并在 150 分钟后出现第二次下降。
此外，可根据分泌和共分泌的细胞因子将细胞聚类为不同的亚群（图 4E）。其中，单独分泌 IL-6 和 TNFα 的细胞分别占分泌 IL-6 或 TNFα 细胞总数的 30.2% 和 26.4%，而单独分泌 IL-1β 的细胞占所有分泌 IL-1β 细胞的 68.8%。此外，还可解析共分泌对分泌浓度和分泌速率的影响（图 4F）。通过分析 IL-6 分泌细胞发现，当细胞同时产生 TNFα 或 IL-1β 时，IL-6 的分泌量存在差异。类似地，在整个测量过程中，仅分泌 IL-6 的细胞，以及同时分泌 IL-6 与 TNFα（分泌率较高）或 IL-6 与 IL-1β（IL-6 分泌率较低）的细胞，其平均分泌速率的分布具有统计学上的显著差异。
<img alt="细胞因子分泌分析；IL-6、TNFα、IL-1β 水平；图表、饼图；LPS 诱导研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66492/66492fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：PBMC 经 1 µg/mL LPS 刺激 6 小时后分泌 IL-6、TNFα 和 IL-1β 的代表性结果。 （A）在 4 小时检测结束时分泌 IL-6、TNFα 和 IL-1β 的 PBMC 百分比。（B）使用已知浓度的重组细胞因子生成多重细胞因子标准曲线。这使得可通过重定位值计算液滴内细胞因子浓度，从而实现对细胞实验的定量。数据点采用非线性单相结合曲线拟合，r2=0.9926（IL-6）、0.9901（TNFα）、0.9990（IL-1β）。（C）在 4 小时检测时间内，分泌细胞释放的 IL-6、TNFα 和 IL-1β 的平均分泌浓度。（D）在 4 小时检测时间内，IL-6、TNFα 和 IL-1β 的平均分泌速率。（E）共分泌细胞中分泌 IL-6、TNFα 或 IL-1β 及其组合形式的相对百分比。归一化至每种细胞因子检测到的所有分泌细胞。（F）IL-6 分泌细胞在检测时间内的平均 IL-6 浓度及平均分泌速率（对数）分布，具有共分泌分辨能力（仅 IL-6 组 n=383，IL-6 + TNFα 组 n=531，IL-6 + IL-1β 组 n=213，IL-6+TNFα+IL-1β 组 n=143）。使用双侧、非配对、非参数 Kolmogorov-Smirnov 检验评估分泌速率分布的统计学差异（95% 置信度），p 值已标出。**（p &lt;0.002）和 ****（p &lt;0.0001）。实线表示中位数，虚线表示四分位数。n总细胞数 = 21 866。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66492/66492fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
为了在单细胞水平上提取更多信息，可将S形函数拟合到每个细胞和细胞因子的浓度-时间数据点上（图5）。图5A展示了一个细胞的典型浓度随时间变化的数据集及其相应的S形拟合曲线。在此，最小二乘法拟合过程得到以下参数：C，对应曲线的上限平台值；t50，表征曲线相对于零点的时间偏移；以及Hill斜率m，描述S形曲线上升段的陡峭程度，该段涵盖了测量过程中达到10%至90%浓度值的范围。根据这些拟合参数，可进一步提取出若干曲线特征参数，如步骤7.12所述，包括Cmax（数据中的最高浓度值）、tstart（分泌起始时间，定义为达到上限平台浓度值的10%时的时间点）和SRlin（曲线上升阶段的分泌速率）。
为了对细胞亚群进行分类，将从所有单细胞拟合中获得的曲线特征参数分别分为三类：Cmax 值分为低、中、高；tstart 分为早期、中期和晚期；SRlin 分为慢速、中速和快速分泌者。为说明该分类方法，展示了四个典型的单细胞分泌曲线及其相应的曲线特征参数（图5A-D），其中曲线A表现为早期、低分泌量、中等速率的分泌特征，曲线B为早期、慢速、高分泌量的分泌者，曲线C为早期、快速、高分泌量的分泌者，曲线D则表现为晚期、低分泌量的特征。需要注意的是，这些分类阈值取决于具体的细胞类型、细胞因子及实验参数，需根据每个具体的研究问题进行调整。此外，本研究仅考虑了外周血单个核细胞（PBMC）在1 µg/mL LPS刺激6小时后的IL-6分泌情况，结果显示大多数细胞为早期分泌者和高分泌者，分别占80%和79%（图5E-F）。在分泌速率方面，观察到一种双相响应，其中55%的IL-6分泌细胞为慢速分泌者，39%为快速分泌者（图5G）。
为进一步表征分泌行为，将每个细胞的曲线特征参数相互作图，并提取出不同的聚类群（图5H-J）。tstart 与 Cmax 之间未表现出明显相关性（图5H）：其中两个最大的细胞群分别为早期低分泌细胞和与分泌起始时间无关的高分泌细胞。在分析 tstart 与 SRlin 的关系时（图5I），大多数细胞为早期慢速分泌细胞，同时存在一个明显的早期高速分泌细胞亚群，以及少量从慢速/中等速度到晚期才开始分泌的细胞。在 SRlin 与 Cmax 的相关性分析中（图5J），几乎不存在快速低至中等分泌的细胞，仅存在较多的快速低分泌细胞群体。此外，存在一个较大的快速分泌细胞群体，其分泌行为不依赖于测得的最大浓度；同时存在两个高分泌细胞亚群，分别表现为慢速或快速分泌。综上所述，通过分析单个细胞曲线特征参数之间的关系，可以获得更为细致的分泌特征，并有望从单细胞分泌测量数据中挖掘出新的生物学发现。
通过上述分析，我们提取了共分泌细胞的分泌动态（图6）。两条示例曲线显示了来自两个单细胞的IL-6与TNFα共分泌的不同动态：一条曲线显示两种细胞因子同时开始分泌（图6A），另一条则显示分泌起始呈顺序性，其中IL-6首先分泌（图6B）。为了对所有共分泌细胞进行分类，我们定义了60分钟的分泌延迟阈值：所有在此时间范围内开始分泌的细胞被归类为同时分泌者，而延迟更长的细胞则被归类为顺序分泌者。该分析还可用于判断哪种细胞因子首先分泌。对于IL-6和TNFα，76%的细胞主要表现为同时共分泌（图6C）；而对于IL-6和IL-1β，86%的细胞表现为顺序共分泌，且大多数情况下IL-6是首先分泌的细胞因子（图6D）。
观察所有共分泌细胞中不同细胞因子分泌起始时间，实验中未发现分泌起始时间之间存在明显的相关性。对于IL-6与TNFα的共分泌（图6E），在0 min附近存在较大的纵向聚类，对应于共分泌细胞更倾向于以IL-6的分泌起始为主。对于IL-6与IL-1β的共分泌（图6F），大多数细胞在测量开始时即启动IL-6的分泌，而IL-1β则主要在后期分泌。综上所述，本文所呈现的分析方法能够识别出不同的分泌细胞亚群以及复杂的细胞因子共分泌动态。
<img alt="随时间变化的IL-6浓度测量；图表；分泌速率及统计分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66492/66492fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5：单个IL-6分泌细胞曲线不同分泌动态模式的详细分析。（A）测量时间内代表性单细胞因子浓度数据，包含拟合的S型曲线及提取的参数。（B-D）LPS刺激后发现的三种不同类型IL-6分泌细胞的典型单细胞因子浓度曲线。（E-G）根据以下标准分类为不同类型分泌细胞的IL-6分泌细胞所占百分比（n=633）：E. Cmax：低 &lt;5 nM，高 &gt;19.5 nM；F. tstart：早期 &lt;30 min，晚期 &gt;120 min；G. SRlin：慢 &lt;250 分子/s，快 &gt;750 分子/s。（H-J）每个单个细胞（n=633）的三种分泌曲线特征参数Cmax、tstart和SRlin之间的关系。Cmax=20 nM处的大峰群是由于达到检测方法的上限所致。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66492/66492fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="IL-6、TNFα 分泌动力学图；共分泌类型；统计分析；细胞生物学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66492/66492fig06v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
图6：从单细胞浓度曲线中提取共分泌模式。 （A-B）单个细胞同时（A）和相继（B）共分泌 IL-6 和 TNFα 的代表性浓度曲线。 （C-D）共分泌 IL-6 和 TNFα（n=249）或 IL-6 和 IL-1β（n=72）的细胞百分比。相继分泌定义为两种细胞因子分泌起始时间之间的延迟超过60分钟。颜色表示哪种细胞因子首先开始分泌。 （E-F）每个分泌细胞中不同细胞因子分泌起始时间之间的关系（nIL6-TNFα=249，nIL6-IL1β=72）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66492/66492fig06largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

该方案描述了一种先进的微流控平台，用于定量测量单个外周血单个核细胞的细胞因子分泌动态。以脂多糖刺激为例，该平台可对每个单个细胞并行检测多达三种细胞因子（IL-6、TNFα 和 IL-1β）。

感染、自身免疫性疾病以及治疗过程中期望或不良的免疫反应均可在体内引发复杂且动态的细胞因子反应。

在本项目中，我们致力于开发并应用新型分析策略，以实现对单细胞分辨率下细胞功能的直接、定量和深度分析。通过超越单纯的单数据点测量，我们旨在更深入地理解并利用源自宿主和组织中复杂响应的多功能性。要全面理解这些功能十分复杂且具有挑战性，需要采用跨学科的方法。因此，这一背景下的一个挑战是确保所开发检测方法的动态范围能够适当地捕捉分泌蛋白的含量及其动态变化，而这些蛋白在不同样本、制备方法和组织之间可能存在巨大差异。免疫反应调控的紊乱可引发多种疾病，导致从轻微发热到可能危及生命的严重并发症。在传统终点检测的基础上，我们提出在单细胞水平上直接动态测量免疫细胞的失调与活化状态，以获得更深入的见解。因此，细胞因子通常在特定时间点检测，以培养上清液中的浓度或活化细胞的百分比来表示。传统的批量检测方法用于量化每个细胞的分泌情况，但这种终点测量法会掩盖细胞间的异质性，无法区分同时分泌与继发性分泌，从而忽略了免疫应答的动态特性。细胞多能性是指免疫细胞同时分泌多种细胞因子的能力。这使得它们能够精细调节对威胁的应答，例如，动态地（即随时间变化）测量这种多功能性，可深入了解免疫应答的不同细微特征。首先，将带孔的玻片放置在清洁的表面上，等离子活化面朝上。沿切割方向小心地从双面胶带的一侧移除保护层。将胶带与载玻片的边缘及钻孔对齐。从载玻片的短边开始粘贴胶带，并确保其良好粘附。移除胶带的第二层保护膜后，将第二张载玻片的活化表面朝下放置。使用一块平板，利用上半身力量将两张载玻片压合在一起，持续10秒。翻转腔室，使孔洞朝向操作者。在纳米进样口下方的环形区域滴加少量紫外光固化胶。使用微管将纳米端口沿玻片上的孔滑入，并在端口周围涂上一圈紫外光固化胶。将1毫升用氟化油配制的1%溶液吸入注射器中。通过连接在聚四氟乙烯微管上的聚四氟乙烯注射器滤膜和针头，将溶液注入观察室。孵育1分钟后，在通风橱内使用氮气压力将包被溶液冲洗出来。使用另一套注射器组件，仅用氟化油冲洗腔室。首先，向用于TNF-α、白细胞介素-1β和白细胞介素-6检测的试管中加入链霉亲和素功能化的纳米颗粒。将链霉亲和素与纳米颗粒用等体积的磷酸盐缓冲液稀释。然后将生物素化捕获抗体溶液加入各管中，在室温下孵育30分钟。接着，向每管中加入0.01%的1毫摩尔D-生物素溶液，孵育5分钟。然后将一块钕磁铁靠近离心管以收集颗粒。弃去上清液，并立即用Pluronic F-127与PBS的混合液重新悬浮纳米颗粒，孵育30分钟。在储存缓冲液中孵育颗粒30分钟后，搅拌以确保形成均匀的混合物。在包封前立即混合白细胞介素6、TNF-α和白细胞介素1β的偶联纳米颗粒。随后，如前所述使用磁铁用完全培养基洗涤颗粒，并将磁珠重悬于完全培养基中。之后，加入针对白细胞介素6、TNF-α和白细胞介素1β的检测抗体，使其终浓度达到10纳摩尔。首先，用1毫升注射器吸取500微升的连续相。将PTFE微管连接至27号0.75英寸针头上。将该组件安装到注射器上，再将注射器安装到注射泵上。然后，使用0.75毫米的活检打孔器在PDMS切片的中央打一个孔。将约三厘米长的PTFE管从切片的孔中穿过，并将该组件推入200微升移液枪头的顶端。在移液枪头上方用紫外光固化胶密封连接处，并将管的另一端连接至23号1.25英寸的针头。接下来，用两个1 mL注射器各吸取500 µL轻质矿物油。使用定制的连接装置将两根23号针头连接到注射器上，并将其安装到注射泵上。通过注射泵控制软件，将功能化纳米颗粒与细胞溶液吸入水相的移液管尖端中。清洗制备好的观察室后，将其夹入装有两个钕磁铁且角度为30度的打印腔体支架中。打开两个端口，并在上端口塞入一张纸巾，以吸收填充过程中多余的外相液体。将连续相连接到微流控芯片的顶部入口。然后，以每小时1800微升的流速，用连续相冲洗芯片约30秒。将水相溶液的移液枪头连接至芯片的两个中间入口。以每种溶液每小时200微升的流速开始水相溶液的流动。当液体在出口处出现后，以每小时800微升的流速开始注入氟化油相。等待直至液滴生成趋于稳定，此时出口处将呈现均匀的灰白色有光泽溶液。随后，将PTFE微管连接至出口端口以收集液滴。使用指旋一体式接头的卡套模块，将流体直接导入观察室。待观察室充满后，停止流动，并用指旋压力将端口堵头拧紧以封闭端口。液滴生成后，先用氟化油冲洗芯片，再通入氮气以吹出任何残留液体。将腔室支架安装在带有孔板格式载物台的显微镜上。然后使用10倍物镜，将显微镜切换至明场通道。在明场下对固定化的液滴进行调焦，并将其移至腔室中央。然后，启动自动对焦系统。调整明场通道的测量平面，使液滴边缘呈现为清晰的黑色圆圈，能够与油相及背景明显区分。依次检查各个荧光通道，并为每个通道设置最佳的测量平面。进行位移测量时，需在 FITC、TRITC 和氰五（cyanine five）通道中观察纳米颗粒聚集体。

microfluidic-approach-to-resolve-simultaneous-sequential-cytokine

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

微流控方法解决单个多功能细胞的同时和连续细胞因子分泌 

本视频展示了一种基于微球的多重免疫检测试验，用于定量样本中多种细胞因子靶标。该方法使用一组与细胞因子特异性抗体偶联的不同微球，以结合样本中存在的细胞因子。通过生物素标记的检测抗体，将链霉亲和素标记的报告分子固定在已结合的细胞因子上。流式细胞术根据微球的独特大小和内部荧光强度来识别已结合的细胞因子，而报告分子的荧光强度则反映细胞因子的数量。...

一种基于微球的多重免疫检测法用于定量多种细胞因子靶标

我们开发了一种用于微尺度细胞刺激实验的自动化细胞培养与检测平台。该平台在培养和刺激少量细胞群体以及回收裂解液用于分子分析方面，具有操作简便、功能多样和控制精确的优点。该平台非常适合使用珍贵细胞和/或试剂的研究。...

一种用于微尺度细胞刺激实验的多功能自动化平台

本文介绍了一种用于单细胞分析的微流控芯片。该芯片可通过荧光检测或免疫检测方法，对细胞内蛋白质、酶、辅因子和第二信使进行定量分析。...

一种用于单细胞多功能化学分析的微流控芯片

本方案描述了利用基于微球的多重免疫检定平台和流式细胞仪，对经刺激的小鼠脾细胞培养上清液中多种细胞因子靶标进行同时定量的方法。...

利用基于细胞计数微球的免疫检测平台对刺激后的小鼠脾细胞进行多重细胞因子分析

本文介绍一种单细胞蛋白质组学方法，通过质谱流式细胞术分析外周全血样本中免疫表型及功能（细胞内细胞因子诱导）的变化。...

通过质谱流式细胞术对全外周血进行免疫表型和细胞因子产生的单细胞分析

批量基因表达检测会掩盖异质性细胞群体中单个细胞的差异。本文介绍了一种将单细胞基因表达分析与基于荧光激活细胞分选（FACS）的索引分选相结合的实验方案，可用于解析细胞异质性，并在分子水平上对免疫表型不同的细胞亚群进行特征鉴定。...

一种用于表征人类干细胞与祖细胞群体分子及免疫表型异质性的组合式单细胞方法

本文介绍了一种利用移液器吸头将稀有细胞群体接种至液滴微流控装置的实验方案，以提高细胞在液滴中的包封效率。...

一种基于移液枪头的细胞接种至液滴微流控平台的方法

本文描述了一种基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的多层微流控装置的制备过程，该装置可实现体外转录与翻译（IVTT）反应的长期进行。此外，还全面概述了实现并维持这些反应长期自动化的所需硬件与软件。...

一种用于持久无细胞基因表达的多层微流控平台

本报告介绍了一种基于微流控芯片的方法，用于建立单细胞培养实验，可实现多个单细胞的高效配对及显微分析。...

以微流控芯片确定性建立基于单细胞的共培养体系

我们介绍一种用于复杂生命机制高通量研究的微流控系统，该系统包含1500个培养单元、一组增强型蠕动泵以及一个现场混合模块。该微流控芯片可实现对体内高度复杂且动态变化的微环境条件进行分析。...

利用高通量微流控装置产生动态环境条件

基于全血的免疫分析法为诊断和研究目的分析抗原特异性免疫提供了简便且资源高效的工具。本文提供了一种经过优化的基于全血的实验方案，采用双重共刺激，可全面分析宿主对真菌和病毒病原体的免疫应答，包括适用于儿科患者和小型动物的低体积版本。...

通过双重共刺激的全血检测法用于抗原特异性分析宿主对真菌和病毒病原体的免疫应答

了解微流控技术如何同时定量检测单个免疫细胞分泌IL-6、TNF-α和IL-1β等多种细胞因子的动态变化。该方法为免疫学研究提供了重要的单细胞分析工具。

微流控方法解析单个多功能细胞同时与顺序性细胞因子分泌

探索更多视频