Name: 三维细胞培养模型研究嗜酸性粒细胞性食管炎中上皮屏障 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-10T14:20:00.000+00:00
Duration: 3 min 23 s
Description: 了解利用人食管类器官三维培养和气液界面技术研究IL-20亚家族细胞因子对嗜酸性粒细胞性食管炎上皮屏障功能影响的实验方法。该方案有助于揭示疾病发病机制并开发靶向治疗策略。

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J.H.N. 获得的瑞士国家科学基金会（SNSF）资助项目 310030_219210 在无任何限制条件下支持了本稿件的发表。图1 的制作得到了 BioRender.com 的协助。

本研究方案已获得瑞士西北部和中部伦理委员会（EKNZ；项目编号 2019-00273）的批准。所有患者在内镜检查前均签署了书面知情同意书，同意其活检样本用于实验研究。本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。
1. 食管类器官患者来源细胞的分离
注意：培养人食管类器官的培养基成分列表见表1。
<ol>
	<li>获取活检组织。 
	注意：在本研究中，使用工作通道为 2.8 mm 的胃镜，在食管胃十二指肠镜检查过程中用活检钳从同一段食管获取两份活检组织。</li>
	<li>将活检组织转移至市售的无血清角质形成细胞培养基（KSFM；Ca2+ 0.09 mM，1 ng/mL EGF，50 µg/mL BPE）中。 
	注意：活检组织可在冰上保存数小时，直至使用。</li>
	<li>用 1 mL Dispase I（10 U/mL）替换 KSFM 培养基，并在室温下孵育 10 分钟。</li>
	<li>在室温下以 300 × g 离心 2 分钟。</li>
	<li>使用 1000 µL 移液器吸取 Dispase 溶液，避免接触活检组织及细胞碎片沉淀。</li>
	<li>用 1 mL 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）冲洗活检组织。</li>
	<li>在室温下以 300 × g 离心 2 分钟。</li>
	<li>使用 1000 µL 移液器吸除上清液。</li>
	<li>在 37 °C、800 rpm 振荡条件下，用 500 µL 胰蛋白酶-EDTA（0.05%）孵育活检组织 10 分钟。</li>
	<li>通过反复吹打进行机械解离，直至获得单细胞悬液。</li>
	<li>使用结核菌素注射器的橡胶推杆头，将细胞通过 70 µm 细胞滤筛过滤。</li>
	<li>用 2–4 mL 大豆胰蛋白酶抑制剂（250 µg/mL）冲洗滤筛。</li>
	<li>将细胞通过带卡扣盖的 35 µm 细胞滤筛，滤入 5 mL 圆底聚苯乙烯管中。</li>
	<li>将单细胞悬液转移至 15 mL 锥形管中。</li>
	<li>在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>使用 1000 µL 移液器吸除上清液。</li>
	<li>用 100 µL KSFM 培养基重悬细胞。</li>
	<li>将 10 µL 台盼蓝与 10 µL 细胞悬液混合。</li>
	<li>使用自动细胞计数仪进行细胞计数。</li>
</ol>
2. 患者来源类器官培养
<ol>
	<li>计数后，在细胞悬液中加入 1–2 mL KSFM。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 300 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>用 1000 µL 移液器吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于基底膜提取物（BME）水凝胶基质中（每 20,000 个细胞使用 40 µL BME）。 
	注意：加入 BME 后，将细胞置于冰上，以防止 BME 过早凝固。</li>
	<li>剪掉 200 µL 移液枪头的尖端，用于吸取黏稠的 BME-细胞悬液混合物。</li>
	<li>在预热（37 °C）的悬浮细胞培养板中形成 40 µL 的液滴。</li>
	<li>将培养板在 37 °C 下孵育 20–30 分钟，期间不加培养基，以确保 BME 液滴完全凝固。</li>
	<li>加入预热的 KSFM-C 培养基，并添加 10 µM Y27632（ROCK 抑制剂），用于培养的前两天。</li>
	<li>每隔一天更换一次新的 KSFM-C 培养基（不含 Y27632，可选择性添加目标细胞因子）。</li>
	<li>吸除培养基，同时持续向孔中加入 1 mL Dispase II（1.5 U/mL），并用移液枪头刮下液滴。</li>
	<li>将 BME-Dispase 混合物转移至 15 mL 离心管中，在 37 °C 摇动水浴中孵育 20 分钟，以消化 BME。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 250 × g 离心 3 分钟，吸除 Dispase II。</li>
	<li>根据目标检测方法的相应方案继续操作（例如 RNA 提取、蛋白质提取，或用 4% 多聚甲醛固定用于组织学分析）。</li>
</ol>
3. 用于患者来源的气液界面（ALI）培养的细胞分离
<ol>
	<li>获取活检组织。在使用工作通道为2.8 mm的胃镜进行食管胃十二指肠镜检查期间，用活检钳从一段食管中取两块活检组织。</li>
	<li>将活检组织放入市售的无血清角质形成细胞培养基（KSFM；Ca2+ 0.09 mM，1 ng/mL EGF，50 µg/mL BPE）中，并置于冰上保存数小时，直至使用。</li>
	<li>用1 mL Dispase（10 U/mL）替换KSFM。随后，在室温下孵育活检组织10分钟。</li>
	<li>在室温下以300 × g离心2分钟。</li>
	<li>使用1000 µL移液器移除Dispase，注意不要触碰活检组织及细胞碎片沉淀。</li>
	<li>用1 mL DPBS洗涤活检组织。</li>
	<li>在室温下以300 × g离心2分钟，使活检组织沉淀。</li>
	<li>用1000 µL移液器吸除上清液。</li>
	<li>将活检组织在37 °C下用500 µL胰蛋白酶-EDTA（0.05%）孵育10分钟，并在孵育过程中以800 rpm持续混匀。</li>
	<li>通过反复吹打进行机械性破碎，直至获得单细胞悬液。</li>
	<li>使用结核菌素注射器的橡胶柱塞头将解离后的细胞通过70 µm细胞筛网，收集细胞至50 mL锥形管中。</li>
	<li>用2–4 mL大豆胰蛋白酶抑制剂（250 µg/mL）冲洗筛网，以回收残留于筛网上的细胞。</li>
	<li>使用带 snap cap 的35 µm细胞筛网将细胞过滤至5 mL圆底聚苯乙烯管中。</li>
	<li>将细胞转移至15 mL锥形管中。</li>
	<li>在4 °C下以300 × g离心5分钟。</li>
	<li>使用1000 µL移液器移除上清液。</li>
	<li>用含10 µM Y27632的4 mL KSFM培养基（Ca2+ 0.09 mM）重悬细胞沉淀。</li>
	<li>将细胞转移至T25细胞培养瓶中。</li>
	<li>为扩增原代角质形成细胞，培养细胞约1周，直至达到60%–80%融合度。 
	注意：第0代（P0）细胞形成类岛状细胞团，不呈单层生长。原代角质形成细胞从第1代（P1）开始形成单层。</li>
	<li>当细胞融合度达到60%–80%时进行传代，将P1代细胞重新接种至2–3个T25或1–2个T75细胞培养瓶中。</li>
	<li>当角质形成细胞形成融合度为60%–80%的单层时，再次对P1代细胞进行传代。</li>
</ol>
4. 患者来源的气液界面（ALI）培养
<ol>
	<li>将P2代原代角质形成细胞接种到Transwell小室中用于气液界面（ALI）培养。 
	注意：在12孔Transwell插入式培养板中接种400,000个细胞（每0.6 cm2接种200,000个角质形成细胞），加入500 µL KSFM培养基（Ca2+ 0.09 mM，1 ng/mL EGF，50 µg/mL BPE）。
	<ol>
		<li>在24孔Transwell插入式培养板中接种150,000个细胞（每0.5 cm2接种155,000个角质形成细胞），加入100 µL KSFM培养基（Ca2+ 0.09 mM，1 ng/mL EGF，50 µg/mL BPE）。</li>
		<li>或者，将细胞在含10% DMSO的KSFM培养基（Ca2+ 0.09 mM）中于-80 °C冷冻保存24小时，随后转移至液氮中以备后续使用。 
		注意：使用冻存细胞时，解冻后需再传代一次，方可用于气液界面（ALI）培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向Transwell培养板插入式小室下方的下室中添加培养基。 
	注意：对于12孔板，加入1.5 mL KSFM培养基（Ca2+ 0.09 mM，1 ng/mL EGF，50 µg/mL BPE）；对于24孔板，加入600 µL KSFM培养基（Ca2+ 0.09 mM，1 ng/mL EGF，50 µg/mL BPE）。</li>
	<li>接种2天后，更换为高钙KSFM培养基（Ca2+ 1.8 mM，1 ng/mL EGF，50 µg/mL BPE）。</li>
	<li>每隔两天更换一次高钙KSFM培养基，持续至第7天。</li>
	<li>在第7天进行气液界面（airlift）操作：吸除上室中的培养基，并将下室中的培养基更换为含10 ng/mL KGF（=FGF7）和75 µg/mL抗坏血酸（AA）的高钙KSFM培养基（Ca2+ 1.8 mM，1 ng/mL EGF，50 µg/mL BPE）。
	<ol>
		<li>可选：向培养基中加入所需浓度的目标细胞因子。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每隔两天更换一次培养基，持续至第14天。</li>
</ol>
5. 跨上皮电阻（TEER）测量
<ol>
	<li>将TEER仪电极浸入24孔板的一个孔中，该孔内含有5%次氯酸钠溶液，浸泡10-15分钟以对电极进行灭菌。</li>
	<li>将电极依次浸入4个含有无菌ddH2O的孔中，以彻底清洗去除5%次氯酸钠，随后让电极自然晾干。</li>
	<li>将一个电极放入孔中，另一个电极放入Transwell小室插入物中，并向插入物内加入PBS，测量TEER值以设定空白对照。 
	注意：TEER测量推荐加样体积：12孔板（孔内1900 µL，插入物内900 µL）；24孔板（孔内750-1000 µL，插入物内250 µL）。</li>
	<li>用室温无菌PBS替换ALI培养物中的培养基。 
	注意：先从下层孔中移除培养基，再从Transwell小室插入物中移除。加入PBS时，应先加入插入物中，再加入下层孔中，以防止ALI培养物从Transwell膜上脱落。</li>
	<li>将TEER仪电极放入含有ALI培养物的实验孔中，进行TEER测量1。 
	注意：每次更换培养基前，每隔两天进行一次TEER测量。</li>
</ol>
6. 大分子通量
<ol>
	<li>将FITC-葡聚糖（3-5 kDa）储备液稀释至工作浓度1 mg/mL。 
	注意：始终避免FITC-葡聚糖暴露于光线下。</li>
	<li>配制一系列FITC浓度递减的稀释液（1000 µg/mL至0.25 µg/mL），作为检测的标准曲线。</li>
	<li>向Transwell小室的上层加入500 µL FITC-葡聚糖溶液（1 mg/mL），向底层加入1.5 mL培养基（含或不含目标细胞因子），并将培养板放入培养箱中。</li>
	<li>在相应时间点（例如0 min、15 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min和180 min）从底层收集120 µL培养基。</li>
	<li>将每个时间点的样品取50 µL，重复加样两次，加入至黑色96孔透明平底板中。</li>
	<li>使用酶标仪在490 nm激发FITC-葡聚糖，并在520 nm波长处读取发射光信号。</li>
	<li>根据标准曲线计算大分子通量。</li>
</ol>

Human Esophageal Organoids and Air-Liquid Interface Culture Protocols

作者无任何利益冲突需要披露。

所提供的操作步骤可高效地培养患者来源的类器官和气液界面（ALI）培养物。类器官培养方案借鉴了首个报道人类食管类器官生成的已发表方案26，并参考了近期发表的另一项方案32。Sherill 及其同事已描述了ALI模型22。在研究食管疾病（如嗜酸性食管炎EoE5,26）背景下细胞因子及其他介质对食管上皮屏障的影响时，类器官与ALI培养模型可相互补充、协同应用。
类器官培养方案的一个优势在于其培养过程和细胞培养基成分的简便性。与其他大多需要添加多种昂贵补充剂和生长因子的ASC和PSC相关方案24,25,27,28,33相比，KSFM培养基相对便宜，仅需添加人重组表皮生长因子（hEGF）和牛垂体提取物（BPE）。KSFM是一种为角质形成细胞培养优化的基础培养基，无需使用成纤维细胞饲养层34。必须使用CaCl2 将KSFM中的Ca2+浓度从0.09 mM滴定至0.6 mM，以获得用于类器官培养的KSFM-C培养基。气液界面（ALI）培养所需的Ca2+浓度（1.8 mM）高于类器官模型。较高的Ca2+浓度对于启动角质形成细胞分化至关重要，继而促进食管类器官中典型的多层鳞状上皮的洋葱样结构形成26,34,35，以及ALI培养中的上皮分层22。
在细胞分离过程中，为防止角质形成细胞过早分化、类器官及气液界面（ALI）培养的生成，需避免高浓度 Ca2+。早期分化会降低克隆形成能力，并阻碍类器官的自组织形成，以及未分化角质形成细胞融合单层的建立——后者是 ALI 培养的基础。在细胞分离过程中使用含血清培养基终止胰蛋白酶的酶活性，会因诱导角质形成细胞过早分化而影响类器官的成功生成，其效果类似于在细胞分离过程中使用富含 Ca2+ 的培养基36。因此，建议在活检组织经胰蛋白酶消化后，使用大豆胰蛋白酶抑制剂或其他无血清胰蛋白酶抑制剂来终止酶反应。在培养的前两天，培养基中需添加 Rho 激酶（ROCK）抑制剂 Y27632，以提高克隆形成率。抑制 ROCK 具有抗凋亡作用，可防止角质形成细胞衰老，从而提高类器官形成效率37,38。
建议在40 µL基底膜提取物（BME）液滴中接种约20,000个细胞，以确保类器官培养的良好生长；对于气液界面（ALI）培养，则建议接种150,000至400,000个细胞。适当的细胞接种数量可保证后续转录组学、蛋白质组学和组织学分析所需的足够材料。当使用如人食管上皮细胞系EPC2-hTERT等细胞系时，由于该细胞系表现出更高的类器官形成率，接种细胞数量可适当减少26。这一现象可能归因于细胞系相较于活检来源的原代细胞具有更高的均一性和更佳的细胞周期同步性。永生化的EPC2-hTERT细胞系还保留了其增殖能力，可实现类器官的无限传代。
相反，源自食管活检的人类类器官无法长期培养26,28。完全发育的食管类器官中分裂活跃的活细胞数量减少，且每次传代后类器官形成率逐渐下降26，这表明源自原代细胞的类器官增殖能力丧失是由于前体细胞发生了终末分化和角化。此前尝试通过在培养基中添加Noggin、Wnt3a或A83-01来维持其增殖能力均未成功26,28,32。因此，患者来源的食管类器官的长期生物保藏仍是未来研究中亟待解决的难题。
类器官培养技术的出现带来了新的实验可能性，极大地推动了对嗜酸性食管炎（EoE）中导致上皮改变的关键炎症介质和环境因素的发现5,39,40,41,42然而，必须指出的是，ASC 和 PSC 来源的食管类器官存在局限性，因其无法完全重现食管的所有细胞组分。ASC 来源的类器官仅能重现上皮组分24,26,27,33，而由PSC衍生的类器官可重现上皮、内皮和间充质区室28,43,44然而，目前所有的类器官模型均缺乏免疫微环境。在最近的一项研究中，研究人员利用IL-20细胞因子家族的细胞因子刺激人食管类器官和气液界面（ALI）培养物，以解析嗜酸性食管炎（EoE）中上皮屏障功能障碍的新机制。5结合这两种三维培养模型，可评估上皮屏障完整性的间接和直接指标。未来可能会有更多研究将食管类器官与气液界面（ALI）培养相结合，以阐明特定细胞因子对上皮的影响。尽管该方法通过简化免疫系统与上皮之间的复杂相互作用，有助于揭示特定介质对上皮的功能作用，但其忽略了其他许多可能参与的因素。将类器官与器官芯片技术相结合，可能为克服这一局限性提供解决方案。基于微流控的器官芯片技术能够模拟管状器官的管腔和基底外侧微环境，实现免疫细胞及其他循环和管腔组分的流入与流出，从而可在稳态和疾病状态下研究上皮与免疫细胞之间的相互作用。45,46在器官芯片平台上成功培养出具有完整上皮屏障和功能性跨上皮离子转运的生理极化肾小管类器官47 支持类器官芯片技术在患者来源样本中的扩展应用。此外，通过在管状类器官顶端的微流控通道中引入管腔流，清除脱落的上皮细胞，实现了利用原代细胞来源类器官进行长期培养，展示了类器官芯片技术的另一项进展。46此类进展凸显了该技术在复制方面的潜力 体内 环境 体外.
培养出从上皮结构到包含大多数细胞类型的近乎完整微型器官的三维类器官的能力，促使人们探索其潜在的临床应用5,26,46。尽管近年来已取得显著进展，但在类器官应用于临床实践之前，仍需克服若干障碍。类器官临床转化的一个重大挑战是培养基和支架细胞外基质（ECM）产品中含有动物源性蛋白。虽然目前已存在无动物蛋白的角质形成细胞培养基，且不含牛垂体提取物（BPE）的KSFM变体也已陆续出现，但要开发出在性能和培养效果上与传统ECM产品相当的无动物源性ECM替代物仍更具挑战性。最近，已有研究报道了一种可能具有前景的全化学合成替代方案48。然而，目前尚无任何商业化、无动物来源的ECM产品可供使用。
食管类器官和气液界面培养是研究嗜酸性粒细胞性食管炎（EoE）的重要工具。采用本文所提供的方案进行类器官和气液界面培养，为揭示上皮组分在嗜酸性粒细胞性食管炎中的作用奠定了基础

关键词：食管类器官，气液界面培养，嗜酸性粒细胞性食管炎，上皮细胞，类器官培养，ALI培养5,26,39,41,42,49,50这些方案的简便实施以及三维细胞培养技术的持续进步，有助于实验更接近地模拟 体内 环境，从而提高研究成果的可转化性，并可能逐步减少动物实验。

食管炎症会破坏上皮屏障的完整性1,2,3,4,5，这在嗜酸性粒细胞性食管炎（EoE）中已有观察，EoE 是一种以 Th2 为主导的食管慢性炎症性疾病6。EoE 首次描述于 20 世纪 90 年代7,8，主要由食物抗原诱发9,10,11,12,13。成人人群中 EoE 最常见的症状是吞咽困难和食物嵌塞14。在儿童中，EoE 通常表现为生长迟滞、拒食、呕吐和腹痛15。全基因组关联研究（GWAS）已鉴定出参与上皮屏障完整性调控的 EoE 风险基因，使上皮成为 EoE 研究的重点16,17,18。EoE 转录组学进一步揭示，上皮细胞分化过程受损以及反应性基底层增生导致食管上皮屏障功能障碍3,5,19,20,21,22。早期认为 EoE 是一种由 Th2 介导的疾病6，这一认识促使研究发现 IL-13 是通过破坏上皮完整性而发挥驱动作用的关键介质3,4,21,23。实验体系能够将细胞因子介导的上皮完整性影响与遗传易感性导致的内在屏障损伤区分开来，从而为研究 EoE 中免疫细胞与上皮之间的复杂相互作用提供了可能。人源食管类器官和气液界面（ALI）培养系统已被提出作为分析细胞因子刺激对上皮完整性影响的重要工具5。
在2009年首次报道利用小肠Lgr5+成体干细胞（ASC）构建出肠类器官后的五年，才建立了首个生成成体组织特异性干细胞（ASC）来源的食管类器官的实验方案24。DeWard等人率先利用小鼠食管上皮细胞成功生成了类器官25。2018年，Kasagi等人利用永生化的人食管鳞状上皮细胞系EPC2-hTERT以及来源于患者的原代细胞，成功构建了人源食管类器官26。同年，Zhang等人成功构建了诱导性多能干细胞（iPSC）来源的食管类器官，明确了TGFβ和骨形态发生蛋白（BMP）信号通路抑制在食管前体细胞（EPC）发育过程中的重要意义，并揭示了Notch信号通路在复层鳞状上皮分化中的关键作用26,27。Trisno及其同事进一步补充了这些发现，鉴定出Sox2是一种Wnt通路抑制因子，可引导细胞发育命运向食管方向分化28。随后对实验方案、培养基成分及培养条件的不断优化，显著提高了类器官的形成率，并实现了类器官的传代培养以及冻存后的复苏26,29,30,31,32。尽管这些类器官是研究组织结构以及细胞因子刺激后潜在靶基因表达的有力工具，但它们无法用于测量跨上皮电阻（TEER）或大分子通量，而这两项指标是评估上皮屏障完整性的直接参数。正如Sherrill及其同事此前所述22，气液界面（ALI）培养模型可用于模拟上皮细胞分化4&#160;，并可直接评估上皮屏障的完整性。将患者来源的类器官与ALI培养系统相结合，是研究嗜酸性食管炎（EoE）中组织结构和上皮屏障完整性的有力工具。
以下是分离食管活检组织中活细胞并建立食管类器官和气液界面（ALI）培养物的操作步骤和说明，这些培养物可进一步用于研究细胞因子对屏障完整性的效应。

<table><tbody><tr><td>1250 &amp;micro;L Griptip - 滤芯吸头</td><td>Integra</td><td>4445</td><td></td></tr><tr><td>300 &amp;micro;L Griptip - 滤芯吸头</td><td>Integra</td><td>4435</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;M细胞滤筛</td><td>Sarstedt</td><td>83.3945.070</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich（默克）</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>牛垂体提取物</td><td>Gibco（Thermo Fisher Scientific）</td><td>3700015</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich（默克）</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>用于悬浮培养的细胞培养多孔板 CELLSTAR</td><td>Greiner Bio-One</td><td>7.657 185</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 基底膜提取物（BME），2 型，Pathclear</td><td>R&amp;amp;D Systems（Bio-Techne）</td><td>3532-010-02</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO） &gt;99.5% 生物科学级</td><td>卡尔·罗特</td><td>A994</td><td></td></tr><tr><td>Dispase I</td><td>康宁</td><td>354235</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma-Aldrich（默克）</td><td>D4693</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液&amp;nbsp; （DPBS）</td><td>Sigma-Aldrich（默克）</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EVE全自动细胞计数仪</td><td>NanoEntek</td><td>EVE-MC</td><td></td></tr><tr><td>EVE 细胞计数板</td><td>NanoEntek</td><td>EVS-050</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 mL 圆底聚苯乙烯试管，带细胞滤网 snap cap</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖</td><td>Sigma-Aldrich（默克）</td><td>FD4</td><td>平均分子量 3000-5000</td></tr><tr><td>Heraeus - Megafuge&amp;nbsp; 40R&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>75004518</td><td></td></tr><tr><td>人重组表皮生长因子</td><td>Gibco（Thermo Fisher Scientific）</td><td>3700015</td><td></td></tr><tr><td>角质形成细胞无血清培养基</td><td>Gibco（Thermo Fisher Scientific）</td><td>17005042</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco（Thermo Fisher Scientific）</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>重组人KGF/FGF-7蛋白</td><td>R&amp;amp;D Systems（Bio-Techne）</td><td>251-KG-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 螺口管</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>单通道 EVOLVE 100-1000 &amp;micro;L&amp;nbsp;</td><td>Integra</td><td>3018</td><td></td></tr><tr><td>单通道 EVOLVE 20-200 &amp;micro;L&amp;nbsp;</td><td>Integra</td><td>3016</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td></td><td>1134950</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td></td></tr><tr><td>大豆（Glycine max）胰蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma-Aldrich（默克）</td><td>T9128</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>SAFC 生物科学（默克）</td><td>59418C</td><td></td></tr><tr><td>Y27632 二盐酸盐</td><td>Tocris（Bio-Techne）</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

用于研究嗜酸性粒细胞食管炎上皮屏障的三维细胞培养模型

Three-Dimensional Cell Culture Models to Investigate the Epithelial Barrier in Eosinophilic Esophagitis

食管的鳞状上皮直接暴露于外界环境，持续接触外来抗原，包括食物抗原和微生物。维持上皮屏障的完整性对于预防感染以及避免由无害食物来源抗原引发的炎症至关重要。本文提供了从患者活检组织中建立人源食管类器官和气液界面培养体系的简化实验方案，用于在组织稳态和疾病背景下研究食管的上皮结构。这些方案在过去十年中具有重要的科学意义，首次实现了从患者来源的原代细胞中构建出三维、类器官结构以及气液界面培养模型。这些模型能够在保持供体表型和遗传特性的前提下，于三维环境中研究特定细胞因子、生长因子及信号通路在食管上皮中的功能。类器官可通过细胞因子刺激后的转录组和蛋白质组分析，提供有关组织微结构的信息；而气液界面培养体系则可用于通过跨上皮电阻（TEER）或大分子通量测定来评估上皮屏障的完整性。结合使用类器官与气液界面培养体系，是推动食管上皮屏障功能障碍相关研究的有力工具。

食管类器官将根据所提供的实验方案，由从患者活检样本中提取的原代细胞生长而成，这一过程可通过倒置明场显微镜观察（图1）。在将分离的细胞接种于基底膜提取物（作为支架）后，上皮干细胞（ASCs）在培养的最初两天内开始以自组织方式形成细胞簇。在倒置明场显微镜下可见，细胞簇的大小和数量在第一周内持续增加（图2）。然而，此时细胞簇尚未形成食管类器官典型的洋葱样多层结构。在培养第9天，类器官呈现出明显的洋葱样多层结构，并在中心区域出现逐渐增大的角化核心（图2A）。类器官培养最多可维持21天26。然而，已有研究表明，类器官在第11至第14天之间达到完全成熟并获得最大尺寸。从第11天起，培养过程主要表现为角化程度不断加深，同时代谢活跃的活细胞数量减少5,26。因此，获取用于实验的类器官的最佳时间取决于所需的研究分化阶段，通常在培养第5至第11天之间。
由于不断增大的角蛋白核心会减少存活细胞的数量，类器官在停止生长前最多可传代3次。可根据需要在特定时间点收获类器官，用于RNA或蛋白质提取以分析基因/蛋白表达，或用于组织学检查及生物样本库保存。
气液界面培养和类器官培养的初始细胞分离步骤相同。与类器官培养方案不同，在建立气液界面培养之前，必须对新分离的原代细胞进行扩增。第二次传代后，将原代角质形成细胞接种到Transwell小室上，并在低钙浓度培养基中培养，以诱导单层形成并防止原代角质形成细胞过早分化。48小时后，当形成融合的单层细胞时，将培养基中的钙浓度提高至1.8 mM，从而诱导上皮层的分化和分层。7天后，通过气液界面将多层上皮的顶端暴露于空气中，以诱导角化。气液界面培养通常可维持长达14天（图2B）。通过跨上皮电阻（TEER）测量和大分子通量实验来监测上皮的功能性。本研究中，在来源于原代食管角质形成细胞的气液界面培养、在每个孔底部含有NIH/3T3成纤维细胞饲养层的原代角质形成细胞气液界面培养，以及在每个小室上均含有NIH/3T3成纤维细胞饲养层的原代角质形成细胞气液界面培养中进行了TEER测量（图2C）。
<img alt="类器官培养过程：样本采集、酶解离、培养、分析；示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66503/66503fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：患者来源的食管类器官培养流程。 本示意图展示了样本采集、细胞分离、类器官培养以及患者来源食管类器官潜在实验应用的全过程。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66503/66503fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="角质形成细胞培养生长阶段、组织学切片、TEER图；实验细胞生物学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66503/66503fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：患者来源的食管类器官的形成与分化。（A）由患者活检组织来源的原代细胞培养的食管类器官的代表性明场图像。（B）由活检组织来源的原代细胞在第14天培养的食管气液界面（ALI）培养物的代表性明场图像。比例尺：50μM。（C）原代食管角质形成细胞在气液界面（ALI）培养中，在指定时间点测得的跨上皮电阻（TEER）值，包括：仅原代角质形成细胞的ALI培养、在每孔底部添加NIH/3T3成纤维细胞饲养层的原代角质形成细胞ALI培养，以及在每个插入物下方角质形成细胞层之下添加NIH/3T3成纤维细胞饲养层的ALI培养。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66503/66503fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">培养基</td>
			<td>KSFM</td>
			<td>KSFM-C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">基础培养基</td>
			<td>Keratinocyte-SFM</td>
			<td>Keratinocyte-SFM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">添加物</td>
			<td>青霉素/链霉素</td>
			<td>1%</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>牛垂体提取物（BPE）</td>
			<td>50 μg/mL</td>
			<td>50 μg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>表皮生长因子（EGF）</td>
			<td>1 ng/mL</td>
			<td>1 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>氯化钙（CaCl2）</td>
			<td>0.09 mM</td>
			<td>0.6 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632（ROCK抑制剂）</td>
			<td>-</td>
			<td>10 μM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：源自原代细胞的食管类器官培养基。 培养人食管类器官的培养基成分列表。SFM：无血清培养基。

本文提供了一种人食管类器官及其气液界面培养的实验方案。食管类器官的气液界面培养可用于研究细胞因子对食管上皮屏障功能的影响。

食管的鳞状上皮直接暴露于外界环境，持续接触包括食物抗原在内的各种外来抗原以及……

我们正在研究嗜酸性粒细胞性食管炎的病理生理机制，试图揭示引发并促进EoE慢性炎症过程的炎症级联反应。通过聚焦于上皮屏障功能障碍，并鉴定出参与疾病发病机制的新型免疫介质，进而推动了针对这些免疫介质的治疗性抗体的获批。我们已鉴定出IL-20亚家族细胞因子是一类通过MAP激酶通路损害上皮细胞分化与角化过程的炎症介质，从而导致上皮屏障功能受损。首先，取浸泡在无血清角质形成细胞培养基（KSFM）中的食管活检样本。将KSFM替换为1毫升Dispase 1，室温下孵育活检样本10分钟。随后，使用1,000微升移液器吸取Dispase，注意不要触碰活检样本或细胞碎片沉淀。然后用DPBS冲洗活检组织。将活检组织离心后，使用1,000微升移液器吸除上清液。接着向活检组织中加入500微升胰蛋白酶-EDTA溶液，在37°C下以800 RPM振荡孵育10分钟。然后反复吹打直至获得单细胞悬液。使用结核菌素注射器的橡胶活塞头，将细胞通过70微米的细胞滤器过滤。随后，用2至4毫升大豆胰蛋白酶抑制剂冲洗滤器。接下来，将细胞通过带有卡扣盖的35微米细胞筛，过滤至一个5毫升圆底聚苯乙烯管中。离心细胞悬液后，使用1,000微升移液器吸除上清液。将细胞沉淀重悬于基底膜提取物水凝胶基质中，并在预热的悬浮细胞培养板中形成40微升的液滴。 然后，将培养板在37摄氏度下无培养基孵育20至30分钟，以确保基底膜提取物液滴的凝固。加入预热的KSFM培养基，并补充10 µM Y-27632。在第9天，可观察到类器官中心出现洋葱样多层结构及逐渐增大的角化核心。首先，取食管活检组织中分离的细胞，将其重悬于4毫升含10微摩尔Y-27632的KSFM培养基中。将细胞转移至T25细胞培养瓶中。待角质形成细胞形成60%至80%融合度的单层细胞后，传代P1代细胞。然后将P2代原代角质形成细胞接种到Transwell小室中，用于气液界面培养。在第7天进行气液界面提升时，将下室中的培养基更换为高钙KSFM，并吸走上室中的培养基。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

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