用于研究嗜酸性粒细胞食管炎上皮屏障的三维细胞培养模型
2024年5月10日
本文提供了一种人食管类器官及其气液界面培养的实验方案。食管类器官的气液界面培养可用于研究细胞因子对食管上皮屏障功能的影响。
我们正在研究嗜酸性粒细胞性食管炎的病理生理机制，试图揭示引发并促进EoE慢性炎症过程的炎症级联反应。通过聚焦于上皮屏障功能障碍，并鉴定出参与疾病发病机制的新型免疫介质，进而推动了针对这些免疫介质的治疗性抗体的获批。我们已鉴定出IL-20亚家族细胞因子是一类通过MAP激酶通路损害上皮细胞分化与角化过程的炎症介质，从而导致上皮屏障功能受损。
首先，取浸泡在无血清角质形成细胞培养基（KSFM）中的食管活检样本。将KSFM替换为1毫升Dispase 1，室温下孵育活检样本10分钟。随后，使用1,000微升移液器吸取Dispase，注意不要触碰活检样本或细胞碎片沉淀。
然后用DPBS冲洗活检组织。将活检组织离心后，使用1,000微升移液器吸除上清液。接着向活检组织中加入500微升胰蛋白酶-EDTA溶液，在37°C下以800 RPM振荡孵育10分钟。
然后反复吹打直至获得单细胞悬液。使用结核菌素注射器的橡胶活塞头，将细胞通过70微米的细胞滤器过滤。随后，用2至4毫升大豆胰蛋白酶抑制剂冲洗滤器。
接下来，将细胞通过带有卡扣盖的35微米细胞筛，过滤至一个5毫升圆底聚苯乙烯管中。离心细胞悬液后，使用1,000微升移液器吸除上清液。将细胞沉淀重悬于基底膜提取物水凝胶基质中，并在预热的悬浮细胞培养板中形成40微升的液滴。
然后，将培养板在37摄氏度下无培养基孵育20至30分钟，以确保基底膜提取物液滴的凝固。加入预热的KSFM培养基，并补充10 µM Y-27632。在第9天，可观察到类器官中心出现洋葱样多层结构及逐渐增大的角化核心。
首先，取食管活检组织中分离的细胞，将其重悬于4毫升含10微摩尔Y-27632的KSFM培养基中。将细胞转移至T25细胞培养瓶中。待角质形成细胞形成60%至80%融合度的单层细胞后，传代P1代细胞。
然后将P2代原代角质形成细胞接种到Transwell小室中，用于气液界面培养。在第7天进行气液界面提升时，将下室中的培养基更换为高钙KSFM，并吸走上室中的培养基。
概述
本文介绍了一种培养人食管类器官并利用气液界面培养来研究细胞因子对食管上皮屏障影响的实验方案。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 免疫学
背景
- 嗜酸性粒细胞性食管炎（EoE）的特征是慢性炎症。
- 上皮屏障功能障碍在EoE发病机制中起核心作用。
- 目前正不断发现新的免疫介质，以明确其在EoE中的作用。
- IL-20亚家族细胞因子已被证实与上皮屏障功能障碍相关。
研究目的
- 研究嗜酸性粒细胞性食管炎中的炎症级联反应。
- 鉴定影响上皮屏障功能的免疫介质。
- 开发靶向这些介质的治疗策略。
使用的方法
- 食管活检样本在无血清角质形成细胞培养基中进行培养。
- 使用 Dispase 1 消化活检组织，以进行后续分析。
- 采用气液界面培养法研究细胞因子的作用。
- 研究 MAP 激酶信号通路在上皮功能障碍中的作用。
主要结果
- 鉴定IL-20亚家族细胞因子为关键的炎症介质。
- 阐明其对上皮细胞分化和角化过程的影响。
- 证实细胞因子可导致上皮屏障功能受损。
- 揭示MAP激酶通路在嗜酸性食管炎（EoE）中的参与作用。
结论
- 该研究加深了对嗜酸性食管炎病理生理机制的理解。
- 研究指出了潜在的治疗干预靶点。
- 未来的研究可聚焦于细胞因子调控，以恢复屏障功能。
常见问题
执行层面的行业相关性
三维食管类器官和气液界面模型能够对嗜酸性粒细胞性食管炎中上皮屏障功能障碍的机制进行去风险化研究。这些源自患者的系统为目标靶点验证和信号通路解析提供了可预测的信心，支持从发现到临床前研究的转化连续性。通过阐明细胞因子和信号通路对屏障完整性的影晌，这些模型的应用推动了研发组合决策的进展。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可探究细胞因子驱动的上皮屏障功能障碍的潜在机制。
- 支持在疾病相关组织中对免疫介质及信号通路进行功能验证。
- 通过模拟患者特异性的上皮反应，促进生物学风险的降低。
- 为靶点选择与优先级排序提供具有预测信心的平台。
筛选与检测方法开发
- 制备经过验证的类器官和气液界面系统，用于定量屏障功能检测。
- 实现上皮细胞跨膜电阻和大分子通量的可重复测量。
- 支持下游化合物或生物制剂筛选的检测标准化。
- 允许对候选干预措施在上皮完整性方面进行可扩展的评估。
转化与临床前研究
- 将体外屏障模型与疾病相关的患者表型相匹配。
- 保留供体特异性的遗传和表型特征，用于转化生物标志物研究。
- 支持针对上皮功能障碍的治疗假设进行风险调整后的推进。
- 实现从机制发现到屏障修复策略临床前验证的连续性。
流程与工作流整合
这些模型通过在患者来源的系统中实现假设验证、屏障功能的定量评估以及通路分析，架起了早期发现与临床前研究之间的桥梁。
- 发现生物学：支持对细胞因子及通路在上皮细胞分化和屏障功能中作用的机制性检测。
- 筛选：提供可重复的定量输出结果，如跨上皮电阻（TEER）和大分子通量，用于比较分析。
- 分析：在细胞因子刺激后提供转录组学和蛋白质组学的检测结果，用于通路解析。
- 转化研究：通过使用原代患者细胞，保持与疾病的相关性以及生物标志物的一致性。
- 企业级应用：建立可重复使用的平台，用于持续开展上皮屏障障碍中的靶点验证和机制研究。
运营与企业影响
- 科学价值：提高屏障功能障碍研究中预测的可信度，并减少机制上的模糊性。
- 操作价值：标准化并规模化源自患者的模型系统，以获得可重复的实验结果。
- 战略价值：为决策提供依据，支持推进或终止项目的判断，降低以上皮为靶点的研发项目在后期阶段的生物学风险。
- 项目组合影响：实现对以上皮屏障修复为靶向的治疗候选物进行基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备原代细胞分离和三维培养技术的专业知识。
- 需要获取用于跨上皮电阻（TEER）和转运通量检测的专用培养基、基质材料及分析仪器。
- 需要跨团队对实验方案进行标准化，以确保可重复性。
- 可能需要根据不同的患者群体或疾病亚型进行方案调整。
- 模型的保真度依赖于活检样本的质量和供体间的个体差异。
