Name: 评估接受生育力保留的年轻患者卵巢储备的 Z 评分 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-25T12:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: 了解如何通过组织学定量分析和Z评分计算来评估25岁以下患者的卵巢储备功能。该方法为生育力保留策略提供标准化的参考数据集，帮助识别卵巢储备降低的患者。

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我们感谢协助我们进行受试者招募和组织采集的医疗专业人员，以及所有捐赠卵巢组织的患者。同时感谢儿童癌症基金（PR2020-0096）和卡罗林斯卡学院博士生资助项目KID，本研究得益于这些基金的资助。我们还要感谢形态学表型分析平台在制备组织学切片过程中的支持。感谢Nicola Byers对本文稿的语言编辑工作。

所有实验程序均获得瑞典伦理审查局（Sveafertil 患者，Dnr: 2019-03802）和赫尔辛基大学医院伦理委员会（HCH 患者，Dnr 340/13/03/03/2015）的批准。研究护士向受试者提供书面和口头研究信息，并根据《赫尔辛基宣言》的要求获取知情同意。对于18岁以下的患者，由其法定监护人签署知情同意书。所有样本均进行假名化处理，并依照《欧盟通用数据保护条例》（GDPR）进行处理。本研究中所用试剂与设备的详细信息列于 材料表.
1. 卵巢组织的采集与处理
注意：当根据当地指南（例如北欧、欧洲或国际特定指南）判断患者存在高或极高不孕风险时，应识别所有符合生育力保存条件的患者。在欧洲，仅可将未成年患者纳入生育力保存研究项目进行招募。应依据本国生育力保存指南评估不孕风险。
<ol>
	<li>在全身麻醉下进行手术操作。麻醉诱导时给予静脉注射丙泊酚（2 mg/kg）、舒芬太尼（0.5 μg/kg）和罗库溴铵（0.6 mg/kg）。
	<ol>
		<li>插管并以潮气量 6–8 mL/kg 和 6–8 cm H₂O 的呼气末正压对患者进行通气2O. 输送1%至2%的七氟烷 通过 通过气管插管维持吸入麻醉。</li>
		<li>手术过程中使用罗库溴铵（0.15 mg/kg）维持神经肌肉阻滞，以提供充分的肌肉松弛，并允许在较低的腹腔内充气压力下进行腹腔镜检查。</li>
		<li>使用双频指数监测指导麻醉深度，以促进苏醒加快并减少麻醉药物剂量。使用舒更葡糖钠（2–4 mg/kg）拮抗残余肌松作用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用三通道技术，在脐部置入一个10 mm套管针进入腹腔，用于引入带摄像头的光学镜头；在左右髂区（分别位于两侧髂前上棘上方2 cm、内侧2 cm处）直视下置入两个5 mm套管针，用于手术器械操作及组织取出。直视下检查盆腔器官，包括双侧卵巢，确认其正常形态。
	<ol>
		<li>找到最容易接触的卵巢并予以抓持。切除约三分之一的卵巢组织（或根据伦理许可中规定的要求），必要时使用电凝止血。 
		注意：仅在无禁忌证的情况下进行活检，例如不存在术中或术后大出血风险或感染风险增加等情况。应明确说明并遵循所在国家的纳入与排除标准。如果不孕风险极高和/或仅切除部分卵巢的风险被认为过高（例如由于出血），可切除整个卵巢。在采集样本前应避免使用电灼术，因其可能损伤组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在手术室中，将组织置于含有5 mL含CaCl₂的1×Dulbecco磷酸盐缓冲液（PBS）的离心管中2，MgCl2，1 g/L D-葡萄糖，36 mg/L 丙酮酸，或预热至 37 °C 如果样本在实验室中立即处理（30分钟内）或保存于 4 °C 在较长的运输过程中（长达24小时）。 
	注意：器官运输溶液包括多种市售的器官运输/灌注溶液，以及简单的缓冲液，如 PBS 和 MEM34.</li>
	<li>从卵巢表面切取一小块卵巢组织（2 mm × 2 mm × 2 mm），该组织包含皮质部分，即卵巢的外层区域，卵巢卵泡位于此处。35. 
	警告：处理卵巢等人体组织时，应采用生物安全二级（Biosafety Level 2）的实践与操作规程。 
	注意：一个专业的生殖医学机构会将剩余的卵巢组织进行临床冷冻保存，以备将来用于患者的生育力恢复。</li>
	<li>将组织置于 350 µL 室温下用 Bouin 溶液固定 2 小时，或在 350 µL 4% 甲醛的 4 °C 过夜，确保组织完全浸没。孵育后，用70%乙醇洗涤组织三次。
	<ol>
		<li>对于Bouin液，冲洗至黄色消失。将组织包埋于石蜡中36至少连续切取30片厚度为 4 µm 并将它们置于玻璃载片上。 
		注意：处理Bouin's溶液和甲醛时，必须在化学通风橱内进行，并使用适当的个人防护装备。 
		注意：甲醛可能导致组织出现与收缩相关的假象，因此保存组织学结构时首选布因氏液。然而，布因氏液具有额外风险，导致一些机构更倾向于使用甲醛。37.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 苏木精和伊红（H&E）染色
<ol>
	<li>称取5 g伊红Y粉末至一个100 mL的灭菌玻璃瓶中。加入800 mL 95%乙醇和200 mL去离子水，配制成0.5%伊红储备液。取200 mL 0.5%伊红储备液，加入160 mL 100%乙醇、1 mL乙酸和40 mL去离子水，稀释得到0.25%伊红工作液。 
	注意：粉末可能无法完全溶解。使用前应过滤溶液以减少沉淀。</li>
	<li>将载玻片放入染色架中。按以下顺序将装有载玻片的染色架浸入相应容器：二甲苯中15 min，100%乙醇中5 min，70%乙醇中浸洗10次，50%乙醇中浸洗10次，最后在去离子水中浸洗10次。
	<ol>
		<li>将装有载玻片的染色架浸入苏木精溶液中染色3 min，然后转移至盛有蒸馏水的容器中清洗30 s，以去除多余的苏木精染料。</li>
		<li>将装有载玻片的染色架放入分化液（将1 mL 37% HCl加入100 mL 70%乙醇中配制）中1 min，随后转移至盛有蒸馏水的容器中清洗30 s。 
		注意：确保组织切片完全浸没于液体中。必要时可向容器中补充试剂。当大量染色时，每使用5次后更换二甲苯。通过稀释70%乙醇制备50%乙醇（例如，将35 mL 70%乙醇与15 mL DPBS混合，得到50 mL 50%乙醇）。 
		警告：操作二甲苯时应在通风橱内进行，并佩戴适当的个人防护装备。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将装有载玻片的染色架浸入Scott氏流水（又称蓝化液）中30–60 s，然后转移至盛有蒸馏水的容器中清洗30 s。再将染色架浸入伊红工作液中染色1 min。
	<ol>
		<li>依次将载玻片进行脱水处理：在100%乙醇中30 s，第二个100%乙醇容器中30 s，然后在二甲苯中浸洗两次。从二甲苯溶液中取出染色架后，将其置于玻璃容器中晾干，以防止二甲苯滴入通风橱内。</li>
		<li>在每张载玻片上滴加2滴封片剂，小心加盖盖玻片以避免产生气泡，并让封片剂自然干燥。 
		警告：操作二甲苯时应在通风橱内进行，并佩戴适当的个人防护装备。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如有可能，使用切片扫描仪对切片进行数字化。若无此条件，可在倒置显微镜下以20–40倍放大倍数直接计数卵泡。务必拍摄整个活检组织的图像，以便在图像分析软件中进行面积测量。</li>
</ol>
3. 卵泡计数
<ol>
	<li>如果载玻片已数字化，使用适当的软件打开文件（例如，开源软件） QuPath38若未进行数字化，可直接使用倒置显微镜及其配套软件进行分析。
	<ol>
		<li>将文件拖放到 QuPath 的主窗口中。设置图像类型为 明场 H&amp;E （参见 图1A）。使用比例尺定义表面上皮（覆盖表面的单层立方细胞）下方1 mm处。点击 椭圆 工具并标注卵泡（参见 图1B).</li>
		<li>在该1 mm区域内，计数从原始卵泡到初级卵泡阶段的卵泡数量。确定每个卵泡的发育阶段（原始卵泡——由一层扁平的颗粒细胞包围卵母细胞；过渡阶段——扁平和立方状颗粒细胞混合存在；初级卵泡——由一层完整的立方状颗粒细胞包围卵母细胞）。</li>
		<li>输入 样本编号，年龄，卵泡数量 每张载玻片 切片厚度，以及 nth 计入名为的表格中的部分 卵泡（mm）3 在卵泡Z评分计算器Excel文件中（参见 补充文件 1 和 图2A). 
		注意：由于卵泡的直径（最小的卵泡 &gt;35 µm），同一卵泡可能在连续切片中出现。当切片间距小于卵泡直径时，计数需格外谨慎。建议每隔10个切片计数一次卵泡th 切片（例如第10、20、30号切片）。在组织处理过程中，表面上皮可能脱落，因此在切片中可能仅部分存在。仅计数可见细胞质的卵泡。为质量控制，应由两人独立进行卵泡计数，并评估两者计数结果的一致性。通过计算同一标本中两位观察者卵泡计数之间的简单相关系数，评估观察者间的一致性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过目测法确定每个计数区域中最大的10%的卵泡。通过点击测量这些卵母细胞的平均直径 线 工具，通过卵母细胞膜绘制两条垂直线，并进行选择 测量，然后 显示注释测量结果 （参见 图1C).
	<ol>
		<li>在该列下记录测量值 长度 µm （参见 图1D）。将所有卵母细胞的平均直径输入到 平均卵母细胞直径（µm) Follicle Z-score 计算器 Excel 文件中每张幻灯片的字段（卵泡（mm）3, 见 补充文件 1 和 图2A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将图像置于 QuPath 界面屏幕中央，然后点击 ImageJ 图标。选择 将快照发送至 ImageJ （参见 图3A）。在 ImageJ 中，使用工具从边界处标记出 1 mm 距离 刷子 工具。单击 图像，然后 类型，然后选择 8位 （参见 图3B).
	<ol>
		<li>点击 线 工具，在屏幕左下方的比例尺上画一条线（参见 图3C）。点击 分析，然后 设定比例尺，输入比例尺标示的长度 在 已知距离场，然后点击 好的 （参见 图3C）。点击 图像，然后 调节亮度/对比度，然后选择 自动 （参见 图3D).</li>
		<li>点击 图像，然后 调整，阈值，然后选择 自动 （参见 图3E）。点击 棒状物 工具，选择 面积，然后按压 Ctrl + M （参见 图3F）。将面积值输入至卵泡Z评分计算器Excel文件（卵泡（mm）3, 见 补充文件 1 和 图2A).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 卵泡密度、皮质体积和Z评分的计算
<ol>
	<li>使用提供的卵泡Z评分计算器Excel文件，自动执行下述计算。结果将显示在Excel计算器的“Z评分（每立方毫米卵泡数）”工作表中（参见 补充文件 1），前提是将第3节中注明的详细信息录入“mm³中的卵泡”工作表中。</li>
	<li>为计算这些切片中的卵泡密度，使用 Schmidt 等人提出的修正公式。32首先，应用校正因子 α 以校正同一卵泡被重复计数的情况。修正后的公式如下： 
	<img alt="α计算公式，静力平衡方程，数学教育概念" src="/files/ftp_upload/66504/66504eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1"> 
	<img alt="递归序列的方程，用于说明数学 progression 及变量间的关系。" src="/files/ftp_upload/66504/66504eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 2"> 
	注意：在此公式中， t 是切片厚度， d 为卵母细胞的直径，且 q 是卵泡直径除以切片厚度的商。</li>
	<li>推算卵泡总数（n 卵泡) 用以下公式，根据切片中的卵泡计数计算皮质中的卵泡数33: 
	<img alt="含求和符号的卵泡计数公式、方程分析、教学用途" src="/files/ftp_upload/66504/66504eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 3"> 
	注意：此公式同时涵盖了所有未计算的部分。其中 γ 表示未计算的切片数量（例如，若每 10 个切片中有一个被计算，则 γ = 10）th 节段被计数），α 是在 4.1 中计算得到的校正因子， N 为计数的切片数量，且 n i 为计数切片中卵泡的总数。
	<ol>
		<li>外推整个皮层容积（V) 使用以下公式从计数区域计算33: 
		<img alt="用于计算方程中变量的数学公式，V = γ * Σ(Ai * ti)，其中 i 从 1 到 N。" src="/files/ftp_upload/66504/66504eq04.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 4"> 
		注意：此处， Ai 是该截面的面积，以及 ti 是组织厚度。请参阅步骤 4.2 以了解 γ 和 N.</li>
		<li>使用以下公式33 计算卵泡密度： 
		<img alt="毛囊密度公式，FD = n_follicles/V，用于研究分析。" src="/files/ftp_upload/66504/66504eq05.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 5"></li>
	</ol>
	</li>
	<li>确定是否存在减少的（&lt;-1.7 Z值）卵巢储备功能，通过使用以下公式计算Z值33: 
	<img alt="Z分数方程示意图，统计分析，展示z=(x-M)/SD计算公式" src="/files/ftp_upload/66504/66504eq06.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 6"> 
	注意：Z 值将在 Excel 计算器的“Z 值（每立方毫米卵泡数）”工作表中自动计算（参见 补充文件 1）依据第3节（卵泡计数）中提供的信息（图2B）。在此公式中， Z 表示 Z 分数， x 是计算得到的毛囊密度（毛囊数/cm）3) 研究样本的（步骤 4.4）， M 是相应年龄组的平均毛囊密度，以及 SD 为相应年龄组的标准差。Hassan 等人已建立0-25岁女性的参考值。33各年龄组卵泡密度的均值及标准差可参见卵泡Z评分计算器Excel文件（补充文件 1）并用于Z分数的计算。</li>
</ol>

Assessing Ovarian Reserve in Young Patients Using Z-Scores for Follicle Density

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</ol>

作者无利益冲突。

女性出生时具有有限的卵母细胞池，且无法再生。卵巢储备是决定女性生殖潜能的关键因素。本文介绍了一种通过组织学方法定量分析卵泡密度，并将其与参考标准进行比较的方法，即采用年轻患者及25岁以下女性卵巢皮质卵泡密度的Z评分进行评估。
在此方案中，从处于高或极高不孕风险且接受卵巢组织冷冻的女性和女孩中获取卵巢组织&#160;用于生育力保存，或来自接受性别重置手术的患者。通过一小块卵巢组织来评估冷冻保存的材料。由于卵巢储备随年龄变化，将卵泡密度转换为Z分数可实现与从出生至性成熟期间按年龄标准化的参考值进行比较（Hassan等）。33使用Z分数可提供一种年龄标准化且与队列无关的方法，用于评估卵巢储备样本的正常性。首先建立基于年龄的参考组均值，随后用于计算个体样本的Z分数。该方法使得对正常性的评估不受研究人群内年龄分布的影响。卵巢储备的年龄标准化评估，使得来自不同研究人群中具有相似遗传背景或化疗暴露史的患者数据得以整合，从而促进大规模的荟萃分析。
该方法存在局限性。来自无已知卵巢病变患者的卵巢组织中的卵泡计数数据有限。现有的参考标准基于少量样本建立，尤其是在考虑不同年龄组时，且仅适用于接受卵巢组织冷冻（OTC）的25岁以下女性。因此，该工具不适用于25岁以上的女性。此外，由于卵泡在皮质中分布不均，即使在育龄期女性中，较小的皮质组织碎片也可能不含任何卵泡32。此外，组织包埋过程中的方向可能会影响皮质正确识别。活检组织通常非常小，且活检采集方法尚未标准化，可能导致收到的卵巢组织主要为髓质成分，从而不适合进行Z评分评估。
此外，目前尚无研究证实卵巢活检可用于诊断残余生育能力40。需要特别注意的是，该方法仅考虑卵泡密度，而未评估卵泡的健康状况。使用甲醛固定的组织（已知可导致组织产生人工假象，如图5B所示）使得难以判断异常形态是源于卵泡闭锁还是固定过程本身。这一问题未来或许可通过无标记高分辨率成像技术（如定量相位显微镜41）或替代性固定剂37加以解决。此外，从活检取样到人工计数卵泡的整个流程具有侵入性，且耗时耗力，因此通过&#160;组织学方法评估卵泡密度在某些患者群体中并不实用。
此外，哪些卵泡注定会成熟以及化疗如何影响卵巢储备的大小和功能，目前仍不明确。在建立该方法与卵巢组织移植成功率之间的任何相关性之前，还需要在更大规模和更长时间范围内开展进一步的研究。
然而，该方法在卵巢生物学研究和临床生育力咨询中均具有重要意义。通过使用Z评分，可将个体的卵巢储备与参考标准进行比较，从而增强对卵巢储备的解读。这有助于在不同患者群体和研究人群中全面评估卵巢储备的大小及其正常性。例如，该方法可用于评价卵巢储备与各种暴露因素（如环境化学物质或性腺毒性治疗）之间的关联39。多家诊所通常在组织冷冻保存前准备过程中常规获取小块组织进行组织学评估。在此类情况下，该方法可用于判断冷冻保存前卵巢储备是否正常。总之，卵泡密度可用于在群体水平上估算卵巢储备的大小39，因此该方法是流行病学研究和生育力咨询中的一个重要工具。

卵巢是一个动态的、具有内分泌活性的器官，由外层皮质和内层髓质组成。卵巢内不均匀分布着卵泡，卵泡包含生殖细胞卵母细胞，其周围被基质颗粒细胞所包围1。所有卵泡在胎儿发育期间即已形成，在妊娠约20周时数量达到峰值，随后呈指数级下降。出生时，皮质中残留100万至200万个原始卵泡，仅有数十万个可存活至青春期2。这一非生长状态的卵泡库，也称为卵巢储备，是影响女性生育力的诸多因素之一。卵巢储备位于皮质内，随着卵泡的生长和成熟逐渐移向髓质。部分研究者认为卵巢储备仅由原始卵泡构成，而另一些研究者则认为其包括所有单层卵泡（即原始卵泡、过渡卵泡和初级卵泡）3,4,5,6。在女性一生中，仅有300至400个卵泡能够成熟并最终排卵。当卵泡数量下降至约一千个时，即进入绝经期，通常发生在50岁左右2,7。目前关于成年女性卵巢中是否存在卵原干细胞（OSCs）仍存在持续争议，这类细胞据称在异种移植后可形成卵母细胞。一些研究提示可分离出表达原始生殖细胞基因谱系并能分化为卵母细胞的细胞8,9，而另一些研究则表明所谓的OSCs实为血管周围的血管壁细胞10,11,12。
早发性卵巢功能不全（POI）是指在40岁之前出现月经周期停止并伴有促卵泡激素（FSH）水平升高的情况13. POI 的病因是多因素的，可能为特发性；然而，它通常继发于某些医学状况14例如，某些先天性遗传病由于出生时卵巢储备已降低，与原发性卵巢功能不全（POI）相关，如特纳综合征15. POI 也可能作为性腺毒性治疗的副作用出现，这在年幼患者中尤为严重，因为它可能导致无法正常发育青春期，并显著损害卵巢储备功能。根据 POI 的风险程度和患者的年龄，目前有多种生育力保存方案可供选择，例如成熟卵母细胞的冷冻保存、胚胎冷冻保存（在受精后） 体外 受精和卵巢组织冷冻保存（OTC）。对于青春期前患者，由于其性未成熟，OTC是唯一可行的选择16,17在美国，通过卵巢组织冷冻进行生育力保存最近已被视为一种可接受的临床常规。18然而，OTC 在许多欧洲国家仍被视为实验性技术，尤其在自体移植时需要获得伦理批准。19,20因此，非处方药方案的纳入标准必须仔细考虑，并应针对每位患者进行风险-获益分析。并非所有接受性腺毒性治疗的儿童都符合生育力保存的条件。在瑞典，根据北欧儿科血液学与肿瘤学学会的生育力保存指南，仅建议高风险或极高风险的患者进行生育力保存。21该群体包括：（1）需要进行干细胞移植或接受放疗且卵巢位于照射范围内的青春期前和青春期后儿童；（2）接受高累积剂量烷化剂化疗的青春期后儿童。对于月经初潮前的女孩，不孕风险极高的纳入标准包括接受过以下任一治疗者：辐射剂量 &#62;10 Gy 的卵巢照射，或异基因或自体造血干细胞治疗（HSCT）。排除标准包括术前因其他抗凝制剂需要额外输注血液制品的患者，或中性粒细胞计数异常者 &#60;1. 对于月经初潮后的女性，不孕风险高或极高的纳入标准包括接受过以下任一治疗者：辐射剂量 &#62;10 Gy 卵巢照射，或异基因 HSCT，环磷酰胺 &#62;9 g/m²，异环磷酰胺 &#62;60 g/m²、丙卡巴肼或亚硝基脲类化合物（BCNU/CCNU） &#62;360 mg/m²。排除标准包括经主管医师评估具有出血风险增加、感染风险增加、手术并发症风险增加或疼痛问题风险增加的患者。
对于卵巢组织冷冻保存（OTC），卵巢组织可在经腹手术（剖腹或腹腔镜）中通过单侧卵巢切除术或活检获取。从获取的卵巢组织中去除髓质后，将剩余的皮质部分切成较小的片段，通过程序化慢速冷冻或玻璃化冷冻技术进行冷冻保存，以备将来用于生育力恢复22。样本随后储存在液氮中，直至患者完成治疗并希望生育。根据癌症类型及是否存在卵巢组织移植的禁忌证，可将组织解冻后进行自体移植，以恢复内分泌功能和卵巢功能。OTC已被证实有效，在成年期采集并冷冻保存的卵巢组织移植后，妊娠率可达50%，已有超过200例活产报道23,24,25。而在儿童期采集的卵巢组织自体移植后报道的活产案例较少，且尚无在明确处于青春期前阶段的卵巢组织自体移植后成功活产的报道26,27,28,29,30。组织质量是成功恢复生育力的前提条件31。因此，研究所采集组织样本的质量至关重要。
目前，评估卵巢组织质量的一种方法是通过组织学切片和人工计数卵泡。然而，由于卵泡数量随年龄增长而自然下降，且卵泡在卵巢中呈异质性分布，因此判断卵泡密度是否正常较为困难。此外，与参考值进行比较也存在挑战，因为现有参考值尚未针对活检样本大小和年龄进行标准化。其他评估方法，如抗穆勒氏管激素（AMH）血清水平检测，或使用钙黄绿素或中性红对消化后的组织进行染色，要么尚未被充分确立，要么各自存在局限性。Wallace 和 Kelsey 之前通过收集无已知卵巢病理患者的完整卵巢卵泡数量数据，建立了卵巢储备功能随年龄变化的正常模型2。此外，由于活检样本并不能代表整个卵巢，Schmidt 等人开发了一种基于皮质活检估算卵泡总数的方法32。通过采用该方法的改进版本以及正常卵巢储备模型，已建立了一个适用于0-25岁女性的卵泡密度参考数据集33。
本文描述了基于小卵巢评估卵泡密度正常性的策略&#160;通过（1）组织学方法直接定量卵泡，以及（2）将结果与年龄标准化的参考值进行比较来分析样本 通过 Z分数。Z分数用于描述卵巢活检样本中卵泡密度与同年龄、同尺寸标准化参照组均值之间的关系。这一指标对于医生在生育力保存后为患者提供自体移植及其他后续治疗的咨询时具有重要价值。

<table><tbody><tr><td>1x 沃氏磷酸盐缓冲液</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>含 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;、MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;、1 g/L D-葡萄糖、36 mg/L 丙酮酸盐的 1x 磷酸盐缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>14287-080</td><td></td></tr><tr><td>37% 盐酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.09057.1000</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>Histolabs</td><td>01370.01L</td><td></td></tr><tr><td>95% 乙醇</td><td>Fisher scientific</td><td>10572143</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Histolabs</td><td>01399.01L</td><td></td></tr><tr><td>波因液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT10132-1L</td><td></td></tr><tr><td>伊红 Y 酸性品红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4009-5G&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Thermo Fisher</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>德拉菲尔德苏木精染液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03971-250ML</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>切片机&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pertex 封片液&amp;nbsp;</td><td>Histolabs</td><td>00840-05</td><td></td></tr><tr><td>丙泊酚</td><td>Baxter Holding B.V.</td><td>N01AX10</td><td>提供 ATC 编码代替货号</td></tr><tr><td>QuPath</td><td></td><td></td><td>https://qupath.github.io/</td></tr><tr><td>罗库溴铵&amp;nbsp;</td><td>B. Braun Melsungen AG&amp;nbsp;</td><td>M03AC09</td><td>提供 ATC 编码代替货号</td></tr><tr><td>Scott 人工自来水浓缩液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5134-6x100ml</td><td></td></tr><tr><td>七氟烷</td><td>Baxter Medical AB&amp;nbsp;</td><td>N01AB08</td><td>提供 ATC 编码代替货号</td></tr><tr><td>切片扫描仪&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>舒芬太尼</td><td>Hameln Pharma gmbh</td><td>N01AH03</td><td>提供 ATC 编码代替货号</td></tr><tr><td>舒更葡糖钠</td><td>Baxter Holding B.V.</td><td>V03AB35</td><td>提供 ATC 编码代替货号</td></tr><tr><td>SuperFrost plus 白片&amp;nbsp;</td><td>Histolabs</td><td>&amp;nbsp;06400&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus 白片载玻片</td><td>Histolabs</td><td>&amp;nbsp;06400&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Saveen Werner</td><td>131769.1611</td><td></td></tr></tbody></table>

评估年轻生育力保存患者卵巢储备功能的z评分

Z-Scores for Assessing Ovarian Reserve in Young Patients Undergoing Fertility Preservation

女性出生时具有一个不可再生的卵泡储备池，称为卵巢储备。该储备由卵巢中的原始卵泡组成，可能受到多种因素的影响，如遗传性和内分泌疾病、医疗干预措施以及内分泌干扰物。当必须进行具有生殖腺毒性的治疗时，建议实施生育力保存。对于女性而言，首选的生育力保存方法是卵母细胞和胚胎冷冻保存。然而，对于非常年幼且性未成熟的患者，卵巢组织冷冻保存是唯一可行的选择。了解冷冻保存的组织样本中卵泡密度，对于年轻患者的生育力咨询至关重要。本方案展示了使用Z评分评估25岁及以下接受生育力保存的女性和女孩卵巢组织质量的方法，即通过皮质卵泡密度的Z评分作为评估工具。患者样本中的卵泡密度将与Hassan等人建立的年龄标准化参考标准进行比较，以评估其与正常值的可能偏离程度。卵泡密度通过组织学定量测定。具体操作中，取一小块卵巢皮质组织（约2 mm × 2 mm × 2 mm），用Bouin液或甲醛溶液固定，经石蜡包埋后切成4 µm厚的切片，采用苏木精-伊红染色，并使用切片扫描仪进行数字化。皮质中存在的卵泡发育阶段从原始卵泡至初级卵泡不等。在组织学切片上，皮质区域定义为距表面上皮1 mm范围内的区域。卵泡密度采用Schmidt等人提出的修正公式进行计算，并结合参考均值和标准差确定Z评分。Z评分反映实测值相对于参考均值的偏离程度，用于判断卵巢储备是否降低（&#160;降低定义为Z评分&#60;-1.7）。通过该方法，卵泡密度可作为需要生育力保存的年轻患者卵巢储备状况的一项重要评估指标。

在成功完成切片、染色和载玻片扫描后，对卵巢卵泡进行定量分析。根据卵泡的不同发育阶段和健康状况进行区分并进一步分析。图4A展示了成年个体经Bouin液固定的卵巢的HE染色横截面，包含皮质和髓质组织的示例。图4B显示了儿童卵巢的代表性图像，并示出表面上皮的实例。卵巢储备（即非生长卵泡池）以及小型生长卵泡位于皮质中。通过使用虚拟显微镜对卵泡进行放大和分类，以确保仅纳入卵巢储备卵泡。图5展示了在Bouin液固定（图5A）和甲醛固定（图5B）的卵巢皮质组织中发现并计数的卵泡各发育阶段：（1）原始卵泡（直径约40 µm），（2）过渡期卵泡，以及（3）初级卵泡。图中编号为4–6的卵泡为应排除在计数之外的示例，因其无法准确判定其成熟阶段。图6展示了代表性卵巢皮质组织图像，其中卵泡缺失或数量极少（图6A），以及卵泡数量中等至丰富的卵巢组织（图6B）。图7展示了应排除的组织切片的代表性图像，原因包括仅含有髓质组织（图7A）或组织质量较差（图7B）。图2显示了卵泡Z评分计算器Excel文件的截图。输入数据后，系统将自动计算相应数值及其关联的Z评分。根据特纳综合征患者曲线下面积-受试者工作特征（AUC-ROC）曲线，Z评分&lt;1.7提示卵巢储备减少16。
<img alt="组织学图像分析流程、数字切片、软件界面、病理数据解读。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66504/66504fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：QuPath 软件使用界面截图。（A）显示在 QuPath 中打开图像文件并设置图像类型的过程。（B）使用软件内的椭圆工具对卵泡进行标注。（C,D）测量标注图像中卵母细胞的平均直径。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66504/66504fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于生物学研究的卵泡计数分析表，包含数据、计算结果和参考值" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66504/66504fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：卵泡Z评分计算器Excel文件的截图。 (A“每立方毫米卵泡数”工作表显示了用于输入样本编号、年龄和N的绿色单元格th 切片，最终卵泡计数，面积，平均卵母细胞直径，切片厚度，以及每隔N个切片计数。当所有必要数据输入后，卵泡密度（卵泡数/mm³）将自动计算；若任何数据不完整，则该字段保持空白。B“每立方毫米卵泡数Z分数”工作表关联了“每立方毫米卵泡数”工作表中的编号、年龄及卵泡数/mm³数据，并自动计算样本的Z分数。相应的参考值显示在右侧表格中。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66504/66504fig02largev2.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="组织学图像分割过程，软件界面步骤 A-F，分析组织结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66504/66504fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：ImageJ 软件使用的截图。（A）将图像从 QuPath 传输至 ImageJ。（B）在 ImageJ 中设置图像类型。（C）建立测量尺度。（D,E）自动调整图像的亮度/对比度及阈值。（F）测量经调整后图像中的区域面积。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66504/66504fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="组织学示意图；肾皮质、髓质组织切片；显微镜检查；肾脏结构分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66504/66504fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：卵巢组织的代表性图像。（A）一名接受性别重置手术的成年个体的卵巢图像。可见皮质区域，其体细胞密度较高，并包含卵巢储备；同时可见髓质组织，其特征为细胞密度较低、体细胞较大，且通常含有较多血管。（B）一名接受生育力保存手术的儿童的卵巢图像。皮质区域通过从表面上皮测量1 mm来确定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66504/66504fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="组织学比较：Bouin's 溶液与 4% 甲醛，显微镜图像，组织固定。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66504/66504fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图 5：使用不同溶液固定的卵巢卵泡代表性图像。（A）使用 Bouin's 溶液固定的卵泡，以及（B）使用 4% 甲醛固定的卵泡，处于不同发育阶段：（1）原始卵泡阶段，（2）中间阶段卵泡，（3）初级卵泡阶段。由于无法观察到明显的细胞质，卵泡（4）至（6）被排除。甲醛固定中常见的假象包括基底膜与组织分离（绿色箭头指示）以及核固缩的颗粒细胞（黄色圆点指示）。比例尺代表 50 µm。本图改编自 Björvang 等人39。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66504/66504fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="组织学切片对比；组织切片A和B示意图；显微镜图像；病理学分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66504/66504fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：儿童卵巢皮质活检的代表性图像。（A）显示卵泡数量极少至较低的活检样本；（B）显示卵泡数量中等至较高的活检样本。卵泡用星号（*）标记。蓝色虚线表示距表面上皮1 mm的位置，黑色实线标记表面上皮。比例尺为500 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66504/66504fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="组织学组织比较；显微镜图像；放大插图；组织结构分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66504/66504fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 7"> 
图 7：应排除的组织切片代表性图像。（A）一块取自髓质而非皮质的卵巢组织。由于缺乏表面上皮且细胞密度较低，该切片被判定为髓质组织。（B）质量较差的组织切片，表现为组织表面存在磨损。比例尺为 500 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66504/66504fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
补充文件1：卵泡Z分数计算器 该文件有助于计算卵泡Z分数。需要输入数据（样本编号、年龄、每张切片的卵泡数量、切片厚度、Nth 将切片计数及面积等数据输入“每立方毫米卵泡数”工作表后，Z值将自动计算，并汇总于“Z值（每立方毫米卵泡数）”工作表中。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66504/FollicleZ-score_Calculator%2020231110.zip" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>

本方案描述了一种用于评估25岁以下需要通过卵巢组织冷冻保存来实现生育力保存的患者卵巢储备功能的方法。该方法包括：（1）对皮质样本进行卵巢储备功能的组织学评估，（2）与参考数据集进行比较，以及（3）计算Z评分。

评估年轻生育力保存患者卵巢储备功能的Z评分

女性出生时具有一个不可再生的卵巢卵泡库，称为卵巢储备。该储备由位于卵巢皮质中的原始卵泡组成……

我们希望基于年龄不超过25岁、需要通过卵巢组织冷冻保存来实现生育力保存的患者的小块卵巢样本，评估其卵巢储备功能。通过使用一种改良公式来估算卵巢样本中的卵泡总数，并结合正常卵巢体积的模型，我们建立了0至25岁女性卵泡密度的参考数据集。由于以下两个原因，评估卵泡密度的正态分布较为困难：其一，卵巢储备随年龄增长而自然下降；其二，卵泡在卵巢内的分布具有异质性。与参考值进行比较也存在挑战，因为现有参考值尚未根据年龄和活检样本大小进行标准化，因此我们正致力于弥补这一差距。本方案描述了基于小型卵巢样本评估卵泡密度正常性的策略。我们通过组织学方法直接定量这些卵泡，并利用Z评分将结果与经年龄标准化的参考值进行比较。使用此工具，我们可以比较多项研究的数据，从而使荟萃分析成为可能。了解卵巢储备是否低下非常重要。我们致力于识别卵巢储备减少的患者，并为此提出一个截断值建议。这对于医生在为患者提供冻存卵巢组织自体移植咨询以及生育力保存后的进一步治疗方面具有重要价值。首先，在活检后从手术室收集卵巢组织，放入含有5 mL添加物的1X DPBS溶液的离心管中。使用无菌手术刀，从卵巢表面切取约2 mm³大小的小块卵巢组织。然后将组织浸入350 µL的Bouin溶液中，在室温下固定2小时。孵育结束后，用70%乙醇洗涤组织3次。组织经包埋和切片后，进行苏木精-伊红染色，并获取数字图像用于分析。使用适当的软件（如 QuPath）打开文件。将文件拖放到 QuPath 的主窗口中，并将图像类型设置为明场 H&E。利用比例尺，从表面上皮定义一毫米的距离。单击椭圆工具并标注卵泡。统计从原始卵泡到初级成熟阶段这一平方毫米区域内的卵泡数量。将样本编号、年龄、每张切片的卵泡数量、切片厚度以及计数的末尾切片编号输入至“卵泡Z评分计算器”Excel文件中名为“每立方毫米卵泡数”的工作表内。在每个计数区段中确定最大的10%卵泡后，点击线条工具，通过卵母细胞膜绘制两条相互垂直的直线。选择“测量”，然后点击“显示注释测量值”，以确定这些卵母细胞的平均直径。将测量结果记录在标注为“长度（微米）”的列下。在卵泡 Z 值计算器 Excel 文件中，输入每张切片最大 10% 卵泡的平均卵母细胞直径（单位为微米）。在 QuPath 中将图像置于屏幕中央，点击 ImageJ 图标，然后选择“发送快照至 ImageJ”。在 ImageJ 中，使用画笔工具从边缘标记一毫米，然后点击图像，选择并输入八位。接着点击线条工具，在比例尺上画一条线。选择分析，然后设置比例尺，在“已知距离”字段中输入比例尺上指示的长度，然后点击确定。然后点击“图像”，调整亮度对比度，并选择“自动”。接着点击“图像”，调整阈值并选择“自动”。点击单个工具，选择区域，然后按 Ctrl+M。将面积值输入至卵泡 Z 值计算器 Excel 文件中。当所有数据均已填入卵泡Z分数计算器的Excel文件后，请转至同一Excel文件中名为“Z-Score Follicle Per Millimeter Cube”的工作表，以判断卵巢储备是否降低。染色程序完成后，儿童卵巢的表面上皮清晰可见，其下的组织中即为卵巢储备所在区域。采用卵泡密度来计算卵巢储备的Z分数，当Z分数低于负1.7时，提示卵巢储备减少。

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科研

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Developmental Biology

发育生物学

评估接受生育力保留的年轻患者卵巢储备的 Z 评分

多个国际科学学会已将卵母细胞冷冻保存技术认定为青春期后女性生育力保存的金标准。恰当的临床与实验室策略可确保生育力保存治疗的最大有效性、效率和安全性。...

通过卵母细胞玻璃化冷冻实现生育力保存：临床与实验室视角

我们介绍了针对卵巢功能严重障碍患者进行无药物体外激活（IVA）卵巢卵泡的实验室操作步骤。该方法可增加每次卵巢超促排卵中可获取的卵母细胞数量，有助于此类患者的生育力保存。...

严重卵巢功能障碍患者的生育力保存

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小鼠卵巢储备发育过程中全卵巢免疫荧光、透明化及多光子显微镜定量三维分析

本方案概述了从体外受精（IVF）过程中分离和处理卵泡液、体细胞及未成熟卵母细胞的标准化方法，可用于高质量的分子与细胞分析。这些方法有助于利用临床治疗中通常被丢弃的材料，开展针对生育力、生殖衰老及卵巢功能障碍的转化医学研究。...

从接受辅助生殖技术治疗的个体中收集人卵泡液、卵泡体细胞及未成熟卵母细胞 体外 受精

本文描述了一种建立共培养体系的方案，该体系包含由诱导性多能干细胞（iPSCs）衍生的神经元、原代皮层神经元以及星形胶质细胞。该共培养系统可用于检测新生成的、由iPSCs衍生的神经元与已存在的表达光敏通道蛋白-2（channelrhodopsin-2）的皮层神经元之间突触连接和神经回路的形成。...

一种用于评估共培养系统中神经元连接形成的光遗传学方法

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斑马鱼肝细胞特异性消融以研究胆管驱动的肝脏再生

肠上皮干细胞（ISCs）与潘氏细胞相互混杂。这些潘氏细胞是ISC的分化后代，不仅支持ISC的存活，还提供抗菌保护。本文展示了我们如何利用转基因条件型小鼠模型，证实潘氏细胞在维持肠上皮稳态中发挥关键作用。...

使用条件性 Cre-lox 小鼠模型分析潘氏细胞在小鼠肠道再生中作用的实验方案

MicroSecure玻璃化冷冻技术是一种非商业化、无菌封闭式玻璃化冷冻装置系统，符合美国食品药品监督管理局（FDA）的优良生产规范和组织处理规范。由于行业内已停用疏水性带塞胚胎...

改良型MicroSecure玻璃化冷冻：一种安全、简便且高效的人类囊胚冷冻保存方法

本文介绍了一种高效利用年轻来源的人类间充质干细胞的心脏分化潜能以生成具有功能且能够收缩的心肌样细胞的方法。...

体外 人源间充质干细胞向功能性类心肌细胞的分化

了解如何通过组织学定量分析和Z评分计算来评估25岁以下患者的卵巢储备功能。该方法为生育力保留策略提供标准化的参考数据集，帮助识别卵巢储备降低的患者。

评估年轻生育力保存患者卵巢储备功能的Z评分

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