利用酶标仪通过钙流测定法表征蛋白酶激活受体调节剂

我们的实验室致力于研究蛋白酶激活受体的调节如何抑制炎症。我们开发了一类名为parmamodulin的小分子化合物，可调节Par 1的活性。目标是发现具有更优特性的parmamodulin，以期作为潜在的候选药物，并进一步阐明其作用机制。

在与合作者开展的临床前研究中，我们发现帕马多林类药物可能对治疗由血栓性炎症驱动的疾病（包括肾脏、肝脏和心血管疾病）具有良好的应用前景。其作用机制还可能有助于开发出相较于以往靶向 Par 1 的候选药物具有更优安全性的化合物。受体 Par 1 在血小板活化过程中发挥重要作用，但其在内皮细胞中的信号传导同样具有重要意义，并与多种病理过程密切相关。

因此，我们希望开发一种廉价且便捷的方案，用于检测帕马多林类物质对培养内皮细胞的活性。本文将分享一种经过改进的钙离子流测定方案，该方案使用常规的酶标仪，无需自动液体处理设备。该方法适用于在内皮细胞中筛选 Par 1 配体，理论上也可用于检测任何影响钙离子流的化合物的活性。

首先，将所需的实验材料放置在工作平台上。向黑色壁透明底的96孔板的孔中加入100微升无菌的0.4%明胶溶液。将该板在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育30分钟。

在倒置显微镜下确认 T75 培养瓶中的内皮细胞融合度为 80% 至 100%。通过抽吸去除培养瓶中的完全 DMEM 培养基。为洗涤细胞，加入 10 毫升 PBS，并轻轻摇动培养瓶。

用五毫升细胞解离液替换 PBS。将培养瓶置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育约 12 分钟。六分钟后轻敲培养瓶，以促进细胞解离。

向培养瓶中加入 5 毫升预热的 DMEM 完全培养基，混匀细胞悬液。使用 10 毫升血清移液管将细胞悬液转移至无菌的 50 毫升离心管中，在 150 ×g 条件下离心 5 分钟。同时，使用连接真空泵的巴斯德移液管，从 96 孔板中吸除明胶溶液。

离心细胞后，从离心管中移除上清液，注意不要扰动沉淀。使用血清移液管向管中加入 8 mL 新鲜的 DMEM 完全培养基，并轻轻吹打悬液以分散细胞沉淀。用台盼蓝染色法在血细胞计数板上对细胞进行计数。

加入完全 DMEM 培养基，调整细胞密度至每毫升悬浮液含 600,000 个细胞。通过轻轻翻转离心管混匀细胞悬液。将细胞悬液加入 50 毫升多通道移液器储液槽中。

每隔 30 秒，轻轻左右摇动储液槽以混匀悬液，并使用多通道移液器向已包被明胶的 96 孔板的每个孔中加入 100 µL。盖上透明板盖，通过在无菌操作台表面由北向南、由东向西滑动平板的方式轻轻振荡混匀。将平板置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 16 至 24 小时。

在96孔板中培养内皮细胞后，将其从培养箱中取出，使用倒置显微镜确认细胞融合度。轻弹培养板至水槽中以去除完全培养基，并用纸巾轻压板面吸除残留液体。将HBSS Heaps Assay Buffer Plus Pro Benefit Solution加入50毫升多通道移液器溶剂储液槽中。

使用多通道移液器，向每个孔中加入 100 µL 检测缓冲液，静置细胞 5 分钟。然后轻弹培养板以去除检测缓冲液。将洗脱缓冲液加入另一个 50 mL 多通道移液器溶剂储液槽中。

使用多通道移液器，向检测板的每个孔中加入 50 µL 染料负载缓冲液。将检测板置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 45 分钟。孵育结束后，在荧光显微镜下观察检测板，以确认染料的摄取情况。

轻弹培养板以去除染料溶液。用50 µL HBSS Heaps Assay Buffer Plus Pro Benefit溶液在每孔中洗涤细胞两次。轻弹培养板以去除检测缓冲液。

向每个孔中加入92微升HBSS Heaps分析缓冲液，再次使用荧光显微镜观察细胞，以确保过量染料已完全去除，且细胞仍保持贴壁状态。使用多通道移液器，向相应的孔中加入2微升拮抗剂溶液和溶剂对照。开启酶标仪后，将温度设置为37摄氏度，并将培养板孵育15分钟。

在第一列和第二列中测量背景荧光，每孔进行五次扫描。将酶标仪中的板取出。然后从8联管PCR条中，使用多通道移液器快速向第一列和第二列的每孔加入6 µL激动剂溶液。

在细胞内钙离子动员发生时，检测荧光强度的变化。对每个孔进行20次扫描。内皮细胞的钙离子动员实验表明，未添加拮抗剂的阳性对照孔显示出荧光强度迅速增加。

高浓度拮抗剂孔中的荧光变化极小，与未加激动剂的阴性对照孔相似。