利用黑色素瘤患者来源类器官模型揭示治疗新机遇

我们开发并验证了源自黑色素瘤患者的类器官。该模型旨在精确模拟肿瘤微环境，研究免疫细胞相互作用，并评估治疗反应，特别是对免疫疗法的反应。我们的目标是推进对肿瘤生物学的理解，改进药物研发策略，并有望实现个体化的癌症治疗。

准确模拟复杂的肿瘤微环境，包括间质细胞与免疫细胞之间的相互作用，仍然具有挑战性。确保类器官保留原始肿瘤的遗传和表型多样性也十分困难。建立稳定且可扩展的类器官培养方案，并确保在不同样本间研究结果的可重复性，至关重要。

肿瘤患者对治疗的反应往往存在差异，因此需要采用不同的治疗策略。能够培养源自患者肿瘤的类器官，使我们得以进行药物筛选，从而为每位患者制定个性化的治疗方案。首先，配制包被溶液，其中包含生长因子减少型基底膜基质和类器官培养基，按1:2的比例混合。向48孔板的每个孔中加入115微升包被溶液，并将该板置于37摄氏度、湿润的培养箱中孵育30分钟。

对于胶原蛋白法，将一毫升胶原蛋白凝胶加入内径为30毫米的膜插件中，并在37摄氏度的湿化培养箱中静置30分钟使其凝固。为获取细胞混合物，将新切除的黑色素瘤组织置于含有洗涤液并置于冰上的10毫升培养皿中进行清洗。使用无菌镊子将肿瘤转移至另一含有洗涤液并置于冰上的培养皿中进行下一步清洗。

在三次洗涤过程中，使用无菌剪刀和刀片去除多余的结缔组织、脂肪和残留血液。将肿瘤组织置于一个空的培养皿中，用无菌刀片将其充分切碎。然后将切碎的组织转移至含有10毫升预配消化液的50毫升锥形管中。

将锥形瓶置于37摄氏度的水浴中，每5分钟涡旋振荡一次。25分钟后，加入30毫升含10%胎牛血清（FBS）的ADMEM/F12培养基以终止消化。接着，将消化后的细胞悬液通过70微米尼龙细胞筛网过滤，并用添加了补剂的ADMEM/F12培养基冲洗筛网。

使用移液器吸取滤膜底部残留的全部培养基。随后在4°C条件下以300 G离心7分钟，使细胞沉淀。弃去上清液后，将沉淀重悬于类器官培养基中。

进行培养时，将200,000个细胞接种至预热的、包被Matrigel的培养板孔中，并加入200 µL类器官培养基。或者，将100万个细胞与1 mL胶原凝胶混合，接种于六孔板中预先固化的胶原凝胶膜插入物上，然后向孔中加入类器官培养基。对于直径为150至200 µm的类器官传代，将其转移至15 mL锥形管中，并用Dulbecco's PBS洗涤。

在4°C条件下，以300 G离心混合物7分钟。去除上清液后，用胰蛋白酶替代物孵育类器官，并每隔3分钟混匀一次。为终止消化，加入含10% FBS的低血清ADMEM/F12培养基。

将混合物在300 G条件下离心7分钟，并将沉淀重悬于类器官培养基中。最后，将单细胞悬液以相同的初始接种密度接种至新的基质胶或胶原蛋白包被的孔板中进行培养。第2天和第7天嵌入基质胶中的类器官显微图像显示，类器官的尺寸逐渐增大。

此外，在亲本肿瘤与在Matrigel或胶原蛋白中培养的相应类器官之间，α-β T细胞比例均无统计学上的显著差异。