Name: 揭示黑色素瘤患者来源的类器官模型的治疗机会 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T12:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 33 s
Description: 了解黑色素瘤患者来源类器官模型的构建方法，用于研究肿瘤微环境与免疫治疗反应。该技术可精准模拟患者肿瘤特征，助力个性化癌症治疗策略的开发与应用。

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本研究部分由以下基金资助：R01(CA258113)、SPORE (CA261608) 和 P01 (CA114046)。图1 使用 BioRender.com 制作。

人黑色素瘤组织来自宾夕法尼亚大学接受治疗的患者，采集过程遵循宾夕法尼亚大学机构审查委员会批准的组织采集方案（UPCC08607）。所有患者均已签署知情同意书。在切除人黑色素瘤组织后，肿瘤组织被置于杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，并在4 °C保存直至处理（6小时内）。黑色素瘤患者来源类器官（MPDOs）由新鲜肿瘤组织制备，如图1所示。
1. 从人黑色素瘤组织中分离细胞
<ol>
	<li>实验开始前的准备工作 
	注意：可采用两种培养方法（Matrigel 和胶原凝胶）来培养解离的黑色素瘤组织：
	<ol>
		<li>Matrigel 方法：通过将生长因子减少型（GFR）基底膜基质与类器官培养基（见表 1）按 1:2 比例稀释，制备包被溶液。将约 115 µL 解冻后的溶液加入 48 孔板的多个孔中，并在 37 °C 湿润培养箱中孵育 30 分钟使其凝固。</li>
		<li>胶原凝胶方法：将 1 mL 胶原凝胶（见表 1）加入内径为 30 mm 的膜插件中。在 37 °C 湿润培养箱中孵育 30 分钟，使凝胶凝固。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备 L-WRN 条件培养基15。L-WRN 条件培养基由经基因工程改造的 L-WRN 细胞系分泌产生，该细胞系可分泌 Wnt3a、R-spondin 3 和 Noggin 至单一条件培养基中，广泛用于细胞培养。
	<ol>
		<li>在 37 °C 水浴中解冻一支 L-WRN 细胞冻存管。将 5 mL L 细胞培养基（见表 1）和 L-WRN 细胞悬液加入 15 mL 圆底离心管中，在 4 °C 下以 120 × g 离心 5 分钟。吸除上清液，确保底部保留约 500 µL 以重悬细胞沉淀。</li>
		<li>将含上清液的细胞沉淀转移至冰上的 30 mL L 细胞培养基中，加入 150 µL 潮霉素（500 µg/mL）和 300 µL G418（500 µg/mL）。以 3 × 106 的密度将细胞接种于 T-150 培养瓶中，并在含 5% CO2 的湿润培养箱中 37 °C 培养至约 90% 汇合度。</li>
		<li>当细胞达到约 90% 汇合度时，用 20 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，吸除液体后用 3 mL 胰蛋白酶替代物消化，然后将细胞分传至五个 T-150 培养瓶中。5 分钟后，加入 9 mL L 细胞培养基中和，随后在 4 °C 下以 120 × g 离心 5 分钟。当细胞达到约 100% 汇合度时，将五个 T-150 培养瓶中的细胞分传至 10 个三层 T-175 培养瓶中。</li>
		<li>细胞汇合后，先用 2 × 50 mL PBS 洗涤，再用 25 mL 洗涤液（见表 1）洗涤。</li>
		<li>向每个三层 T-175 培养瓶中加入 75 mL 初代培养基，并在含 5% CO2 的湿润培养箱中 37 °C 培养 3 天（见表 1）。</li>
		<li>3 天后，将条件培养基收集至 50 mL 圆底离心管中，在 4 °C 下以 1,100 × g 离心 5 分钟。收集上清液（即条件培养基），确保底部保留 5 mL。</li>
		<li>向每个三层 T-175 培养瓶中加入新鲜的 75 mL 初代细胞培养基，继续培养 3 天以收集更多条件培养基。</li>
		<li>向收集的条件培养基中加入等体积的初代细胞培养基（即 50% 体积），使用 0.22 µm 滤器进行真空过滤。将滤液分装至 50 mL 管中，长期保存可置于 -20 °C，短期保存可置于 4 °C（最多 2–3 周）。使用该培养基补充类器官培养基（见表 1）。 
		注意：使用前需在 4 °C 过夜解冻分装样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从新鲜黑色素瘤组织中收获细胞混合物
	<ol>
		<li>在含有洗涤液的 10 mL 培养皿中清洗新切除的黑色素瘤组织。第一次冲洗后，使用无菌镊子将肿瘤转移至第二个培养皿中进行进一步清洗，并在冰上重复此过程 3 次，以保持肿瘤完整性和活性。在整个冲洗过程中，使用无菌剪刀和刀片去除多余的结缔组织、脂肪和残留血液。三次清洗后，将肿瘤置于空培养皿中，使用无菌刀片将其充分切碎。 
		注意：切碎后，肿瘤应呈现凝胶状质地。肿瘤切得越细，细胞得率越高，因为较大的肿瘤团块更难消化，且可能无法通过后续步骤中的 70 µm 尼龙细胞筛。</li>
		<li>待肿瘤组织充分清洗并切碎后，将其转移至含有 10 mL 预制消化液的 50 mL 圆底离心管中（见表 1）。将离心管置于 37 °C 水浴中，并确保每 5 分钟涡旋混匀一次。</li>
		<li>25 分钟后，加入 30 mL 含 10% FBS 的 ADMEM/F12 培养基以终止消化。 
		注意：上述指定体积适用于重量不超过 0.2 g 的肿瘤。</li>
		<li>将消化后的细胞悬液通过 70 µm 尼龙细胞筛过滤，然后用含 10% FBS 的 ADMEM/F12 (1x) 低血清培养基（1:1）冲洗滤器。洗涤后，使用移液器吸取滤器底部残留的培养基，以确保回收尽可能多的细胞。随后在 4 °C 下以 300 × g 离心 7 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于类器官培养基中（见表 1）。</li>
		<li>将黑色素瘤单细胞悬液接种于 Matrigel 或胶原凝胶培养系统中：
		<ol>
			<li>Matrigel：计数单细胞悬液，确保在预温的 Matrigel 包被孔中接种约 2 × 105 个细胞，并补充 200 µL 类器官培养基。 
			注意：基于 Matrigel 的类器官用于研究病理生理学、筛选药物疗效及检测药物毒性16。</li>
			<li>胶原凝胶：计数单细胞悬液，确保约 106 个细胞与 1 mL 胶原凝胶混合。将混合物加入已预凝固的胶原凝胶膜插件中，并将其置于 6 孔板中。加入足够的类器官培养基以完全浸没含有细胞和胶原凝胶的插件。 
			注意：胶原凝胶类器官用于测量 T 细胞迁移及研究组织发育16。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>培养类器官，并确保每 3 天更换一次新鲜培养基。</li>
		<li>当类器官生长至 150–200 µm 大小时进行传代，或将其冻存以备后续使用。
		<ol>
			<li>传代时，将类器官转移至 15 mL 圆底离心管中，用 1× DPSB 洗涤。在 4 °C 下以 300 × g 离心 7 分钟。弃去上清液，加入胰蛋白酶替代物（每个类器官 50–100 µL），在 37 °C 水浴中消化 10 分钟，期间每 3 分钟涡旋混匀一次。</li>
			<li>使用含 10% FBS 的 ADMEM/F12 (1x) 低血清培养基（1:1）终止消化。将混合物在 4 °C 下以 300 × g 离心 7 分钟，然后重悬于类器官培养基中。</li>
			<li>将单细胞悬液以相同的初始接种密度接种至新的 Matrigel/胶原包被孔中（在 48 孔板中，Matrigel 包被孔每孔 200 µL 类器官培养基含 2 × 105 个细胞；胶原包被的 30 mm 内膜插件每孔 1 mL 类器官培养基含 106 个细胞）。</li>
			<li>冻存时，使用胰蛋白酶替代物将 MPDOs 消化为单细胞悬液，随后将 106 个细胞重悬于 1 mL 冻存液中（见表 1）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Patient-Derived Melanoma Organoids: A Frontier in Cancer Immunotherapy

<ol><li>Mirabelli, P., Coppola, L., Salvatore, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Cell+Lines+Are+Useful+Model+Systems+for+Medical+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Cancer Cell Lines Are Useful Model Systems for Medical Research.</a> Cancers (Basel). 11 (8), 1098(2019).</li>
<li>Shannon, A. E., Boos, C. E., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culturing+multicellular+tumor+models%3A+Modeling+the+tumor+microenvironment+and+analysis+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Co-culturing multicellular tumor models: Modeling the tumor microenvironment and analysis techniques.</a> Proteomics. 21 (9), e2000103(2021).</li>
<li>Jubelin, C., Muñoz-Garcia, J., Griscom, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+culture+models+in+oncology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biosci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro culture models in oncology research.</a> Cell Biosci. 12, 155(2022).</li>
<li>Jin, J., Yoshimura, K., Sewastjanow-Silva, M., Song, S., Ajani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+prospects+of+patient-derived+xenografts+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Challenges and prospects of patient-derived xenografts for cancer research.</a> Cancers (Basel). 15 (17), 4352(2023).</li>
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<li>Somasundaram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-infiltrating+mast+cells+are+associated+with+resistance+to+anti-PD-1+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Tumor-infiltrating mast cells are associated with resistance to anti-PD-1 therapy.</a> Nat Commun. 12 (1), 346(2021).</li>
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<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%3A+The+current+status+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Comm%22%5BJournal%5D)">Organoids: The current status and biomedical applications.</a> Med Comm. 4 (3), e274(2023).</li>
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<li>Ou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+melanoma+organoid+models+facilitate+the+assessment+of+immunotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22eBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Patient-derived melanoma organoid models facilitate the assessment of immunotherapies.</a> eBioMedicine. 92, 104614(2023).</li>
<li>Grönholm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+for+precision+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids for precision cancer immunotherapy.</a> Cancer Res. 81 (12), 3149-3155 (2021).</li>
<li>Ou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+platforms+to+study+therapeutic+efficacy+of+human+%CE%B3%CE%B4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Preclinical platforms to study therapeutic efficacy of human γδ T cells.</a> Clin Transl Med. 12 (6), e814(2022).</li>
<li>Murine L-Wrn conditioned medium protocol. The University of Texas MD Anderson Cancer Center. , Available from: 
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<li>Jee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+collagen-based+3D+matrix+for+gastrointestinal+tract-derived+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Development of collagen-based 3D matrix for gastrointestinal tract-derived organoid culture.</a> Stem Cells Int. 13 (2019), 8472712(2019).</li>
<li>Pipkin, M. E., Rao, A., Lichtenheld, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+control+of+the+perforin+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">The transcriptional control of the perforin locus.</a> Immunol Rev. 235 (1), 55(2010).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tim-3+suppresses+the+killing+effect+of+V%CE%B39V%CE%B42+cells+on+colon+cancer+cells+by+reducing+perforin+and+granzyme+B+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Tim-3 suppresses the killing effect of Vγ9Vδ2 cells on colon cancer cells by reducing perforin and granzyme B expression.</a> Exp Cell Res. 386 (1), 111719(2020).</li>
<li>Li, L. T., Jiang, G., Chen, Q., Zheng, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki67+is+a+promising+molecular+target+in+the+diagnosis+of+cancer+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med+Rep%22%5BJournal%5D)">Ki67 is a promising molecular target in the diagnosis of cancer (Review).</a> Mol Med Rep. 11 (3), 1566-1572 (2015).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Li, H. Y., Ren, K., Wang, C., Bu, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+organoid+research+progress+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Dermatology+and+Venereology%22%5BJournal%5D)">Skin organoid research progress and potential applications.</a> International Journal of Dermatology and Venereology. 5 (2), 101-106 (2022).</li>
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<li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li>
<li>Ganesh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rectal+cancer+organoid+platform+to+study+individual+responses+to+chemoradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation.</a> Nat Med. 25 (10), 1607-1614 (2019).</li>
<li>Vilgelm, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-needle+aspiration-based+patient-derived+cancer+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Fine-needle aspiration-based patient-derived cancer organoids.</a> iScience. 23 (8), 101408(2020).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

PDO的出现解决了以往 established 癌症研究方法存在的多种局限性，同时为该领域带来了变革性的应用前景。该类类器官技术最初由Hans Clevers及其同事于2009年提出，他们通过培养Lgr5+肠道干细胞，成功建立了肠道类器官培养体系。+ 从小鼠肠道中分离的干细胞，在含有R-spondin、EGF和Noggin因子的三维基质凝胶中培养20几年后，即2020年，Koehler 团队报道了一种类器官培养模型，该模型能够生成皮肤 体外 首次仅使用人类多能干细胞（PSCs）21鉴于类器官技术的这些显著进展，肿瘤类器官模型的开发迅速兴起，有望彻底改变癌症研究和药物开发。
因此，本实验方案重点阐述从新近切除的人黑色素瘤组织中获取类器官的步骤，以推动对癌症生物学的理解并改进药物研发策略。为此，多个实验室已开展研究，以验证患者来源类器官（PDO）与其亲本肿瘤的相似性。值得注意的是，Sun 及其同事采用类似的 PDO 技术建立了黏膜黑色素瘤（MM）模型，最终证实所获得的类器官保留了原始肿瘤的组织病理学特征，包括染色体不稳定性以及黑色素瘤和黑色素体标志物的表达。22随着类器官生物学特性的稳定保持，许多研究团队也探索了类器官（PDO）在预测不同药物及新型治疗策略临床反应方面的适用性。例如，Vlachogiannis 团队证明，在转移性胃肠道肿瘤中，类器官能够准确预测药物反应，其结果与患者的临床疗效相符23同样，Ganesh 团队也建立了直肠癌患者来源类器官的活体生物样本库，并得出结论： 离体 化疗和放疗的反应与每位患者的个体临床反应相关24这些研究共同表明，患者来源的类器官（PDOs）可作为探索肿瘤演化的可靠模型，在增进我们对癌症治疗反应理解方面具有广阔前景。
PDO在研究中展现出显著潜力；然而，挑战在于通过手术切除或粗针穿刺活检获取组织具有侵入性，可能给患者带来负担。随后必须对组织进行机械或酶解离，这可能会破坏原有的三维生长结构。为解决这一局限性，细针穿刺抽吸（FNA）作为一种临床首选的微创操作应运而生，它能够精细地从硬化间质中提取并分离肿瘤细胞，无需消化或额外处理25。该方法可保留肿瘤原有的生长结构。Vilgelm及其同事在研究类器官是否能够保持亲本肿瘤生物学特性的同时，探索了FNA作为类器官分离方法的效率。他们的研究结果表明，通过FNA-PDO分离的肿瘤组织保留了与原始肿瘤相似的关键组织学和免疫表型特征，提示该方法在类器官分离中具有潜在的有效性25。
PDO 技术代表了一项突破性进展，具有多种潜在应用。复制患者特异性肿瘤环境的能力为许多关键研究方向开辟了道路。从药物筛选、耐药机制发现，到肿瘤异质性的细微特征研究、癌症监测策略探索，以及免疫检查点抑制剂与细胞治疗和靶向治疗的联合应用，该技术的潜力远超其直接应用范围。

传统的二维细胞培养模型是癌症研究中用于研究癌症进展和治疗的重要工具1。这些模型不仅能够在受控的实验条件下研究癌症发生和发展的分子与细胞机制，还能提供成本较低且相对快速的实验结果。然而，由于单层培养模型无法重现肿瘤微环境（TME）中有限的细胞多样性，其应用受到限制2。此外，与人体实际环境相比，细胞培养模型所提供的环境过于简化3。因此，为了更深入地理解癌症的进展并开发有效的治疗方法，研究人员已转向创新的模型，旨在更真实地模拟肿瘤微环境的特性。相应地，在这些模型中保持与原始肿瘤的高度保真性至关重要。鉴于癌症的复杂性，任何与原始肿瘤的显著偏差都可能引入不可预见的变量，从而干扰对肿瘤行为的有意义结论。
尽管患者来源的异种移植瘤（PDX）已作为一种可监测肿瘤进展的模型系统出现 体内，某些局限性引发了人们对所构建的肿瘤在多大程度上能够模拟人类癌症生物学特征的质疑4例如，黑色素瘤的肿瘤微环境（TME）包含肿瘤浸润性免疫细胞和基质细胞。当以异种移植方式传代时，来自患者的非癌细胞将逐渐丢失，这可能导致所筛选出的适应性特征与患者原发肿瘤中的实际情况不同。尽管通过限制PDX的传代次数可在一定程度上缓解这些局限性 体内，不同物种之间的差异仍可能导致PDX发生偏离原发肿瘤的遗传改变5此外，PDX 模型通常建立在免疫缺陷小鼠中，以防止人源组织被排斥。这限制了对宿主免疫系统在癌症中作用的研究，尤其是在免疫治疗研究中。6我们及其他研究者已将PDX移植至“人源化”小鼠体内7,8然而，在人源化小鼠中建立PDX模型耗时较长且成本高昂。从患者的肿瘤样本中构建一个PDX模型可能需要数月到数年时间，从而限制了研究的速度和规模。尽管存在这些局限性，PDX模型已被证实能够准确模拟肿瘤微环境（TME）的生物学特性，因此被广泛应用于癌症治疗药物开发、个体化医疗以及免疫治疗等领域。9. 
近年来出现了一种替代性的三维培养技术，即患者来源类器官（patient-derived organoid, PDO），该技术通过培养新鲜切除的患者肿瘤组织，构建出能够维持表型异质性、组织结构特征以及细胞间相互作用的模型10。已有研究证实，这种模型能够高度模拟原始肿瘤的特性，例如，由非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）和肌层浸润性膀胱癌（MIBC）患者来源的类器官在培养后成功再现了亲本肿瘤的关键特征11。由于PDO相较于其他模型具有显著优势和广阔潜力，因此可实现多种其他模型无法完成的定制化应用，包括但不限于免疫检查点抑制剂、细胞治疗及靶向治疗的研究与开发。例如，我们先前曾利用黑色素瘤患者来源类器官（MPDOs）研究肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）在IL-2和抗PD-1抗体（αPD-1）作用下的扩增能力。结果显示，经IL-2和αPD-1扩增的TILs不仅数量更多，而且能够更有效地浸润MPDOs并杀伤黑色素瘤细胞，其效率高于其他方法扩增的TILs12。其他研究团队也报道了类似结果，即使用抗PD-1和/或抗PD-L1抗体可使TILs在PDO中保持功能活性，进而引发肿瘤细胞杀伤效应13。此外，我们团队还利用MPDOs评估了γδ T细胞的浸润能力及其杀伤功能14。PDO的应用范围广泛，涵盖TIL扩增、细胞毒性研究以及小分子药物筛选等多个领域。上述各项应用均凸显了该模型所具备的巨大潜力与实用性。因此，本文详细描述了MPDOs的培养方案。

<table><tbody><tr><td>2 mL 红盖内螺纹聚丙烯冻存管</td><td>Corning</td><td>431420</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 聚丙烯锥形离心管</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 细胞培养处理培养皿</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>105 mm 聚苯乙烯无菌镊子</td><td>Caplugs Evergreen&amp;nbsp;</td><td>222-1121-B1I</td><td></td></tr><tr><td>150 cm&lt;sup&gt;2 &lt;/sup&gt;细胞培养瓶</td><td>Corning</td><td>CLS430825</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>高级 DMEM/F12 (1x) 低血清培养基 (1:1)</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>B-27 添加剂 (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 抗人穿孔素抗体</td><td>BioLegend</td><td>308120</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 抗人 Ki-67 抗体</td><td>BioLegend</td><td>350522</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 650 抗人 CD366 (Tim-3) 抗体</td><td>BioLegend</td><td>345028</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 711 抗人 CD45 抗体</td><td>BioLegend</td><td>304050</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养插件 0.4 &amp;micro;m，直径 30 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>PIHP03050</td><td></td></tr><tr><td>细胞染色缓冲液</td><td>BioLegend</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛 40 &amp;micro;m 尼龙</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛 70 &amp;micro;m 尼龙</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 IV 型，粉末</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 大鼠 I 型胶原蛋白</td><td>Trevigen</td><td>3440-100-01</td><td></td></tr><tr><td>培养板，聚苯乙烯，48 孔，带盖，细胞培养处理，无菌</td><td>Max Scientific&amp;nbsp;</td><td>07-6048</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜 (DMSO) Hybri-Max</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM - 高糖 4.5 mg/mL</td><td>Corning</td><td>MT10-0130CV</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶 I - II 级</td><td>Millipore Sigma</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 1%&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，FBS</td><td>Corning</td><td>MT35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>FITC Annexin V 凋亡检测试剂盒 I</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>556547</td><td></td></tr><tr><td>福斯科林</td><td>Tocris</td><td>1099</td><td></td></tr><tr><td>遗传霉素选择性抗生素 (G418 硫酸盐) (50 mg/mL)</td><td>ThermoFisher</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 添加剂</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F12 营养混合物</td><td>ThermoFisher</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>潮霉素 B (50 mg/mL)</td><td>ThermoFisher</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>L-WRN 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 无酚 &amp; 生长因子减量</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Millex PVDF 注射器滤器，0.22 &amp;mu;m</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLGVR33RB</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>Nunc TripleFlask 处理细胞培养瓶</td><td>ThermoFisher</td><td>132867</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cyanine5 抗人 CD8a 抗体</td><td>BioLegend</td><td>301010</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy 7 小鼠抗人 CD279 (PD-1)</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>561272</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>重组人 EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15-1MG</td><td></td></tr><tr><td>重组人酸性 FGF</td><td>Peprotech</td><td>100-17A</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠溶液 (NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;) (7.5%)</td><td>Quality Biological&amp;nbsp;</td><td>118-085-721</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢外科刀片 No. 22</td><td>Integra</td><td>4-322</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td></td></tr></tbody></table>

利用黑色素瘤患者来源类器官模型揭示治疗新机遇

Unveiling Therapeutic Opportunities with Melanoma Patient-derived Organoid Models

随着免疫疗法的发展，人们迫切需要开发能够模拟原发肿瘤微环境的模型。传统的二维和三维模型虽然能够为癌症的发生和发展提供一定见解，但缺乏一些关键要素，难以真实再现原发肿瘤的特征。近年来备受关注的一种替代模型是患者来源类器官。这类类器官的建立能够重现肿瘤复杂的细胞间通讯、肿瘤微环境以及组织结构。本文描述了建立黑色素瘤患者来源类器官（MPDO）模型的实验方案。为验证这些模型的有效性，我们评估了类器官中的免疫细胞组成，包括T细胞活化标志物的表达水平，以确认类器官的细胞异质性。此外，为了探讨MPDO在细胞治疗中的潜在应用价值，我们检测了γδ T细胞对类器官的细胞毒性作用。综上所述，MPDO模型为理解肿瘤复杂性、验证治疗策略以及推动个体化治疗的发展提供了有前景的研究途径。

通过监测 MPDO 的形态和大小随时间的变化，以研究其生长动态。如图2所示，在初始生长期，类器官的尺寸在所示的7天内显著增大。在观察了 MPDO 的生长动态后，研究重点转向评估免疫细胞组成，以验证类器官对原始肿瘤的忠实再现。该评估主要聚焦于 αβ T 细胞的丰度，从而揭示类器官与亲本肿瘤之间的相似性。如图所示，图3表明，在亲本肿瘤与分别在 Matrigel 或胶原蛋白中培养的相应类器官之间，αβ T 细胞比例无统计学显著差异。在证实了亲本肿瘤与类器官之间的相似性后，接下来我们通过流式细胞术评估 T 细胞活性。设门策略见于图4，该策略通过定义单细胞、活的白细胞，随后对 CD3+ 和 CD8+ T 细胞群体设门，以检测常见的 T 细胞活化标志物。
鉴于细胞毒性T细胞在产生细胞因子以及释放颗粒酶B和穿孔素等细胞毒性分子中的作用，对其表达水平进行了检测。颗粒酶B和穿孔素的表达率分别为35.1%和2.17%17。在1.83%的CD8+ T细胞中检测到T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域3（Tim3）的表达，这与免疫抑制性肿瘤微环境（TME）的特征一致18。在MPDOs中，49.5%的CD8+ T细胞群体表达程序性死亡受体（PD-1），进一步强调了类器官微环境的免疫抑制特性。最后，还评估了CD8+ T细胞中增殖标志物Kiel 67（Ki67）的表达，其表达率为26.8%19
MPDO还可用于评估γδ T细胞的杀伤能力。将多个培养10天的MPDO与γδ T细胞共孵育。孵育24小时后，收集MPDO并解离成单细胞悬液，重悬于含有5 µL AV-FITC和5 µL PI的100 µL结合缓冲液中。室温避光孵育15分钟后，进行流式细胞术分析，以确定γδ T细胞对MPDO中细胞的细胞毒性作用。如图5 A,B所示，经γδ T细胞处理后，MPDO中更多细胞表现出凋亡特征（80.5%），而对照实验中仅少数细胞表现出凋亡特征（19.2%）。
<img alt="黑色素瘤类器官培养过程；示意图；组织剪碎、解离、细胞悬液、接种。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66509/66509fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：MPDOs培养的示意图。 切除的新鲜黑色素瘤组织通过机械和酶解方法分解，获得单细胞悬液。将该细胞悬液接种于包被有Matrigel或胶原凝胶的培养板孔中，以形成类器官。缩写：MPDO = 黑色素瘤患者来源类器官。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66509/66509fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞生长进程，第2天与第7天对比，显微镜图像显示细胞形态变化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66509/66509fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：黑色素瘤患者来源类器官（MPDO）在Matrigel中培养第2天和第7天的共聚焦显微镜图像。 来自新鲜黑色素瘤组织的单细胞悬液在Matrigel中培养。图像分别于第2天和第7天使用共聚焦显微镜拍摄。类器官的尺寸逐渐增大。比例尺 = 100 µm。缩写：MPDO = melanoma patient-derived organoid。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66509/66509fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="CD45+ T细胞百分比图表；比较肿瘤、胶原蛋白和Matrigel；ns表示无显著性差异。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66509/66509fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：流式细胞术分析比较亲代肿瘤与在胶原凝胶或Matrigel中培养的类器官中αβ T细胞的组成。采用FACS对MPDOs中的免疫细胞进行定量分析。比较亲代肿瘤、在胶原凝胶或Matrigel中培养7天后的MPDOs中的αβ T细胞。n = 8；ns = 无显著性差异（非参数多重检验）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66509/66509fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术示意图，显示细胞群设门：淋巴细胞、CD3+、CD8+ 分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66509/66509fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图 4：用于表征在 Matrigel 中培养的第 10 天 MPDO 中免疫细胞的流式细胞术设门策略与分析。 免疫细胞亚群的设门策略，随后对类器官内表达的各种标志物进行定量与表型分析。缩写：MPDO = 黑色素瘤患者来源类器官；FSC-A = 前向散射-峰值高度；FSC-H = 前向散射-峰值高度；SSC-A = 侧向散射-峰值面积。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66509/66509fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术和细胞毒性图；γδ T细胞处理增加Annexin V、PI水平；细胞凋亡。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66509/66509fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：γδ T细胞处理在黑色素瘤患者来源类器官（MPDO）中诱导细胞杀伤作用。将MPDO与γδ T细胞共培养24小时后，收集MPDO并解离为单细胞悬液。（A）γδ T细胞处理后，在Matrigel中培养的类器官的Annexin V和PI染色结果。处理后出现向坏死的转变，结果明显。（B）γδ T细胞处理后MPDO中凋亡细胞的定量分析。n = 5；*p &lt; 0.05；**p &lt; 0.01（非参数多重检验）。缩写：MPDO = melanoma patient-derived organoid（黑色素瘤患者来源类器官）；PI = propidium iodide（碘化丙啶）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66509/66509fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：本实验方案中使用的所有培养基和试剂的组成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66509/66509_Table%201%20(2).xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

在此，我们介绍一种通过培养新鲜黑色素瘤组织解离后的细胞悬液来生成黑色素瘤患者来源类器官的实验方案。这些类器官能够真实地再现患者特异性的肿瘤特征 体外 为研究肿瘤免疫抑制机制、药物筛选、耐药机制及癌症监测方法提供了创新途径。

随着免疫治疗的发展，人们迫切需要开发能够重现原发肿瘤微环境的模型。虽然……

我们开发并验证了源自黑色素瘤患者的类器官。该模型旨在精确模拟肿瘤微环境，研究免疫细胞相互作用，并评估治疗反应，特别是对免疫疗法的反应。我们的目标是推进对肿瘤生物学的理解，改进药物研发策略，并有望实现个体化的癌症治疗。准确模拟复杂的肿瘤微环境，包括间质细胞与免疫细胞之间的相互作用，仍然具有挑战性。确保类器官保留原始肿瘤的遗传和表型多样性也十分困难。建立稳定且可扩展的类器官培养方案，并确保在不同样本间研究结果的可重复性，至关重要。肿瘤患者对治疗的反应往往存在差异，因此需要采用不同的治疗策略。能够培养源自患者肿瘤的类器官，使我们得以进行药物筛选，从而为每位患者制定个性化的治疗方案。首先，配制包被溶液，其中包含生长因子减少型基底膜基质和类器官培养基，按1:2的比例混合。向48孔板的每个孔中加入115微升包被溶液，并将该板置于37摄氏度、湿润的培养箱中孵育30分钟。对于胶原蛋白法，将一毫升胶原蛋白凝胶加入内径为30毫米的膜插件中，并在37摄氏度的湿化培养箱中静置30分钟使其凝固。为获取细胞混合物，将新切除的黑色素瘤组织置于含有洗涤液并置于冰上的10毫升培养皿中进行清洗。使用无菌镊子将肿瘤转移至另一含有洗涤液并置于冰上的培养皿中进行下一步清洗。在三次洗涤过程中，使用无菌剪刀和刀片去除多余的结缔组织、脂肪和残留血液。将肿瘤组织置于一个空的培养皿中，用无菌刀片将其充分切碎。然后将切碎的组织转移至含有10毫升预配消化液的50毫升锥形管中。将锥形瓶置于37摄氏度的水浴中，每5分钟涡旋振荡一次。25分钟后，加入30毫升含10%胎牛血清（FBS）的ADMEM/F12培养基以终止消化。接着，将消化后的细胞悬液通过70微米尼龙细胞筛网过滤，并用添加了补剂的ADMEM/F12培养基冲洗筛网。使用移液器吸取滤膜底部残留的全部培养基。随后在4°C条件下以300 G离心7分钟，使细胞沉淀。弃去上清液后，将沉淀重悬于类器官培养基中。进行培养时，将200,000个细胞接种至预热的、包被Matrigel的培养板孔中，并加入200 µL类器官培养基。或者，将100万个细胞与1 mL胶原凝胶混合，接种于六孔板中预先固化的胶原凝胶膜插入物上，然后向孔中加入类器官培养基。对于直径为150至200 µm的类器官传代，将其转移至15 mL锥形管中，并用Dulbecco's PBS洗涤。在4°C条件下，以300 G离心混合物7分钟。去除上清液后，用胰蛋白酶替代物孵育类器官，并每隔3分钟混匀一次。为终止消化，加入含10% FBS的低血清ADMEM/F12培养基。将混合物在300 G条件下离心7分钟，并将沉淀重悬于类器官培养基中。最后，将单细胞悬液以相同的初始接种密度接种至新的基质胶或胶原蛋白包被的孔板中进行培养。第2天和第7天嵌入基质胶中的类器官显微图像显示，类器官的尺寸逐渐增大。此外，在亲本肿瘤与在Matrigel或胶原蛋白中培养的相应类器官之间，α-β T细胞比例均无统计学上的显著差异。

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