基于Escherichia coli的互补实验用于研究热休克蛋白70的分子伴侣功能

我通过比较热休克蛋白在抵抗导致人类感染（如疟疾和结核病）的抗原中的作用，来探讨其功能。我的研究主要聚焦于这些致病原中热休克蛋白机器的结构与功能特征。热休克蛋白通常具有高度保守性，但它们在一定程度上也表现出功能特化。

此外，它们还与药物耐药性有关。因此，目前正在进行多项研究，旨在靶向这些机制以逆转多种疾病模型中的药物耐药性。这些研究包括生物化学、生物物理、生物信息学和细胞生物学技术。

换句话说，需要运用多种技术手段来研究这些蛋白质的功能。在我们的研究中，疟疾主要病原蛋白难以表达和生产，这限制了对这些蛋白的深入研究。例如，很难获得足够数量的蛋白用于结晶和成像分析。

我们已在疟疾患者中确定了这些蛋白质的部分生物功能指标。我们还建立了针对疟疾和热带病（TD）病原体中靶向这些蛋白质的化合物的检测方法。本方案用于探究以等位基因作为模型的 HSP70 的分子伴侣或蛋白质折叠功能及其细胞内保护作用。该方案也可用于筛选靶向 HSP70 的小分子抑制剂。

首先，标记两支毫升级微量离心管。用移液器将50 µL的E. coli DnaK 756培养物分装至各管中。将离心管置于冰上。

向含有大肠杆菌分装液的每个独立离心管中加入10至50纳克质粒DNA。将离心管置于冰上保持30分钟。随后，将细胞置于42摄氏度环境中60秒，以进行热激处理。

将950 µL新鲜的2倍酵母胰蛋白胨肉汤加入各离心管中。随后将离心管置于37 °C摇床中孵育。用移液器吸取100 µL转化后的细胞培养液，均匀涂布于含有抗生素的2倍酵母胰蛋白胨琼脂平板上。

将剩余的细胞在 4 °C 条件下以 5,000 ×g 离心 1 分钟。弃去约 800 微升的培养基。用剩余的培养基重新悬浮沉淀的细胞。

将回收的细胞接种到两倍浓度的酵母胰蛋白胨琼脂平板上。然后将两个琼脂平板在37°C条件下过夜培养。接种细胞时，使用无菌接种环从转化子中挑取单个菌落。

将其接种至10毫升含抗生素的两倍浓度酵母胰蛋白胨培养基中。现在用2毫升微量离心管制备细胞从10⁰到10⁻⁵的系列稀释液。在点样细胞前，将含抗生素和IPTG的琼脂平板置于40摄氏度烘箱中，平板盖部分打开。

当平板充分干燥后，将连续稀释的细胞各取 2 µL 点样到琼脂平板上。每份样品分别点样至两个独立的平板。将其中一个平板置于 37 °C 的允许生长温度下培养，另一个平板则置于 43.5 °C 的非允许生长温度下培养。

为确认重组蛋白的表达，使用无菌接种环从同一转化子菌落的剩余细胞中取部分菌体，接种至含有抗生素的10毫升酵母胰蛋白胨液体培养基中，在37摄氏度下振荡培养过夜。

所有大肠杆菌 DnaK 756 细胞在允许生长温度 37 摄氏度下均能生长。然而，在非允许生长温度下，只有表达 DnaK 和 KPf 的异源细胞能够生长。表达 KPfV 436F 的突变细胞仅在 37 摄氏度下生长，但在 43.5 摄氏度下无法生长。

首先，将80 µL转化后的大肠杆菌细胞移入一个离心管中。向管中加入20 µL的4倍浓度SDS上样缓冲液。将悬液在加热块中于100 °C煮沸10分钟。

然后将10 µL样品加入预制的SDS凝胶中。在室温下，用SDS电泳缓冲液以120伏电压电泳1小时。电泳完成后，将凝胶置于考马斯亮蓝染色液中染色1小时。

将凝胶置于脱色液中脱色两小时，脱色液含50%甲醇和10%乙酸的蒸馏水溶液。将凝胶放入凝胶成像系统以观察蛋白质条带。随后，将SDS凝胶中的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。

用洗涤缓冲液将硝酸纤维素膜洗涤三次。将膜转移至含有抗体的5%脱脂牛奶中，抗体稀释比例为1:2,000。在4°C、60 RPM振荡条件下孵育膜1小时。

接下来，用 TBS Tween 缓冲液清洗硝酸纤维素膜，每次 15 分钟，共洗三次，以去除非特异性结合的抗体。然后将膜转移至含有二抗的培养皿中，在 4°C、60 RPM 振荡条件下孵育一小时。

洗涤膜后，与之前相同，使用增强型化学发光检测试剂显影条带。使用凝胶成像系统观察条带。