Name: 测量 HIV-1 感染的 T 细胞中的内质网应激和未折叠蛋白反应并分析其在 HIV-1 复制中的作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 了解HIV-1感染T细胞中内质网应激与未折叠蛋白反应的检测方法，探索UPR激活阈值对病毒复制的影响机制。该方案为研究宿主-病原体相互作用提供重要基础。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢印度政府生物技术部国家细胞科学中心提供的机构内支持。AT 和 AD 感谢印度政府生物技术部国家细胞科学中心提供的博士研究生研究支持。DM 感谢印度政府科学与工程研究委员会（SERB）授予的 JC Bose 国家奖学金。

Studying ER Stress and UPR Activation During HIV-1 Infection in T-Cells

<ol><li>Levy, J. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLevy%2C+JA+%22HIV+and+the+Pathogenesis+of+AIDS.+3rd%22">HIV and the Pathogenesis of AIDS. 3rd</a>. , ASM Press. (2007).</li>
<li>Hebert, D. N., Molinari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+and+out+of+the+ER%3A+Protein+folding%2C+quality+control%2C+degradation%2C+and+related+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">In and out of the ER: Protein folding, quality control, degradation, and related human diseases.</a> Physiol Rev. 87 (4), 1377-1408 (2007).</li>
<li>Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unfolded+protein+response%3A+The+dawn+of+a+new+field%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Jpn+Acad+Ser+B+Phys+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The unfolded protein response: The dawn of a new field.</a> Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 91 (9), 469-480 (2015).</li>
<li>Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adapting+proteostasis+for+disease+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adapting proteostasis for disease intervention.</a> Science. 319 (5865), 916-919 (2008).</li>
<li>Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrating+the+unfolded+protein+response+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Orchestrating the unfolded protein response in health and disease.</a> J Clin Invest. 110 (10), 1389-1398 (2002).</li>
<li>Ron, D., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+integration+in+the+endoplasmic+reticulum+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 519-529 (2007).</li>
<li>Marciniak, S. J., Garcia-Bonilla, L., Hu, J., Harding, H. P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation-dependent+substrate+recruitment+by+the+eukaryotic+translation+initiation+factor+2+kinase+PERK%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation-dependent substrate recruitment by the eukaryotic translation initiation factor 2 kinase PERK.</a> J Cell Biol. 172 (2), 201-209 (2006).</li>
<li>Harding, H. P., Zhang, Y., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+translation+and+folding+are+coupled+by+an+endoplasmic-reticulum-resident+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein translation and folding are coupled by an endoplasmic-reticulum-resident kinase.</a> Nature. 397 (6716), 271-274 (1999).</li>
<li>Vattem, K. M., Wek, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reinitiation+involving+upstream+ORFs+regulates+ATF4+mRNA+translation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reinitiation involving upstream ORFs regulates ATF4 mRNA translation in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (31), 11269-11274 (2004).</li>
<li>Harding, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+stress+response+regulates+amino+acid+metabolism+and+resistance+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress.</a> Mol Cell. 11 (3), 619-633 (2003).</li>
<li>Novoa, I., Zeng, H., Harding, H. P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+inhibition+of+the+unfolded+protein+response+by+GADD34-mediated+dephosphorylation+of+eIF2%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Feedback inhibition of the unfolded protein response by GADD34-mediated dephosphorylation of eIF2α.</a> J Cell Biol. 153 (5), 1011-1021 (2001).</li>
<li>Haze, K., Yoshida, H., Yanagi, H., Yura, T., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+transcription+factor+ATF6+is+synthesized+as+a+transmembrane+protein+and+activated+by+proteolysis+in+response+to+endoplasmic+reticulum+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mammalian transcription factor ATF6 is synthesized as a transmembrane protein and activated by proteolysis in response to endoplasmic reticulum stress.</a> Mol Biol Cell. 10 (11), 3787-3799 (1999).</li>
<li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+stress+induces+cleavage+of+membrane-bound+ATF6+by+the+same+proteases+that+process+SREBPs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">ER stress induces cleavage of membrane-bound ATF6 by the same proteases that process SREBPs.</a> Mol Cell. 6 (6), 1355-1364 (2000).</li>
<li>Tirasophon, W., Welihinda, A. A., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stress+response+pathway+from+the+endoplasmic+reticulum+to+the+nucleus+requires+a+novel+bifunctional+protein+kinase%2Fendoribonuclease+%28Ire1p%29+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A stress response pathway from the endoplasmic reticulum to the nucleus requires a novel bifunctional protein kinase/endoribonuclease (Ire1p) in mammalian cells.</a> Genes Dev. 12 (12), 1812-1824 (1998).</li>
<li>Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XBP1+mRNA+is+induced+by+ATF6+and+spliced+by+IRE1+in+response+to+ER+stress+to+produce+a+highly+active+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor.</a> Cell. 107 (7), 881-891 (2001).</li>
<li>Calfon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRE1+couples+endoplasmic+reticulum+load+to+secretory+capacity+by+processing+the+XBP-1+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA.</a> Nature. 415 (6867), 92-96 (2002).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF6%CE%B1+optimizes+long-term+endoplasmic+reticulum+function+to+protect+cells+from+chronic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">ATF6α optimizes long-term endoplasmic reticulum function to protect cells from chronic stress.</a> Dev Cell. 13 (3), 351-364 (2007).</li>
<li>Shoulders, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-independent+activation+of+XBP1s+and%2For+ATF6+reveals+three+functionally+diverse+ER+proteostasis+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Stress-independent activation of XBP1s and/or ATF6 reveals three functionally diverse ER proteostasis environments.</a> Cell Rep. 3 (4), 1279-1292 (2013).</li>
<li>Oslowski, C. M., Urano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+ER+stress+and+the+unfolded+protein+response+using+mammalian+tissue+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Measuring ER stress and the unfolded protein response using mammalian tissue culture system.</a> Methods Enzymol. 490, 71-92 (2011).</li>
<li>Gupta, S., Samali, A., Fitzgerald, U., Deegan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+monitoring+endoplasmic+reticulum+stress+and+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for monitoring endoplasmic reticulum stress and the unfolded protein response.</a> Int J Cell Biol. 2010, 830307(2010).</li>
<li>Wang, M., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding+in+the+endoplasmic+reticulum+as+a+conduit+to+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding in the endoplasmic reticulum as a conduit to human disease.</a> Nature. 529 (7586), 326-335 (2016).</li>
<li>Beriault, D. R., Werstuck, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+endoplasmic+reticulum+stress+in+living+cells+using+the+fluorescent+compound%2C+Thioflavin+T%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of endoplasmic reticulum stress in living cells using the fluorescent compound, Thioflavin T.</a> Biochim Biophys Acta. 1833 (10), 2293-2301 (2013).</li>
<li>Tripathi, A., Iyer, K., Mitra, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+replication+requires+optimal+activation+of+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">HIV-1 replication requires optimal activation of the unfolded protein response.</a> FEBS Lett. 597 (23), 2908-2930 (2023).</li>
<li>Platt, E. J., Wehrly, K., Kuhmann, S. E., Chesebro, B., Kabat, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+CCR5+and+CD4+cell+surface+concentrations+on+infections+by+macrophagetropic+isolates+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Effects of CCR5 and CD4 cell surface concentrations on infections by macrophagetropic isolates of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 72 (4), 2855(1998).</li>
<li>Gervaix, A., West, D., Leoni, L. M., Richman, D. D., Wong-Staal, F., Corbeil, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+reporter+cell+line+to+monitor+HIV+infection+and+drug+susceptibility+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A new reporter cell line to monitor HIV infection and drug susceptibility in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4653-4658 (1997).</li>
<li>Augustine, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+F%2FFBXO1+interacts+with+HIV-1+viral+infectivity+factor+%28Vif%29+and+restricts+progeny+virion+infectivity+by+ubiquitination+and+proteasomal+degradation+of+vif+protein+through+SCFcyclin+F+E3+ligase+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cyclin F/FBXO1 interacts with HIV-1 viral infectivity factor (Vif) and restricts progeny virion infectivity by ubiquitination and proteasomal degradation of vif protein through SCFcyclin F E3 ligase machinery.</a> J Biol Chem. 292 (13), 5349-5363 (2017).</li>
<li>Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+quantitating+confocal+fluorescent+images%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">A simple method for quantitating confocal fluorescent images.</a> Biochem Biophys Rep. 25, 100916(2021).</li>
<li>Treiman, M., Caspersen, C., Christensen, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tool+coming+of+age%3A+Thapsigargin+as+an+inhibitor+of+sarco-endoplasmic+reticulum+Ca2%2B-ATPases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">A tool coming of age: Thapsigargin as an inhibitor of sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPases.</a> Trends Pharmacol Sci. 19 (4), 131-135 (1998).</li>
<li>Moffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lentiviral+RNAi+library+for+human+and+mouse+genes+applied+to+an+arrayed+viral+high-content+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen.</a> Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).</li>
<li>Sodroski, J., Rosen, C., Goh, W. C., Haseltine, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transcriptional+activator+protein+encoded+by+the+x-lor+region+of+the+human+T-cell+leukemia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Transcriptional activator protein encoded by the x-lor region of the human T-cell leukemia virus.</a> Science. 228 (4706), 1430-1434 (1985).</li>
<li>Rosen, C. A., Sodroski, J. G., Kettman, R., Haseltine, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+enhancer+sequences+in+type+II+human+T-cell+leukemia+virus+and+bovine+leukemia+virus+long+terminal+repeats+by+virus-associated+trans-acting+regulatory+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Activation of enhancer sequences in type II human T-cell leukemia virus and bovine leukemia virus long terminal repeats by virus-associated trans-acting regulatory factors.</a> J Virol. 57 (3), 738-744 (1986).</li>
<li>Dandekar, D. H., Kumar, M., Ladha, J. S., Ganesh, K. N., Mitra, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+method+for+normalization+of+transfection+efficiency+using+enhanced+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A quantitative method for normalization of transfection efficiency using enhanced green fluorescent protein.</a> Anal Biochem. 342 (2), 341-344 (2005).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+Technique%2C+theory%2C+and+trouble+shooting%5BTitle%5D)+AND+%22N+Am+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Western blot: Technique, theory, and trouble shooting.</a> N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).</li>
<li>Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+necessity+of+and+strategies+for+improving+confidence+in+the+accuracy+of+western+blots%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots.</a> Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).</li>
<li>Peña, J., Harris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+virus+modulates+the+unfolded+protein+response+in+a+time-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dengue virus modulates the unfolded protein response in a time-dependent manner.</a> J Biol Chem. 286 (16), 14226-14236 (2011).</li>
<li>Soboleski, M. R., Oaks, J., Halford, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+is+a+quantitative+reporter+of+gene+expression+in+individual+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein is a quantitative reporter of gene expression in individual eukaryotic cells.</a> FASEB J. 19 (3), 440-442 (2005).</li>
<li>Martinez, Z. S., Castro, E., Seong, C. S., Cerón, M. R., Echegoyen, L., Llano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fullerene+derivatives+strongly+inhibit+HIV-1+replication+by+affecting+virus+maturation+without+impairing+protease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Fullerene derivatives strongly inhibit HIV-1 replication by affecting virus maturation without impairing protease activity.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 5731-5741 (2016).</li>
<li>Askari, S., Javadpour, P., Rashidi, F. S., Dargahi, L., Kashfi, K., Ghasemi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+and+molecular+effects+of+Thapsigargin-induced+brain+ER-+stress%3A+Encompassing+inflammation%2C+MAPK%2C+and+insulin+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Life%22%5BJournal%5D)">Behavioral and molecular effects of Thapsigargin-induced brain ER- stress: Encompassing inflammation, MAPK, and insulin signaling pathway.</a> Life. 12 (9), 1374(2022).</li>
<li>Jaskulska, A., Janecka, A. E., Gach-Janczak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thapsigargin-from+traditional+medicine+to+anticancer+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Thapsigargin-from traditional medicine to anticancer drug.</a> Int J Mol Sci. 22 (1), 4(2021).</li>
<li>Shaban, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-level+inhibition+of+coronavirus+replication+by+chemical+ER+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Multi-level inhibition of coronavirus replication by chemical ER stress.</a> Nat Commun. 12 (1), 5536(2021).</li>
<li>Marciniak, S. J., Chambers, J. E., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+targeting+of+endoplasmic+reticulum+stress+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Pharmacological targeting of endoplasmic reticulum stress in disease.</a> Nat Rev Drug Discov. 21 (2), 115-140 (2022).</li>
<li>Sriburi, R., Jackowski, S., Mori, K., Brewer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XBP1%3A+A+link+between+the+unfolded+protein+response%2C+lipid+biosynthesis%2C+and+biogenesis+of+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">XBP1: A link between the unfolded protein response, lipid biosynthesis, and biogenesis of the endoplasmic reticulum.</a> J Cell Biol. 167 (1), 35-41 (2004).</li>
<li>Siwecka, N., Rozpędek-Kamińska, W., Wawrzynkiewicz, A., Pytel, D., Diehl, J. A., Majsterek, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure%2C+activation+and+signaling+of+IRE1+and+its+role+in+determining+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">The structure, activation and signaling of IRE1 and its role in determining cell fate.</a> Biomedicines. 9 (2), 156(2021).</li>
</ol>

作者声明无任何利益冲突。

本实验方案的范围包括：（i）HIV-1 病毒储备液的处理，以及病毒浓度和病毒颗粒感染性的测定；（ii）利用 HIV-1 感染 T 细胞，并评估其对内质网应激及未折叠蛋白反应（UPR）不同标志物的影响；（iii）敲低 UPR 标志物后，分析其对 HIV-1 LTR 驱动的基因活性、病毒产生及病毒颗粒感染性的影响；（iv）使用药理学分子过度激活 UPR，并分析其对 HIV-1 复制的影响。通过本套实验方案，可获得关于 HIV-1 与 UPR 相互作用的全面信息。本研究中列出的实验方案操作简便、成本低廉且高度可靠。
由于未折叠蛋白反应（UPR）是一种对压力敏感的信号通路，相关实验操作较为精细。所有实验均建议避免使用长期传代的细胞，以确保结果的一致性。在所有细胞培养操作中，维持无菌条件至关重要，以防止细菌和酵母污染，因为这些污染可能干扰实验及其结果。此外，在实验过程中处理细胞及其后续培养时，应避免剧烈或长时间的温度变化，并确保起始细胞状态健康且未受应激。否则，这些变化可能给细胞带来额外压力，从而影响实验结果。由于UPR是一种敏感的信号通路，应尽可能固定实验时间点，因为时间点的微小差异也可能导致结果变化。
ThT 染色法可检测蛋白质聚集体，用于评估内质网（ER）应激水平22，能够非常清晰地显示 HIV-1 感染细胞中的 ER 应激程度。ThT 染色基于对蛋白质聚集体的检测，而蛋白质聚集体与 ER 应激相关。然而需要注意的是，未折叠蛋白反应（UPR）的激活并不总是与蛋白质聚集体相关，因为各个 UPR 信号通路可在不涉及蛋白质聚集体的情况下被直接激活。因此，尽管 ThT 染色法可提供 ER 应激水平的初步信息，但在深入分析 UPR 激活时，必须结合对 UPR 标志物的进一步检测进行验证。此外，为了进一步明确 ThT 染色的亚细胞定位，可使用如 KDEL 等标记物来标记内质网。另外，在许多情况下，ER 应激会导致细胞大小和形态发生变化，因此在定量 ThT 荧光强度时，也可同时考虑细胞面积的变化。高灵敏度、可靠且成本效益良好的商业化基因特异性抗体的广泛应用，已彻底改变了生命科学领域的诸多方面，使细胞中蛋白质水平的分析更加便捷。如今，还配备了高度灵敏的仪器，可用于可视化印迹上的蛋白条带，并使定量过程更加快速和简便。因此，可通过免疫印迹法轻松分析 UPR 标志物的激活情况。然而，由于 UPR 标志蛋白的表达水平相对较低，因此需要使用较高浓度的蛋白样品以检测其表达。此外，应根据实验所用细胞中蛋白的表达水平，优化一抗的稀释比例，以避免非特异性结合和印迹背景噪音。同时，如图 4C所示，ATF6 抗体为多克隆抗体，会产生多个非特异性条带，需通过优化洗涤条件和抗体浓度，尽可能减少这些非特异性条带。在封闭液、一抗和二抗孵育后，应对印迹膜进行充分洗涤，以降低背景信号和非特异性条带。在显影过程中，应避免条带过度饱和，以确保结果中条带模式的准确呈现。鉴于本文方法的总体范围较广，我们未详细阐述常规免疫印迹技术的具体操作步骤和故障排除方法；对此，可参考 Mahmood 和 Yang33 以及 Ghosh 等人34 的方法学文章。目前，RT-PCR 是一种广泛应用的技术， readily available 的引物和 RT-PCR 仪器可提供用于分析特定 UPR 标志物的数据。然而，在制备用于 RT-PCR 的 RNA 和 cDNA 时需格外谨慎，因为该方法极为敏感，样品质量或移液操作的微小差异均可能导致结果出现显著偏差。RNA 样品中应彻底去除任何 DNA 或蛋白质污染。此外，进行 qRT-PCR 时应始终设置三个重复样本，以减少移液误差。用于 qRT-PCR 的 DNA 浓度应优化至每个样本的 CT 值低于 30，因为 CT 值超过 30 被认为不够理想。qRT-PCR 实验中必须设置阴性对照，以避免假阳性结果。XBP1 的剪接情况既可通过 qRT-PCR，也可通过半定量 RT-PCR（semi-qRT-PCR）进行分析。由于 qRT-PCR 无法准确反映剪接情况，因此除 qRT-PCR 外，还应进行 semi-qRT-PCR 以验证数据，并确定剪接型 XBP1 与未剪接型 XBP1 的相对比例。由于剪接型与未剪接型 XBP1 的大小差异仅为 26 个核苷酸，应使用更高浓度的琼脂糖凝胶以实现有效分离。此外，应在较低电压和较长时间下电泳，以获得更好的条带分辨效果。目前另一种更常用的方法是剪接分析法，该方法利用 Pst1 限制性内切酶对 cDNA 进行消化，可更清晰地显示 XBP1 的剪接状态35。该方法也可用于观察 HIV-1 感染样本中 XBP1 的剪接情况。免疫印迹和 RT-PCR 所得结果可用于验证 ThT 染色的结果。
所示的代表性结果 图5 表明HIV-1感染时UPR的激活与ThT染色增强相关 图4然而，使用免疫印迹和RT-PCR分析未折叠蛋白反应（UPR）存在局限性：这些方法操作繁琐，且由于各个UPR相关基因可被非内质网应激因素独立调控，需同时监测多个基因产物。此外，这些方法通过检测不同的UPR标志分子间接反映内质网应激水平。因此，可将硫磺素T（ThT）染色与免疫印迹及RT-PCR对UPR标志分子的分析相结合，用于研究HIV-1感染对T细胞内质网应激及UPR激活的影响。
本文的第二部分涉及研究未折叠蛋白反应（UPR）对HIV-1复制影响的相关实验方案。本文所述用于敲低UPR标志物的反向转染方法被发现可显著降低UPR标志物的表达水平。如实验方案中所述，在荧光素酶检测中使用GFP荧光信号对荧光素酶读数进行归一化处理。然而，在许多情况下，特定基因的转染也可能影响GFP读数36，因此此时可采用其他荧光标记（如RFP、YFP）或总蛋白浓度对荧光素酶读数进行归一化。此外，在某些难以裂解的细胞（如TZM-bl细胞）中，可在加入荧光素酶底物前添加额外的裂解试剂。结果表明，荧光素酶检测结果（图6A 左图）与PERK条件下的p24 ELISA结果一致（图6B 左图），即PERK敲低显著降低了HIV-1基因活性和病毒产生。而对于HSPA5，根据荧光素酶检测结果，HSPA5敲低并不影响LTR驱动的基因活性（图6A 右图），但p24 ELISA结果显示其会影响病毒的产生（图6B 右图）。因此，这些结果提示不同的UPR标志物可能对HIV-1 LTR驱动的基因活性和病毒产生具有不同的影响。通过ELISA在上清液中检测到的p24抗原主要反映的是培养上清中释放的病毒颗粒浓度。因此，研究人员通常将p24抗原捕获ELISA结果作为细胞上清中病毒产生的间接指标37。因此，细胞内的荧光素酶检测与上清液中的p24 ELISA可联合使用，以评估对HIV-1 LTR驱动的基因活性及病毒产生的影响。此外，该方案也可通过使用基因特异性的shRNA来分析其他UPR标志物对HIV-1 LTR驱动的基因活性和病毒产生的影响。对于所有涉及p24 ELISA和荧光素酶检测读数的实验，必须确保适当的稀释倍数和孵育时间，并排除异常值。例如，在进行p24 ELISA时，OD450值在0.1–2之间被认为是理想的。研究UPR在HIV-1复制中作用的第二种方法是使用药理学分子，如内质网应激诱导剂毒胡萝卜素（Thapsigargin）或内质网应激抑制剂TUDCA。这些药物在多种研究背景下被广泛用于UPR的研究38,39,40,41。本文展示了Thapsigargin处理的实验方案，并分析了其对T细胞中HIV-1感染进程的影响。在将药物用于任何实验之前，强烈建议在拟使用的细胞系中对药物的不同剂量进行细胞活力检测。应避免使用导致该细胞系细胞活力低于约80%的浓度。此外，在进行细胞活力检测时，应始终使用健康细胞，因为已处于应激状态的细胞无法提供准确的读数，且细胞碎片可能引起浊度，导致假性读数。本研究中所述方案展示了感染后72小时内Thapsigargin对病毒复制的影响，从而更全面地揭示药物在时间进程上对病毒复制的作用。研究者也可采用更短的时间间隔（如感染后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h）进一步分析药物对病毒复制产生影响的最早时间点。
由于未折叠蛋白反应（UPR）也参与蛋白质降解和膜动态过程42,43，因此UPR可能在病毒颗粒的感染性中发挥作用。通过本方案也可分析细胞所产生的病毒颗粒的感染性。上述方案还可用于研究HIV-1感染对内质网应激和UPR的影响，以及其在人外周血单个核细胞（PBMCs）中的功能相关性，从而开展更具生物学意义的研究。鉴于人们日益认识到UPR在多种严重疾病发生发展中的作用，阐明内质网-UPR在HIV-1感染中的功能至关重要。采用这一系列方法所获得的信息将有助于深入理解HIV-1与UPR之间的相互作用，从而推动这一尚未充分探索领域的研究进展。

获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的特征是CD4+ T淋巴细胞数量逐渐减少，导致免疫应答进行性衰竭。人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）是引起AIDS的病原体。它是一种有包膜的、正链单股RNA病毒，每个病毒颗粒含有两份RNA拷贝，属于逆转录病毒科。在宿主细胞内高水平表达病毒蛋白会对细胞的蛋白质折叠系统造成过度负担1。内质网（ER）是真核细胞分泌途径中的第一个区室，负责合成、修饰并将蛋白质运送至分泌途径及细胞外靶位点。蛋白质在内质网中经历多种翻译后修饰并折叠成天然构象，包括天冬酰胺连接的糖基化以及分子内和分子间二硫键的形成2。因此，内质网腔内存在高浓度的蛋白质，这些蛋白质极易发生聚集和错误折叠。多种生理状态，如热休克、微生物或病毒感染，以及需要增强蛋白质合成或发生蛋白质突变的情况，都会因内质网中蛋白质积累增加而导致内质网应激，从而破坏内质网腔内的稳态。内质网应激会激活一组高度保守的适应性信号转导通路，即未折叠蛋白反应（UPR）3。UPR通过协调未折叠蛋白负荷与折叠能力，旨在恢复内质网正常的生理状态。这一过程通过增加内质网体积以及内质网驻留的分子伴侣和折叠酶的表达，从而提升内质网的蛋白质折叠能力。同时，UPR还通过在翻译水平上全局性抑制蛋白质合成来降低内质网的蛋白质负荷，并通过上调内质网相关降解（ERAD）途径促进未折叠蛋白从内质网中的清除4,5。
内质网应激由三种定位于内质网的跨膜蛋白感知：蛋白激酶R（PKR）样内质网激酶（PERK）、激活转录因子6（ATF6）以及肌醇需求酶1型（IRE1）。这些效应分子在正常情况下通过与分子伴侣热休克蛋白家族A（Hsp70）成员5（HSPA5）结合而保持非活性状态，HSPA5也被称为结合蛋白（BiP）或78-kDa葡萄糖调节蛋白（GRP78）。当发生内质网应激并导致未折叠或错误折叠蛋白积累时，HSPA5发生解离，从而激活上述效应分子，进而启动一系列下游靶点的表达，以帮助缓解内质网应激；在极端情况下，则促进细胞死亡6。PERK在与HSPA5解离后发生自磷酸化，其激酶活性被激活7。活化的PERK激酶可磷酸化eIF2α，导致翻译过程受到抑制，从而降低内质网的蛋白质负荷8。然而，在磷酸化真核起始因子2α（eIF2α）存在的情况下，某些特定mRNA上的非翻译开放阅读框会被优先翻译，例如ATF4，进而调控应激诱导基因的表达。ATF4和C/EBP同源蛋白（CHOP）是转录因子，可调控应激诱导基因，并参与调控凋亡及细胞死亡通路9，10。ATF4和CHOP的靶基因之一是生长停滞和DNA损伤诱导蛋白（GADD34），该蛋白与蛋白磷酸酶1共同作用，使磷酸化的eIF2α去磷酸化，从而作为翻译抑制的负反馈调节因子11。在内质网应激条件下，ATF6从HSPA5上解离，暴露出其高尔基体定位信号，促使其转运至高尔基体。在高尔基体中，ATF6被位点1蛋白酶（S1P）和位点2蛋白酶（S2P）切割，释放出剪切形式的ATF6（ATF6 p50）。ATF6 p50随后转入细胞核，诱导一系列参与蛋白质折叠、成熟与分泌以及蛋白质降解相关基因的表达12，13。在内质网应激期间，IRE1从HSPA5上解离，发生多聚化并自磷酸化14。IRE1的磷酸化激活其RNase结构域，特异性介导X-box结合蛋白1（XBP1）mRNA中央区域26个核苷酸的剪接15，16。这一剪接过程产生新的C末端，赋予其转录激活功能，生成具有活性的XBP1s蛋白，这是一种强效的转录因子，可调控多个内质网应激诱导基因的表达17，18。这些转录因子的协同作用启动了旨在恢复内质网稳态的遗传程序。
检测内质网应激和未折叠蛋白反应（UPR）的方法有多种，包括常规的UPR标志物分析方法19,20。各种非常规方法则包括测定UPR的氧化还原状态、内质网腔内的钙离子分布以及评估内质网结构。可利用电子显微镜观察细胞和组织中内质网腔在内质网应激下的扩张程度。然而，该方法耗时较长，且依赖于电子显微镜设备的可及性，而并非每个研究团队都能获得该设备。此外，由于试剂的可获得性限制，测定内质网的钙离子流和氧化还原状态也具有挑战性。而且，这些实验的检测结果非常敏感，可能受到细胞代谢其他因素的影响。
一种强大且简单的监测未折叠蛋白反应（UPR）输出的方法是检测UPR不同信号通路的激活状态，该方法已在多种应激情境下使用数十年。与其它已知方法相比，这些传统的UPR激活检测方法经济、可行，并能更快地提供信息。这些方法包括免疫印迹法，用于在蛋白水平检测UPR标志物的表达，例如IRE1、PERK和eIF2α的磷酸化，以及通过检测ATF6的P50形式来分析ATF6的切割，同时还可检测其他标志物（如HSPA5、剪切型XBP1、ATF4、CHOP和GADD34）的蛋白表达；此外还包括RT-PCR，用于测定mRNA水平以及XBP1 mRNA的剪接情况。
本文介绍了一套经过验证且可靠的实验方案，用于监测 HIV-1 感染细胞中的内质网应激（ER stress）和未折叠蛋白反应（UPR）的激活状态，并确定 UPR 在 HIV-1 复制和感染能力中的功能相关性。这些方案使用易于获取且经济的试剂，可提供关于 UPR 输出结果的有力信息。内质网应激是由于未折叠或错误折叠蛋白的积累所致，这些蛋白易于形成蛋白聚集体21。本文描述了一种在 HIV-1 感染细胞中检测此类蛋白聚集体的方法。硫黄素 T（Thioflavin T）染色是一种相对较新的用于检测和定量蛋白聚集体的方法22。Beriault 和 Werstuck 描述了该技术，用于检测和定量蛋白聚集体，从而评估活细胞中的内质网应激水平。已有研究表明，小分子荧光染料硫黄素 T（ThT）可选择性地结合蛋白聚集体，尤其是淀粉样纤维。
本文描述了使用硫黄素T（ThT）检测和定量HIV-1感染细胞中的内质网应激，并将其与通过测量未折叠蛋白反应（UPR）不同信号通路的活化来监测UPR的传统方法进行关联。
由于目前关于未折叠蛋白反应（UPR）在HIV-1感染过程中作用的综合信息仍然缺乏，本文提供了一套用于研究UPR在HIV-1复制及病毒颗粒感染性中作用的实验方案。这些方案包括利用慢病毒介导的UPR标志物敲低，以及使用药理性内质网应激诱导剂进行处理。本文还展示了可用于检测HIV-1基因表达、病毒产生以及所产生病毒颗粒感染性的多种检测方法，例如基于长末端重复序列（LTR）的荧光素酶检测、p24酶联免疫吸附试验（ELISA）以及β-半乳糖苷酶报告基因染色检测。
利用这些方案中的大部分，我们近期报道了HIV-1感染对T细胞中未折叠蛋白反应（UPR）的功能影响23，该文章的结果表明本文所述方法具有可靠性。因此，本文提供了一套方法，用于全面了解HIV-1与内质网应激及UPR激活之间的相互作用。

<table><tbody><tr><td>丙烯酰胺</td><td>Biorad, USA</td><td>1610107</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>G-Biosciences, USA</td><td>RC1013</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>ATF4 抗体</td><td>Cell Signaling Technology, USA</td><td>11815</td><td>Western blot 检测 稀释比例-1:1000</td></tr><tr><td>ATF6 抗体</td><td>Abcam, UK</td><td>ab122897</td><td>Western blot 检测 稀释比例-1:1000</td></tr><tr><td>CHOP 抗体</td><td>Cell Signaling Technology, USA</td><td>2897</td><td>Western blot 检测 稀释比例-1:1000</td></tr><tr><td>eIF2&amp;alpha; 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology, USA</td><td>sc-11386</td><td>Western blot 检测 稀释比例-1:2000&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>GADD34 抗体</td><td>Abcam, UK</td><td>ab236516</td><td>Western blot 检测 稀释比例-1:1000</td></tr><tr><td>GAPDH 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology, USA</td><td>sc-32233</td><td>Western blot 检测 稀释比例-1:3000&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HSPA5 抗体</td><td>Cell Signaling Technology, USA</td><td>3177</td><td>Western blot 检测 稀释比例-1:1000</td></tr><tr><td>IRE1 抗体</td><td>Cell Signaling Technology, USA</td><td>3294</td><td>Western blot 检测 稀释比例-1:2000</td></tr><tr><td>抗小鼠 HRP 偶联抗体&amp;nbsp;</td><td>Biorad, USA</td><td>1706516</td><td>Western blot 检测 稀释比例-1:4000</td></tr><tr><td>磷酸化 eIF2&amp;alpha; 抗体</td><td>Invitrogen, USA</td><td>44-728G</td><td>Western blot 检测 稀释比例-1:1000</td></tr><tr><td>PERK 抗体</td><td>Cell Signaling Technology, USA</td><td>5683</td><td>Western blot 检测 稀释比例-1:2000</td></tr><tr><td>磷酸化 IRE1 抗体</td><td>Abcam, UK</td><td>ab243665</td><td>Western blot 检测 稀释比例-1:1000</td></tr><tr><td>磷酸化 PERK 抗体</td><td>Invitrogen, USA</td><td>PA5-40294</td><td>Western blot 检测 稀释比例-1:2000</td></tr><tr><td>抗兔 HRP 偶联抗体</td><td>Biorad, USA</td><td>1706515</td><td>Western blot 检测 稀释比例-1:4000</td></tr><tr><td>XBP1 抗体</td><td>Abcam, UK</td><td>ab37152</td><td>Western blot 检测 稀释比例-1:1000</td></tr><tr><td>台式高速离心机</td><td>Eppendorf, USA</td><td>5804R</td><td>转子- F-45-30-11</td></tr><tr><td>台式低速离心机</td><td>Eppendorf, USA</td><td>5702R</td><td>转子- A-4-38</td></tr><tr><td>双丙烯酰胺</td><td>Biorad, USA</td><td>1610201</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)</td><td>MP biomedicals, USA</td><td>160069</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 试剂</td><td>Biorad, USA</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>CalPhos 哺乳动物转染试剂盒</td><td>Clontech, Takara Bio, USA</td><td>631312</td><td>病毒储备液制备</td></tr><tr><td>CEM-GFP</td><td>NIH, AIDS Repository, USA</td><td>3655</td><td></td></tr><tr><td>Clarity ECL 底物</td><td>Biorad, USA</td><td>1705061</td><td>化学发光检测底物</td></tr><tr><td>Clarity max ECL 底物</td><td>Biorad, USA</td><td>1705062</td><td>化学发光检测底物</td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Olympus, Japan</td><td>型号：FV3000</td><td></td></tr><tr><td>细胞离心涂片机</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>ASHA78300003</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen, USA</td><td>11995073</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega, USA</td><td>U1515</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen, USA</td><td>R0861</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen, USA</td><td>12635</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭 (EtBr)</td><td>Invitrogen, USA</td><td>`15585011</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen, USA</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Invitrogen, USA</td><td>11811023</td><td></td></tr><tr><td>25% 戊二醛</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>G6257</td><td>感染性检测</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>Q24755</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293T</td><td>NCCS, India</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HIV-1 感染性分子克隆 pNL4-3</td><td>NIH, AIDS Repository, USA</td><td>114</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Nikon, Japan</td><td>型号：Eclipse Ti2</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Biorad, USA</td><td>1715124</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat J6</td><td>NCCS, India</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>M8266</td><td>感染性检测</td></tr><tr><td>MMLV-RT&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen, USA</td><td>28025013</td><td></td></tr><tr><td>MTT 试剂</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>M5655</td><td>细胞活力检测</td></tr><tr><td>N,N-二甲基甲酰胺</td><td>Fluka Chemika</td><td>40255</td><td>感染性检测</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>Q27605</td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>201154</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>Invitrogen, USA</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>P24 抗原捕获 ELISA 试剂盒</td><td>ABL, USA</td><td>5421</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler 预染蛋白 Marker</td><td>Sci-fi Biologicals, India</td><td>PGPMT078</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-N1</td><td>Clontech, USA</td><td>632515</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen, USA</td><td>151140122</td><td></td></tr><tr><td>磷酸酶抑制剂</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>4906837001</td><td></td></tr><tr><td>Phusion 高保真 PCR 预混液（含 GC 缓冲液）</td><td>NEB,USA</td><td>M05532</td><td></td></tr><tr><td>pLKO.1-TRC</td><td>Addgene, USA</td><td>10878</td><td>慢病毒克隆载体</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene, USA</td><td>12259</td><td>VSV-G 包膜载体</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺 (PEI)&amp;nbsp;</td><td>Polysciences, Inc., USA</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>铁氰化钾</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>244023</td><td>感染性检测</td></tr><tr><td>亚铁氰化钾</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P3289</td><td>感染性检测</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma-Aldrich, USA&amp;nbsp;</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene, USA</td><td>12260</td><td>慢病毒包装质粒</td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P8833</td><td>稳定细胞筛选</td></tr><tr><td>PVDF 膜</td><td>Biorad, USA</td><td>1620177</td><td></td></tr><tr><td>随机引物</td><td>Invitrogen, USA</td><td>48190011</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen, USA</td><td>22400105</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Steady-Glo 底物</td><td>Promega, USA</td><td>E2510</td><td>荧光素酶检测</td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>Invitrogen, USA</td><td>15224017</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Invitrogen, USA</td><td>17919</td><td></td></tr><tr><td>毒胡萝卜素</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>T9033</td><td></td></tr><tr><td>硫黄素 T</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>596200</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>Q15965</td><td></td></tr><tr><td>吐温-100 (Triton-X-100)</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen, USA</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>吐温 20</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>TZM-bl</td><td>NIH, AIDS Repository, USA</td><td>8129</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Beckman Optima L90K, USA</td><td>330049</td><td>转子-SW28Ti</td></tr><tr><td>UltraPure X-gal</td><td>Invitrogen, USA</td><td>15520-018</td><td>感染性检测</td></tr></tbody></table>

测量hiv-1感染t细胞中的内质网应激与未折叠蛋白反应及其在hiv-1复制中的作用分析

Measuring Endoplasmic Reticulum Stress and Unfolded Protein Response in HIV-1 Infected T-Cells and Analyzing its Role in HIV-1 Replication

病毒感染可因异常蛋白质积聚而引发内质网（ER）应激，进而导致未折叠蛋白反应（UPR）。病毒已进化出多种策略来操控宿主的UPR，但目前文献中对HIV-1感染过程中UPR的调控机制及其功能意义仍缺乏深入理解。在此背景下，本文介绍了我们实验室用于检测T细胞中HIV-1感染期间内质网应激水平和UPR状态的实验方案，以及UPR对病毒复制和感染能力的影响。
硫黄素T（ThT）染色是一种相对较新的方法，通过检测蛋白质聚集体来识别细胞中的内质网应激。本文阐述了在HIV-1感染细胞中进行ThT染色以检测和定量内质网应激的实验方案。此外，还通过常规蛋白质印迹和定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测HIV-1感染细胞中未折叠蛋白反应（UPR）标志物的水平，间接评估内质网应激，这些标志物包括BiP、磷酸化的IRE1、PERK和eIF2α、XBP1的剪接、ATF6的切割以及ATF4、CHOP和GADD34的表达。我们发现ThT荧光信号与UPR激活的指标呈正相关。本文还展示了通过基因敲低实验以及药理学分子的应用，分析内质网应激和UPR调控对HIV-1复制影响的实验方案。UPR对HIV-1基因表达/复制和病毒产生的影响分别通过荧光素酶报告基因检测和p24抗原捕获ELISA进行分析，而对病毒颗粒感染性的影响则通过感染报告细胞的染色来评估。总体而言，这一系列方法为深入理解HIV-1感染过程中未折叠蛋白反应通路及其复杂动态提供了全面的技术支持。

在本研究中，我们描述了一种详细的实验方案，用于研究 体外 T细胞中HIV-1感染引起的内质网应激与未折叠蛋白反应激活图2）。本研究还描述了分析未折叠蛋白反应（UPR）在HIV-1复制及病毒颗粒感染性中功能相关性的方法（图3).
为此，我们通过硫黄素T染色观察细胞内蛋白质聚集体，分析了HIV-1感染所引起的内质网应激。如图4A所示，ThT荧光强度反映了未感染和感染细胞中的蛋白质聚集体情况。同样，作为阳性对照，图4B显示了毒胡萝卜素处理细胞中的ThT染色结果。ThT荧光强度增强表明存在更多的蛋白质聚集体，这与内质网应激增强相关。
此外，为了验证这一观察结果，采用了更为传统的方法，即通过分析未折叠蛋白反应（UPR）标志物来进行验证。首先通过分析UPR主要效应分子IRE1、ATF6和PERK的活化情况来评估UPR的激活。IRE1的活化通过免疫印迹法检测感染后不同时间点收集的未感染和感染细胞裂解液中磷酸化IRE1的水平来测定，如图5A所示。pIRE1/总IRE1水平的升高提示IRE1被激活。类似地，PERK的活化通过检测未感染和感染细胞中磷酸化PERK的水平来评估（图5B）。ATF6的活化则通过免疫印迹法检测其P50活性形式的表达水平进行定量分析（图5C）。UPR的另一个重要标志物是主调控因子及内质网分子伴侣HSPA5，其表达水平也通过免疫印迹法进行分析，结果如图5D所示。对于其他UPR标志物，如剪切型XBP1（sXBP1）、磷酸化eIF2α（peIF2α）、ATF4、CHOP和GADD34，也采用相同的实验流程，使用各自的特异性抗体进行检测（补充图1）。XBP1 mRNA的剪接可通过定量RT-PCR（图5E）和半定量RT-PCR进行分析。由于定量RT-PCR无法特异性识别剪接事件，因此结合剪接分析实验，采用半定量RT-PCR方法进行验证（图5F）。通过上述实验方案，我们观察到qRT-PCR结果与半定量RT-PCR结果一致。与sXBP1的qRT-PCR分析类似，该实验流程也被用于在mRNA水平上分析其他UPR标志物，如HSPA5、ATF4、CHOP和GADD34的表达情况（补充图2）
接下来，为了研究未折叠蛋白反应（UPR）在HIV-1复制及病毒颗粒感染性中的作用，我们对某些UPR标志物——PERK和HSPA5进行了基因敲低。通过上述实验方案，我们在HEK-293T细胞（图6A）和J6细胞（图6B）中均实现了这些标志物的显著敲低。利用这些敲低细胞，我们检测了HIV-1 LTR驱动的基因活性的变化（图6A），该活性以各样本中Luc/GFP表达比值表示。病毒产量通过上清液中p24的ELISA检测进行测定，结果如图6B所示。所产生的病毒颗粒的感染性也可采用β-半乳糖苷酶染色法（β-gal染色）进行分析，方法同图1A所示。
此外，通过使用内质网应激化学诱导剂毒胡萝卜素（Thapsigargin），可研究未折叠蛋白反应（UPR）过度激活对HIV-1复制、病毒产生及病毒颗粒感染性的影响。采用MTT法分析了给定浓度下毒胡萝卜素的细胞毒性（图7A），结果显示在目标浓度下其细胞毒性不显著。通过HSPA5的免疫印迹实验评估该药物对内质网应激的影响（图7B）。结果表明，100 nM毒胡萝卜素预处理12小时可在所有时间点诱导HSPA5的表达。p24 ELISA用于检测病毒产生量以及所产生病毒颗粒的感染性，其分析方法如前所述。
<img alt="细胞感染分析；显微镜图像及条形图显示病毒感染研究中p24水平随时间变化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66522/66522fig01.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1：病毒颗粒感染性的定量及感染进程分析。（A）基于TZM-bl细胞的β-半乳糖苷酶检测法对病毒颗粒感染性进行定量。通过将1 ng、0.1 ng和0.01 ng的病毒加入TZM-bl细胞，随后进行β-半乳糖苷酶染色并计数蓝色细胞数量，以确定病毒的感染性。放大倍数：10×。（B）基于培养上清液中p24抗原捕获ELISA对0.5 MOI HIV-1感染的CEM-GFP细胞的感染进程进行分析。用0.5 MOI的HIV-1感染CEM-GFP细胞，并对上清液进行p24 ELISA检测。误差线表示为均值±标准误（S.E.）。星号表示显著性水平，在图中表示为：ns = p ≥ 0.05，* = p ≤ 0.05，** = p ≤ 0.01，*** = p ≤ 0.001，**** = p ≤ 0.0001，由Student's t-检验分析得出。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66522/66522fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="病毒定量流程图；p24 ELISA 检测、CEM-GFP 细胞、UPR 标志物分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66522/66522fig02.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图 2：分析 HIV-1 感染对内质网应激和未折叠蛋白反应（UPR）影响的实验步骤示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66522/66522fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="UPR标志物敲低、HIV-1感染过程；shRNA载体、荧光素酶、p24 ELISA示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66522/66522fig03.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3：分析UPR对HIV-1复制、病毒产生及病毒颗粒感染性影响的实验步骤流程图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66522/66522fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="相差、GFP 和硫黄素 T 染色的细胞成像；荧光强度图；显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66522/66522fig04.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4：利用硫黄素 T 染色分析 HIV-1 感染所致 T 细胞内质网应激水平。（A）CEM-GFP 细胞以 0.5 MOI 的 HIV-1 感染，并于感染后 72 小时收集。细胞经固定后用硫黄素 T 染色。GFP 表达指示被感染的 CEM-GFP 细胞。图中显示未感染细胞与 HIV-1 感染细胞中硫黄素 T 的荧光强度。图中数据来自 n = 3 次生物学重复实验，每次约 50 个细胞。(B) CEM-GFP 细胞分别用 DMSO 和 TG 处理 12 小时。细胞经固定后用硫黄素 T 染色。图中显示 DMSO 与 TG 处理细胞中硫黄素 T 的荧光强度。图中数据来自 n = 3 次生物学重复实验，每次约 50 个细胞。误差线表示为均值 ± 标准误（S.E.）。星号表示显著性水平，在图中标识为：ns = p ≥ 0.05，* = p ≤ 0.05，** = p ≤ 0.01，*** = p ≤ 0.001，**** = p ≤ 0.0001，经 Student's t-检验分析。UN：未感染；IN：感染；TG：毒胡萝卜素。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66522/66522fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="感染后蛋白质表达的Western印迹分析；包含图表和凝胶电泳结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66522/66522fig05.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图5"> 
图5：HIV-1感染T细胞中不同未折叠蛋白反应（UPR）标志物表达的分析。（A-E）用HIV-1（0.5 MOI）感染CEM-GFP细胞，自感染后每隔24小时收集细胞直至第4天，并按以下方法进行各项分析。（A）通过pIRE1的免疫印迹分析IRE1的活化情况。（B）通过pPERK的免疫印迹分析PERK的活化情况。（C）通过检测ATF6 P50形式的免疫印迹分析ATF6的活化情况。（D）通过HSPA5免疫印迹分析内质网分子伴侣HSPA5的表达水平。（E）使用特异性实时引物对sXBP1进行qRT-PCR分析XBP1的剪接情况。（F）为通过半定量RT-PCR分析XBP1剪接情况，采用RT-PCR扩增跨越剪接位点的XBP-1 mRNA，并对扩增条带进行可视化检测。误差线表示为均值±标准误（S.E）。UN：未感染；IN：感染。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66522/66522fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="PERK、HSPA5 表达对 HIV-1 感染标志物的 Western 印迹分析与柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66522/66522fig06.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 6"> 
图 6：未折叠蛋白反应（UPR）在 HIV-1 复制与病毒产生中的作用分析。 （A）在 HEK-293T 细胞中敲低 PERK（左图）和 HSPA5（右图），随后进行荧光素酶检测以分析 HIV-1 LTR 驱动的基因活性。免疫印迹图显示相应蛋白的敲低水平。（B）在 J6 细胞中敲低 PERK（左图）和 HSPA5（右图），并使用收集的上清液进行 p24 ELISA 检测以分析病毒产量。免疫印迹图显示相应蛋白的敲低水平。误差棒表示为均值 ± 标准误（S.E.）。星号表示显著性水平，在图中表示为：ns = p ≥ 0.05，* = p ≤ 0.05，** = p ≤ 0.01，*** = p ≤ 0.001，**** = p ≤ 0.0001，通过 Student's t-检验进行分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66522/66522fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="细胞活力和蛋白质表达分析；用于HIV-1感染研究的柱状图和Western blot。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66522/66522fig07.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 7"> 
图7：化学性内质网应激诱导剂Thapsigargin对HIV-1感染进程的影响分析。（A）CEM-GFP细胞经100 nM Thapsigargin处理后的细胞活力。细胞活力通过MTT法测定。（B）CEM-GFP细胞预先用100 nM TG处理12小时后，以0.5 MOI的HIV-1感染，并在感染后24小时、48小时和72小时收集细胞。免疫印迹显示TG对HSPA5表达的影响，而柱状图显示通过p24 ELISA检测的病毒产量。误差线表示为均值±标准误（S.E）。星号表示显著性水平，在图中表示为：ns = p ≥ 0.05，* = p ≤ 0.05，** = p ≤ 0.01，*** = p ≤ 0.001，**** = p ≤ 0.0001，由Student's t-检验分析。TG：Thapsigargin。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66522/66522fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
补充图1：UPR不同下游标志物表达的分析。 通过免疫印迹法分析（A）sXBP1、（B）eIF2α的磷酸化、（C）ATF4、（D）CHOP以及（E）GADD34的表达。（A-E）以0.5 MOI的HIV-1感染CEM-GFP细胞，在感染后24 h、48 h、72 h和96 h收集细胞，并用于免疫印迹实验。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66522/Revised%20SUPPLEMENTARY%20FIGURE1.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图2：通过qRT-PCR分析不同UPR标志物的mRNA水平 (A-D感染了0.5 MOI HIV-1的CEM-GFP细胞每隔24小时收集一次，直至第4天，并用于qRT-PCR检测（AHSPA5，（B) ATF4, (C) CHOP，以及（D) GADD34。误差线表示为均值 ± 标准误（S.E.）。星号表示显著性水平，在图中表示为：ns = p ≥ 0.05，* = p ≤ 0.05，** = p ≤ 0.01，*** = p ≤ 0.001，**** = p ≤ 0.0001，由Student's t检验分析得出。 t测试。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66522/SUPPLEMENTARY%20FIGURE2%20R2.zip" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>引物名称</td>
			<td colspan="2">引物序列 5’ 至 3’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XBP1 SPLICING ASSAY F</td>
			<td colspan="2">TTACGAGAGAAAACTCATGGCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XBP1 SPLICING ASSAY R</td>
			<td colspan="2">GGGTCCAAGTTGTCCAGAATGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPLICED XBP1 F</td>
			<td colspan="2">CTGAGTCCGAATCAGGTGCAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPLICED XBP1 R</td>
			<td colspan="2">ATCCATGGGGAGATGTTCTGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSPA5 F</td>
			<td colspan="2">CACAGTGGTGCCTACCAAGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSPA5 R</td>
			<td colspan="2">TGATTGTCTTTTGTCAGGGGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATF4 F</td>
			<td colspan="2">AGTCCCTCCAACAACAGCAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATF4 R</td>
			<td colspan="2">GAAGGTCATCTGGCATGGTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHOP F</td>
			<td colspan="2">CAGTGTCCCGAAGGAGAAAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHOP R</td>
			<td colspan="2">CAGAGCTGGAACCTGAGGAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GADD34 F</td>
			<td colspan="2">ATGGACAGTGACCTTCTCGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GADD34 R</td>
			<td colspan="2">CTGGGCTCCTCCTAGGCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACTIN F</td>
			<td colspan="2">AGAAAATCTGGCACCACACC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACTIN R</td>
			<td colspan="2">GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：用于RT-PCR分析的引物列表。 F：正向；R：反向
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>shRNA 构建体</td>
			<td colspan="4">引物序列 5’ 至 3’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PERK SH1 F</td>
			<td colspan="4">CCGGCGGCAGGTCATTAGTAATTATCTCGAGATAATTACTAATGACCTGCCGTTTTTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PERK SH1 R</td>
			<td colspan="4">AATTCAAAAACGGCAGGTCATTAGTAATTATCTCGAGATAATTACTAATGACCTGCCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PERK SH2 F</td>
			<td colspan="4">CCGGGCCACTTTGAACTTCGGTATACTCGAGTATACCGAAGTTCAAAGTGGCTTTTTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PERK SH2 R</td>
			<td colspan="4">AATTCAAAAAGCCACTTTGAACTTCGGTATACTCGAGTATACCGAAGTTCAAAGTGGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATF6 SH1 F</td>
			<td colspan="4">CCGGCCCAGAAGTTATCAAGACTTTCTCGAGAAAGTCTTGATAACTTCTGGGTTTTTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATF6 SH1 R</td>
			<td colspan="4">AATTCAAAAACCCAGAAGTTATCAAGACTTTCTCGAGAAAGTCTTGATAACTTCTGGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATF6 SH2 F</td>
			<td colspan="4">CCGGCCTAGTCCAAAGCGAAGAGTTCTCGAGAACTCTTCGCTTTGGACTAGGTTTTTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATF6 SH2 R</td>
			<td colspan="4">AATTCAAAAACCTAGTCCAAAGCGAAGAGTTCTCGAGAACTCTTCGCTTTGGACTAGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRE1 SH1 F</td>
			<td colspan="4">CCGGCCTGCTTAATGTCAGTCTACACTCGAGTGTAGACTGACATTAAGCAGGTTTTTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRE1 SH1 R</td>
			<td colspan="4">AATTCAAAAACCTGCTTAATGTCAGTCTACACTCGAGTGTAGACTGACATTAAGCAGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRE1 SH2 F</td>
			<td colspan="4">CCGGCCCATCAACCTCTCTTCTGTACTCGAGTACAGAAGAGAGGTTGATGGGTTTTTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRE1 SH2 R</td>
			<td colspan="4">AATTCAAAAACCCATCAACCTCTCTTCTGTACTCGAGTACAGAAGAGAGGTTGATGGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSPA5 SH1 F</td>
			<td colspan="4">CCGGGAGCGCATTGATACTAGAAATCTCGAGATTTCTAGTATCAATGCGCTCTTTTTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSPA5 SH1 R</td>
			<td colspan="4">AATTCAAAAAGAGCGCATTGATACTAGAAATCTCGAGATTTCTAGTATCAATGCGCTC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSPA5 SH2 F</td>
			<td colspan="4">CCGGGTGAGTGATCACTGGTATTAACTCGAGTTAATACCAGTGATCACTCACTTTTTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSPA5 SH2 R</td>
			<td colspan="4">AATTCAAAAAGTGAGTGATCACTGGTATTAACTCGAGTTAATACCAGTGATCACTCAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LacZ F</td>
			<td colspan="4">CCGGTCGTATTACAACGTCGTGACTCTCGAGAGTCACGACGTTGTAATACGATTTTTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LacZ R</td>
			<td colspan="4">AATTCAAAAATCGTATTACAACGTCGTGACTCTCGAGAGTCACGACGTTGTAATACGA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：用于构建shRNA载体的引物序列列表。 F：正向；R：反向

本文介绍了一些用于检测内质网（ER）应激及未折叠蛋白反应（UPR）激活的成熟方法，特别侧重于在HIV-1感染中的应用。此外，本文还描述了一系列用于研究内质网应激/UPR对HIV-1复制及病毒颗粒感染性影响的实验方案。

测量HIV-1感染T细胞中的内质网应激与未折叠蛋白反应及其在HIV-1复制中的作用分析

病毒感染可因异常蛋白质积聚引发内质网（ER）应激，进而导致未折叠蛋白反应（UPR）。病毒……

我们的研究重点是宿主与病原体之间的相互作用，特别关注在HIV-1感染过程中未折叠蛋白反应通路的调控机制。本研究探讨了HIV-1感染如何改变内质网应激和UPR激活标志物，以及这些变化对T细胞中病毒复制和感染能力的影响。我们首次通过系统性研究证明，HIV-1的有效复制需要UPR激活达到一个最佳阈值，超过该阈值的UPR诱导或低于该阈值的UPR抑制均不利于HIV-1的复制。本文提供了一套全面的实验方案，用以阐明以往研究中尚未明确的未折叠蛋白反应（UPR）在 HIV-1 复制中的作用。这些方案将为今后从事病毒感染中 UPR 研究的科研人员奠定基础，并有助于应对未来挑战。本研究强调了若干关键点，可供进一步开展机制研究，以阐明在HIV-1感染过程中介导未折叠蛋白反应（UPR）调控的特定病毒蛋白及其他宿主因子的作用。此外，UPR在调控病毒颗粒感染性中的作用也是一个值得深入探索的重要科学问题。 在24孔板中，每孔加入500微升完全DMEM培养基，接种0.1 × 10⁶个TZM-bl细胞，置于细胞培养箱中培养10至12小时。从含有HIV-1病毒的冻存管中取出适量病毒加入各孔，于37°C孵育4小时。用一毫升 PBS 清洗细胞两次，然后在 500 微升 0.25% 戊二醛溶液中固定细胞。将细胞在室温下孵育 5 至 7 分钟。 PBS洗涤后，向细胞中加入500微升新配制的染色液，于37摄氏度避光孵育2至18小时。在显微镜下以10倍物镜随机选取五个视野，计数呈蓝色的感染细胞。将800万个CEM-GFP细胞重悬于1毫升含polybrene的完全RPMI 1640培养基中。加入病毒原液，并用完全培养基补足体积至2毫升。将细胞置于37摄氏度的二氧化碳培养箱中培养4小时，每隔30至45分钟轻轻敲击一次。在37摄氏度下，将等量的细胞接种于6孔培养板中进行培养。每次离心后，每隔24小时收集沉淀细胞的上清液，并向沉淀细胞中加入细胞裂解缓冲液。将100万个未感染的细胞和以0.5感染复数感染HIV-1的CEM-GFP细胞分别用200微升含4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟。以100 ×g离心5分钟，沉淀用500微升0.1摩尔甘氨酸处理5分钟。用PBS洗涤细胞两次，重悬于100微升PBS中，取100微升细胞悬液加入样品腔室。将细胞在细胞离心机中以 1,000 g 离心 4 分钟，使细胞贴附于载玻片上。进行透化处理时，向细胞滴加数滴 0.1% Triton X-100。10 分钟后，逐滴加入 PBS 洗涤细胞。将细胞与 10 微升 5 微摩尔的硫黄素-T（thioflavin-T）孵育 30 分钟，然后加入 5 微升封片介质，并盖上盖玻片。使用 63X 甘油浸没镜头采集固定细胞的共聚焦图像。通过硫黄素-T 染色观察细胞内蛋白聚集体，分析由 HIV-1 感染引起的内质网或内质网（ER）应激。增强的硫黄素-T荧光强度提示蛋白质聚集体增多及内质网应激加剧。 首先，将0.5感染复数的HIV-1感染CEM-GFP细胞在冰上用裂解缓冲液重悬，间歇涡旋振荡45分钟。离心后，将上清液收集至新管中。将等浓度的蛋白样品在Laemmli缓冲液中96摄氏度煮沸5分钟。在10%至12%的SDS-PAGE凝胶上分离样品。将凝胶转移至PVDF膜上。用5% BSA封闭膜1至2小时，然后用TBST洗涤膜两次，并在摇床上于4°C下与特异性一抗孵育过夜。次日，将膜与二抗在摇床上孵育1.5小时。用TBST洗涤后，加入化学发光检测试剂以显影蛋白条带。为分析mRNA表达，制备含有cDNA模板、5微升SYBR Green染料以及每对基因特异性寡核苷酸引物各10皮摩尔的10微升反应体系。将反应体系在实时PCR仪上运行。为了分析XBP-1的剪接情况，将扩增产物在含有每毫升50纳克溴化乙锭的2.5%琼脂糖凝胶中进行分离，并在凝胶成像系统中观察。消化后，在24孔板中将约0.25 × 10⁶个HEK 293T细胞与转染混合物共同接种，并在37°C下孵育6小时。向各孔中加入125微升完全DMEM培养基，重悬细胞以实现均匀接种。24小时后，将原有培养基更换为250微升不完全DMEM培养基。加入 freshly prepared 的第二次转染混合物，孵育 36 小时。离心后，将细胞重悬于市售的荧光素酶底物中。将重悬的细胞裂解液加入不透光的 96 孔板中，孵育 10 至 15 分钟。使用光度计获取荧光素酶读数。在同一份样品中，使用微孔板酶标仪测定GFP荧光，以对荧光素酶读数进行归一化。转染HEK-293T细胞24小时后，向6孔板的每孔中加入1毫升完全DMEM培养基，48小时后收集慢病毒上清液。将200万个Jurkat J6细胞悬浮于含有polybrene的完全RPMI培养基中，加入等体积的对照或基因特异性敲低慢病毒上清液，于6孔板中孵育。24小时后向每孔加入嘌呤霉素，以筛选稳定细胞。每隔24小时离心收集细胞，并加入2毫升含嘌呤霉素的新鲜完全RPMI 1640培养基。将CEM-GFP细胞在37摄氏度下用100纳摩尔的毒胡萝卜素处理12小时。用RPMI 1640培养基洗涤细胞后，以0.5的感染复数感染HIV-1。收集各样本的上清液用于p24 ELISA检测。使用 MTT 法分析了毒胡萝卜素的细胞毒性，在目标浓度下未显示出显著的细胞毒性。通过 HSPA-5 的免疫印迹分析该药物对内质网应激的影响。以 100 纳摩尔毒胡萝卜素预处理 12 小时后，在所有时间点均诱导出 HSPA-5 的表达。P24 酶联免疫吸附试验显示了其对病毒产量的影响。

measuring-endoplasmic-reticulum-stress-unfolded-protein-response-hiv

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

测量 HIV-1 感染的 T 细胞中的内质网应激和未折叠蛋白反应并分析其在 HIV-1 复制中的作用

我们开发了一种慢病毒载体，该载体除了具有Tat响应性LTR外，还含有Rev响应元件（RRE），能够以HIV-1...

利用表达绿色荧光蛋白的Rev依赖型慢病毒载体特异性标记HIV-1阳性细胞

本文介绍了一种利用全内反射荧光（TIRF）显微镜在玻璃支撑的平面双层膜上可视化HIV-1包膜蛋白诱导的病毒学突触形成的方法。该方法还可与免疫荧光染色相结合，用于检测HIV-1包膜蛋白诱导病毒学突触形成过程中信号分子的活化与重新分布。...

在合成脂双层上成像HIV-1包膜诱导的病毒学突触及信号传导

我们开发了一种 体外 用于研究免疫调节通路在HIV特异性CD4...

体外检测免疫调节通路对HIV特异性CD4 T细胞效应功能影响的实验方法

与无细胞的HIV-1病毒颗粒不同，受感染的CD4+...

评估HIV-1感染的CD4细胞的天然感知能力+ 使用浆细胞样树突状细胞的T细胞 离体 共培养系统

本文描述了评估靶向HIV-1复制周期整合后步骤的RNA分子有效性和毒性的方法。这些方法可用于筛选新分子以及优化现有分子的结构形式。...

评估靶向HIV-1产生的RNA在基因或药物治疗中的有效性和毒性

本报告描述了一种 体外 用于测定急性感染细胞胞质提取物中人免疫缺陷病毒1型（HIV-1）前整合复合物（PIC）相关整合活性的检测方法。通过巢式实时定量聚合酶链式反应策略，定量分析PIC相关HIV-1 DNA整合至异源靶DNA的过程。...

测量 体外 HIV-1前整合复合物的整合活性

本文描述了一种在单细胞水平上对外周血单个细胞（ex vivo）同时定量96个基因和18种表面蛋白表达水平的方法，可用于鉴定病毒感染细胞与未感染细胞之间差异表达的基因和蛋白。我们应用该方法研究从中国台湾恒河猴中分离的SIV感染的CD4+...

从恒河猴中分离的猴免疫缺陷病毒感染的 CD4+ T 细胞中 mRNA 和表面蛋白表达的单细胞定量分析

本文介绍一种深度测序方法，可无偏倚地确定新生3'末端以及单链DNA分子的突变谱型。该方法的主要应用是表征新生逆转录病毒互补DNA（cDNA），即逆转录病毒逆转录过程中产生的中间产物。...

确定感染细胞中HIV-1逆转录过程中新生单链病毒DNA的3'-末端及其序列

本文介绍了在HIV-1复制存在的情况下进行Rev蛋白免疫沉淀以用于质谱分析的方法。所述方法可用于鉴定参与HIV-1感染周期的核仁因子，并适用于其他疾病模型中对尚未充分研究的通路进行表征。...

通过Rev免疫共沉淀与质谱技术鉴定HIV-1复制过程中的核仁因子

本文介绍了一种在纳米流体装置上对单个细胞进行监测以研究急性事件及有效的HIV-1感染的实验方案。成像数据可明确病毒与宿主受体之间的相互作用以及信号通路的动力学变化。这是首个用于高通量、纵向单细胞培养与成像的纳米流体技术方法，可用于研究信号动力学和分子相互作用。...

基于多参数光流控平台的单细胞钙离子内流与HIV-1感染表征

了解HIV-1感染T细胞中内质网应激与未折叠蛋白反应的检测方法，探索UPR激活阈值对病毒复制的影响机制。该方案为研究宿主-病原体相互作用提供重要基础。

测量HIV-1感染T细胞中的内质网应激与未折叠蛋白反应及其在HIV-1复制中的作用分析

探索更多视频