测量HIV-1感染T细胞中的内质网应激与未折叠蛋白反应及其在HIV-1复制中的作用分析

我们的研究重点是宿主与病原体之间的相互作用，特别关注在HIV-1感染过程中未折叠蛋白反应通路的调控机制。本研究探讨了HIV-1感染如何改变内质网应激和UPR激活标志物，以及这些变化对T细胞中病毒复制和感染能力的影响。我们首次通过系统性研究证明，HIV-1的有效复制需要UPR激活达到一个最佳阈值，超过该阈值的UPR诱导或低于该阈值的抑制均不利于HIV-1的复制。

本文提供了一套全面的实验方案，以阐明以往研究中尚未明确的未折叠蛋白反应（UPR）在HIV-1复制中的作用。这些方案将为今后从事病毒感染中UPR相关研究的科研人员奠定基础，并有助于应对未来挑战。我们的研究强调了若干关键点，为深入开展机制性研究提供了方向，以进一步明确在HIV-1感染过程中介导UPR调控的特定病毒蛋白及其他宿主因子的作用。

此外，UPR 在调控病毒颗粒感染性方面的参与可能是另一个有待解决的有趣问题。首先，在24孔板中，每孔加入500微升完全DMEM培养基，接种0.1 × 10⁶个 TZM-bl 细胞，然后将细胞置于细胞培养孵育箱中培养10至12小时。从含有HIV-1病毒的冻存管中取出适量病毒加入孔中，于37摄氏度孵育4小时。

固定细胞前，用一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次，然后将细胞置于500微升0.25%戊二醛溶液中。室温下孵育5至7分钟。PBS洗涤后，向细胞中加入500微升新鲜配制的染色液，37摄氏度避光孵育2至18小时。

在10倍显微镜下，随机选取五个视野计数蓝色感染细胞。将800万个CEM-GFP细胞重悬于1毫升含polybrene的完全RPMI 1640培养基中。加入病毒原液，并用完全培养基补至终体积2毫升。

将细胞置于37摄氏度的二氧化碳培养箱中培养4小时，每隔30至45分钟轻轻敲击一次。在37摄氏度下，将等量细胞接种于6孔培养板中进行培养。每次离心后，每隔24小时收集细胞沉淀的上清液，并向细胞沉淀中加入细胞裂解缓冲液。

将100万个未感染的细胞和以0.5感染复数感染的HIV-1 CEM-GFP细胞分别用200微升含4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟。以100 × g离心5分钟，随后用500微升0.1摩尔的甘氨酸处理细胞片5分钟。用PBS洗涤细胞两次，重悬于100微升PBS中，取100微升细胞悬液加入样品腔室中。

将细胞在细胞离心机中以1,000 G离心4分钟，使细胞贴附于载玻片上。进行透化处理时，向细胞中滴加数滴0.1% Triton X-100。10分钟后，逐滴加入PBS洗涤细胞。

将细胞与10微升5微摩尔的硫黄素T共同孵育30分钟，然后加入5微升封片介质并加盖盖玻片。使用63X甘油浸没物镜采集固定细胞的共聚焦图像。通过硫黄素T染色观察细胞内蛋白聚集体，分析由HIV-1感染引起的内质网（ER）应激。

硫磺素T荧光强度增强表明蛋白质聚集物增多以及内质网应激增加。首先，将0.5感染复数的HIV-1感染CEM-GFP细胞在冰上用裂解缓冲液重悬，间歇性涡旋振荡45分钟。离心后，将上清液收集至新管中。

将等浓度的蛋白质样品在Laemmli缓冲液中96摄氏度煮沸5分钟。在10%至12%的SDS-PAGE凝胶上分离样品。将凝胶中的蛋白质转移至PVDF膜上。

用5% BSA封闭膜1至2小时，然后用TBST洗涤膜两次，再在摇床上加入特异性一抗，4摄氏度孵育过夜。次日，在摇床上加入二抗孵育1.5小时。用TBST洗涤后，加入化学发光检测试剂以显影蛋白条带。

为分析mRNA表达，制备含有cDNA模板、5微升SYBR Green染料以及每对基因特异性寡核苷酸引物各10皮摩尔的10微升反应体系。将反应体系在实时PCR仪上运行。为分析XBP-1的剪接情况，将扩增产物在含有每毫升50纳克溴化乙锭的2.5%琼脂糖凝胶中电泳分离，并在凝胶成像系统中观察结果。

胰酶消化后，将约 0.25 × 10⁶ 个 HEK 293T 细胞与转染混合物接种至 24 孔板中，在 37°C 下孵育 6 小时。向各孔中加入 125 µL 完全 DMEM 培养基，重悬细胞以实现均匀接种。24 小时后，将原有培养基更换为 250 µL 不完全 DMEM 培养基。

加入 freshly prepared 的第二次转染混合物，孵育 36 小时。离心后，用市售的荧光素酶底物重悬细胞。将重悬的细胞裂解液加入不透光的 96 孔板中，孵育 10 至 15 分钟。

使用光度计获取荧光素酶读数。在同一份样品中，使用微孔板酶标仪测定GFP荧光，以对荧光素酶读数进行归一化。转染HEK-293T细胞24小时后，向6孔板的每孔中加入1毫升完全DMEM培养基，48小时后收集慢病毒上清液。

将200万个Jurkat J6细胞悬浮于含有polybrene的完全RPMI培养基中，加入等体积的对照组和基因特异性敲低慢病毒上清液，于6孔板中孵育。24小时后向每孔加入嘌呤霉素，以筛选稳定细胞株。每隔24小时离心收集细胞，并加入2毫升含嘌呤霉素的新鲜完全RPMI 1640培养基。

将CEM-GFP细胞在37摄氏度下用100纳摩尔的毒胡萝卜素处理12小时。用RPMI 1640培养基洗涤细胞后，以0.5的感染复数感染HIV-1。收集各样本的上清液用于p24 ELISA检测。

使用NTT检测分析了毒胡萝卜素的细胞毒性，在目标浓度下其细胞毒性无显著性。通过HSPA5的免疫印迹分析该药物对内质网应激的影响。以100纳摩尔毒胡萝卜素预处理12小时，可在所有时间点诱导HSPA5的表达。

P24 ELISA 检测显示了对病毒产生的影响。