Name: 开发大鼠临床相关的出血性休克模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 了解大鼠失血性休克模型的标准化手术方法，包括颈静脉和股动脉插管、控制性放血及血流动力学监测。该模型有助于研究休克病理生理机制并促进临床研究标准化。

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本工作由法国巴黎的&#34;Société Française d'Anesthésie et de Réanimation&#34;、法国南特的&#34;Fondation d'entreprises Genavie&#34;、法国的&#34;Fédération française de cardiologie&#34;、法国巴黎的&#34;Agence nationale de la recherche&#34;（项目编号：20-ASTC-0032-01-hErOiSmE）以及法国巴黎的&#34;Direction Générale de l'Armement&#34;资助。Thomas Dupas 在攻读博士学位期间获得了法国 Direction Générale de l'Armement（DGA）和卢瓦尔河地区大区政府的资助。Antoine Persello 在攻读博士学位期间获得了法国 InFlectis BioScience 公司的资助。我们感谢法国巴黎的&#34;Agence Nationale de la Recherche&#34;、法国巴黎的&#34;Direction Générale de l'Armement&#34;以及法国的&#34;Sauve ton coeur&#34;协会对本研究提供的支持。我们感谢 UTE IRS-UN 核心设施（SFR Bonamy，南特大学，法国南特）和 IBISA 核心设施 Therassay（法国南特）在技术协助与支持方面的贡献。

所有操作均经地区伦理委员会批准，并按照欧盟指令 2010/63/EU 的规定执行（批准号：#17858 和 #32499，法国卢瓦尔地区实验动物伦理委员会，CEEA-Pays de la Loire），符合现行 ARRIVE 指南以及美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》（NIH 出版物编号 85-23，2011 年修订版）的要求。
1. 大鼠的伦理状态与一般信息
<ol>
	<li>雄性Wistar Han大鼠（Charles River，Saint-Germain-Nuelles，法国）于10周龄时被运送至实验治疗单元。将大鼠在标准温度（21–24 °C）、湿度（40%–60%）、12小时光照/黑暗循环，光照期从上午07:30开始</li>
	<li>提供食物和水 随意摄取使用体重为300-400 g的11-13周龄大鼠进行该方案。</li>
</ol>
2. 房间设置与准备步骤
<ol>
	<li>开启麻醉机，将加热垫设置为 37.5 °C，并用非无菌布单覆盖。</li>
	<li>对本实验方案所需的手术器械进行灭菌：无损伤镊（DeBakey 镊）（1 把）、精细锐利剪刀或手术刀（1 把）、标准持针钳（2 把）、持针器（1 把）、Vannas 显微解剖剪（1 把）、止血钳（1 把）。</li>
	<li>准备颈静脉和股动脉导管。
	<ol>
		<li>对于颈静脉导管，将聚乙烯管（PE50）套在已剪去针尖的 23 G 针头上。</li>
		<li>对于股动脉导管，使用步骤 2.3.1 中所述的导管，并在 PE50 管末端连接一段 PE10 管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用含 100 UI/mL 肝素的乳酸林格氏液充满股动脉和颈静脉导管及压力传感器。在导管和压力传感器末端连接一支含有含 100 UI/mL 肝素的乳酸林格氏液的 2 mL 注射器。注意避免产生气泡，以免造成信号干扰。</li>
	<li>启动与压力传感器配套的软件，并根据供应商说明进行校准。</li>
</ol>
3. 大鼠手术前准备
<ol>
	<li>使用诱导麻醉箱对大鼠进行麻醉（参数：七氟烷 8%，气流流速：1 L/min）。通过足底反射检查麻醉深度后，以七氟烷 4%、气流流速 0.6 L/min 维持麻醉。术前避免使用镇痛药，因为这些分子具有血液动力学效应。 
	注意：从这一步开始，每 20 分钟通过足底反射评估一次麻醉深度。</li>
	<li>称量大鼠体重，将其仰卧位放置于加热垫上，并在腹股沟和颈部区域脱毛。</li>
	<li>使用非无菌纱布垫交替涂抹 10% 和 4% 聚维酮碘溶液对脱毛区域进行消毒（每种溶液各三次）。</li>
	<li>在动物眼睛上涂抹一滴眼用软膏，以防止角膜干燥。</li>
	<li>将大鼠仰卧位放置于手术台的加热垫上，插入润滑过的直肠探头以监测体温。以七氟烷 4%、气流流速 0.6 L/min 维持麻醉。</li>
	<li>更换为无菌手套，将无菌手术巾覆盖于大鼠体表，并在腹股沟和颈部区域剪开手术巾。</li>
</ol>
4. 颈静脉插管
<ol>
	<li>通过可见的搏动，在右下颈部锁骨上方区域定位颈静脉。使用DeBakey无创镊子轻轻夹住皮肤，然后用精细的锐利剪刀或手术刀进行精确切口。</li>
	<li>在切口处滴加一滴局部麻醉剂（2%利多卡因）。用标准纹镊轻轻切开组织。</li>
	<li>找到颈静脉，并用标准纹镊将其从肌肉包膜中轻轻分离。取一根4/0丝线缝合线，牢固结扎远端（朝向头部一侧）。使用持针器夹住缝线以牵拉并固定颈静脉。</li>
	<li>在近端（朝向心脏一侧）放置另一根4/0缝线，打外科结但暂不收紧。使用Vannas显微解剖剪在颈静脉上做一个小切口。</li>
	<li>用小镊子小心夹住静脉壁后，手动或借助标准纹镊将PE50导管插入颈静脉。此步骤中，使用无菌纱布擦拭可能从静脉渗出的血滴。</li>
	<li>将导管向前推进约0.5 cm，并通过回抽少量血液再推注入管内的方式确认导管位置正确（导管内出现血液表明其位于静脉中）。收紧先前准备好的结，以固定导管。</li>
	<li>将导管留置原位，并连接预先充满乳酸林格液的注射器，用湿润的无菌纱布覆盖切口区域。</li>
</ol>
5. 股动脉插管
<ol>
	<li>使用 DeBakey 无创镊夹住左腿 Scarp a三角区的皮肤，用精细锐利的剪刀或手术刀进行切口。在切口区域滴加一滴局部麻醉剂（利多卡因 2%）。用标准纹镊轻轻撕裂组织。</li>
	<li>定位股三角（动脉、静脉和神经）。将一把镊子从股三角下方穿过，使用第二把标准纹镊非常轻柔地将动脉与神经及股静脉分离。 
	注意：动脉较小，呈粉红色且有搏动。此步骤至关重要；静脉和动脉脆弱，容易破裂。</li>
	<li>在远端（腿部侧）放置 4/0 缝线并结扎股动脉。用持针器夹住缝线，对股动脉施加张力。在近端（心脏侧）放置另一根 4/0 缝线，打结但暂不收紧。用动脉夹夹闭动脉（夹闭位置位于近端缝线的上游）。</li>
	<li>使用 Vannas 显微解剖剪横向切开股动脉（应有少量血液流出）。用标准纹镊轻轻夹住动脉壁，用导管（末端为 PE10）进行股动脉插管，并用镊子固定导管。</li>
	<li>轻柔松开动脉夹，检查是否有渗漏，然后检查压力信号（确认导管位于股动脉内），并观察血液是否回流至导管内（提示瓣膜或压力换能器存在泄漏）。</li>
	<li>若信号良好（预期值：收缩压 120 mmHg，舒张压 80 mmHg）且无渗漏迹象，则将导管略微前推（0.5 cm），并收紧先前准备好的外科结。</li>
	<li>按 100 UI/kg 剂量给予动物肝素化处理，并在切口区域覆盖湿润的无菌纱布。术后以 0.6 L/min 的气流速度维持 3% 七氟烷麻醉。</li>
</ol>
6. 失血性休克方案（图 1）
<ol>
	<li>第一阶段：稳定期（5 分钟）。
	<ol>
		<li>肝素化后，等待 10 分钟使压力值稳定。记录 5 分钟以获取基础血流动力学数值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第二阶段：放血期（5 分钟）： 
	注意：此阶段对应模型的固定体积阶段。
	<ol>
		<li>使用 1 mL 注射器从股动脉在 5 分钟内抽取 5 mL 血液（500 µL/30 秒）（预期值：收缩压：45 mmHg，舒张压：30 mmHg）。</li>
		<li>在室温下配制 50% 乳酸林格液与 50% 收集血液的混合液。将混合液装入 2 mL 注射器，并连接至颈静脉插管末端。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第三阶段：失血性休克期（75 分钟） 
	注意：此阶段为模型的固定压力阶段。
	<ol>
		<li>维持平均动脉压在 35 mmHg 左右。当平均动脉压大于或等于 38 mmHg 时，通过股动脉抽出 200 µL 血液（n = 12 只大鼠的平均值：10.2 mL）。</li>
		<li>若平均动脉压低于 32 mmHg，则通过颈静脉注射 200 µL 的 50% 血液与 50% 乳酸林格液混合液（n = 12 只大鼠的平均值：0.90 mL）。</li>
		<li>在失血性休克阶段结束时，用无菌纱布处理大鼠尾部后，使用针尖（26 G）采集尾尖血滴，测定外周血乳酸水平。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第四阶段：静脉液体复苏（20 分钟）
	<ol>
		<li>通过颈静脉导管使用注射泵，在 20 分钟内以 10 mL/kg 的剂量复苏乳酸林格液（室温），流速为 10.5 mL/h（适用于 350 g 大鼠），使用 20 mL 注射器进行输注。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 手术结束及术后恢复与随访
<ol>
	<li>夹闭颈静脉和股动脉，移除导管，结扎血管。仔细检查确认无血液渗漏。</li>
	<li>在切口处滴加一滴局部麻醉剂。使用5-0无菌缝线通过皮下缝合和皮肤缝合关闭切口。用10%聚维酮碘溶液消毒。</li>
	<li>使用1 mL注射器配26 G针头，皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg，0.3 mL/kg）。</li>
	<li>在监测体温的同时等待大鼠从麻醉中苏醒。当出现苏醒迹象（如触须活动、足部运动）时，移除直肠探头，并将大鼠置于铺有加热垫的笼内。10分钟后，将大鼠送回饲养室。</li>
	<li>每8小时皮下注射一次布托啡诺（0.05 mg/kg，0.3 mL/kg）。</li>
	<li>在失血性休克诱导后16小时，评估呼吸频率、行为、体温和血乳酸水平，具体方法见步骤6.3。</li>
</ol>
<img alt="出血性休克过程示意图；平均动脉压；血流动力学监测；恢复阶段。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66523/66523fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：混合型大鼠出血性休克模型。 使用 BioRender.com 创建 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66523/66523fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
8. 诱导出血性休克后 24 小时
<ol>
	<li>按照步骤3.1所述方法对动物进行麻醉。将动物置于手术台上，并按照步骤3.5所述插入直肠探针。按照步骤2.3和2.4中针对颈静脉的操作方法，准备用于颈动脉插管的导管。</li>
	<li>使用DeBakey无创镊夹住皮肤，用精细锋利的剪刀或手术刀在颈部中线处做一切口。滴加一滴局部麻醉剂（利多卡因2%）。</li>
	<li>用标准纹式镊轻柔分离组织。分开唾液腺后，切开气管肌层以暴露气管环。</li>
	<li>游离左侧颈动脉，用标准纹式镊将其与神经分离（此过程中动物呼吸很可能加快）。用4/0丝线在远端（头部侧）结扎颈动脉。</li>
	<li>在近端（心脏侧）预先放置一根缝合线并打一个外科结但暂不收紧。夹闭动脉（夹子置于近端缝合线的上游位置）。</li>
	<li>使用Vannas显微解剖剪剪开颈动脉（应有少量血液流出）。用标准纹式镊轻轻夹住动脉壁以扩大切口，随后用准备好的导管进行插管，并用镊子固定导管。</li>
	<li>松开夹闭夹，观察压力信号以确认导管位置是否正确，并检查是否有血液回流进入导管（提示瓣膜或压力传感器存在泄漏）。</li>
	<li>若信号良好且无泄漏，可将导管再推进约0.5 cm，然后收紧并固定先前准备好的外科结。</li>
	<li>按100 UI/kg剂量给予肝素化处理，并在切口处覆盖湿润的无菌敷料。</li>
	<li>术后维持麻醉，使用3%七氟烷，气流速率为0.6 L/min。</li>
	<li>等待10分钟后记录24小时的血流动力学数值（预期值：收缩压120 mmHg，舒张压60 mmHg）。</li>
	<li>为评估器官损伤的血浆标志物，从颈动脉采集1 mL血液，以1600 × g 离心10分钟。分装血浆并保存以备后续分析。</li>
	<li>在24小时血流动力学参数测量完成后立即处死大鼠并采集血液。 
	注意：安乐死方法应根据后续需采集的特定参数或样本进行调整。假手术组仅接受手术操作（第1–5、7和8节），不实施失血性休克程序（第6节）。动物由实验人员随机分配至假手术组和失血性休克组。在整个实验的不同阶段，仅实验人员知晓分组情况。</li>
</ol>

Vascular Cannulation with Hemorrhagic Shock Induction in Rats

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作者声明，他们不存在任何已知的可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。支持本研究发现的数据可向通讯作者在合理请求下获取。

本文首次描述了一种基于固定压力与固定容积模型相结合的代表性大鼠出血性休克模型。我们证明，在休克诱导后24小时，该模型与血流动力学参数及代谢的改变相关。
由于其复杂的病理生理机制，对失血性休克的研究需要采用整合的动物模型。事实上，体外（in vitro）方法无法模拟该疾病所涉及的所有通路。在完成失血性休克实验方案后将动物复苏，是确保更真实地复制临床情况的重要步骤。然而由于动物复苏操作难度较大，极少有研究包含这一阶段。少数实施动物复苏的研究通常在较短时间点（2 小时或 6 小时）即处死动物，这并不能充分反映患者的实际病理过程16,18,23,24。尽管已建立了多种失血性休克模型，但仅有少数研究评估了休克诱导后 24 小时的各类参数（如炎症反应、细胞凋亡、器官功能障碍），这凸显了此类实验方案的技术难度25,26,27。计算机与数学模型的发展已彻底改变了相关研究格局。目前已有大量失血性休克的数学模型被提出，但大多数模型未能充分纳入失血性休克期间机体液体交换的全部过程，仍需进一步改进才能具备潜在的临床应用价值28。迄今为止，该领域的主要挑战之一是建立一种尽可能接近人类病理特征的动物模型。
文献中描述了大量失血性休克模型，这些模型在血管通路、放血量或目标血压方面存在差异via血管途径、采血体积或目标压力13。总体而言，失血性休克模型可分为三类：固定容积放血模型、固定压力放血模型和非控制性出血模型。固定容积放血模型的标准化和可重复性较差，其原因在于血容量与体重的比值随大鼠体重增加呈线性下降。固定压力放血模型虽被广泛使用，但各研究之间实验条件（如目标压力、休克持续时间）差异较大，导致不同模型间的研究结果难以相互转化。此外，值得注意的是，血流动力学障碍在失血性休克的病理生理过程中起关键作用，但并未在所有研究中被系统评估，这可能进一步加剧不同研究结果之间的差异。最后，尽管非控制性出血模型具有较高的临床相关性，但在可重复性和伦理方面仍存在争议。为了尽可能兼顾临床相关性、标准化和可重复性，我们建立了一种结合固定容积和固定压力两个阶段的混合模型。
在本研究所描述的模型中，术后24小时体温和呼吸频率未发生改变。这可能归因于手术在无菌条件下进行，从而限制了促炎反应的发生。失血性休克被定义为由于失血导致血压下降而引起的急性循环衰竭。与人类相似，该失血性休克模型会引起平均动脉压的降低，这主要归因于舒张压的下降。有趣的是，正如先前研究所描述的，在该失血性休克模型中，复苏阶段结束后心率保持不变29,30,31。平均动脉压的下降可能与器官灌注减少有关，进而导致多脏器功能障碍，这一点可通过本模型中多种血浆标志物的升高得以证实（包括肌酐水平、心肌肌钙蛋白T、天冬氨酸转氨酶[ASAT]和丙氨酸转氨酶[ALAT]）。氧供中断导致机体转为无氧代谢，从而引起乳酸水平升高32。正如先前报道，该失血性休克模型会导致血液乳酸水平上升30。这种升高可能与股动脉水平发生的缺血有关。然而，考虑到假手术组动物经历了与失血性休克组相同的手术操作，但其乳酸水平仍维持在生理范围内，因此该乳酸升高似乎与失血性休克方案本身相关。综上所述，这些数据共同证实，本研究中所描述的实验方案能够在大鼠中成功建立一种新的、具有相关性的失血性休克模型。
该模型的局限性在于使用了肝素，而肝素在血液接触套管等塑料材料时，对于减少血液自然凝固至关重要。然而，肝素的使用可能影响与创伤性失血性休克相关的凝血功能障碍33。本研究采用的是11至13周龄的健康雄性动物。考虑到性别、年龄以及合并症（如高血压、糖尿病等）可能影响实验结果，评估这些因素在本模型中的影响具有重要意义。在本方案中，复苏步骤通过注射乳酸林格液（一种晶体液）进行，而晶体液可能促进凝血功能障碍和组织水肿34。尽管使用血液制品是最佳选择，但其来源稀缺且易变质，难以在整个实验过程中储备足够的大鼠血液。基于血液制品的复苏模型与基于晶体液/胶体液的复苏模型是两种互补的研究失血性休克的方法。
该模型的优点包括：1）高度可重复性（结果变异度低可证明）；2）操作简便（大多数仪器为常规设备，且血管操作方法已为人熟知）；3）具有临床相关性，尤其是由于动物苏醒后出现多脏器功能障碍。根据补充文件1中描述的行为评分，已设定临界值。若评分超过9分，将考虑实施安乐死（参见附表）；若评分达到11分，则系统性实施动物安乐死。在本研究中，所有动物评分均未超过8分，因此无一例被排除出研究。这可能解释了为何本研究所描述的模型相关死亡率比其他24小时研究低3倍（16% vs. 47%）25。
该模型的关键步骤是出血性休克阶段。必须严格维持32–38 mmHg的压力范围。事实上，我们观察到，若平均动脉压低于32 mmHg，血压会迅速且急剧地下降；相反，若维持高于38 mmHg的压力，则无法充分接近临床实际情况。这些观察结果与其他模型中设定的平均动脉压目标区间一致13。
综上所述，我们证明了本研究中详细描述的大鼠出血性休克模型具有临床相关性，该模型不仅有助于通过识别新的生物学因子或通路来理解病理生理机制，还可通过测试不同的候选分子来发现新的治疗策略。

失血性休克（HS）是一种以大量失血导致组织缺氧为特征的休克状态。HS 是一种复杂的病理过程，伴随血流动力学和代谢改变，以及促炎和抗炎反应。全球每年约有 190 万人的死亡归因于出血及其后果1。目前的治疗指南主要采用静脉输液（可辅以或不辅以血管活性分子）和氧疗。然而，这些治疗仅为对症处理，可能无效，因此 HS 相关的死亡率仍然较高2。这凸显了识别新的分子和细胞机制，进而开发降低死亡率的新疗法的重要性。
动物模型有助于解析疾病中涉及的病理生理机制，并测试新的治疗策略。文献中存在多种出血性休克的动物模型。这些模型不仅在所使用的物种上有所不同，而且在诱导休克的方法上也存在差异（例如，固定压力法与固定容量法）（表1，表2）3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13。此外，同一类型模型内部的实验方案也存在差异（例如，放血时间、目标平均动脉压）（表3）14,15,16,17,18,19,20。鉴于现有出血性休克模型种类繁多，且临床情况的复制具有复杂性，该疾病的临床前研究仍受到限制。开发一种可重复、可标准化且易于实施的出血性休克模型符合各方利益。这将有助于不同研究之间的比较，从而揭示出血性休克复杂的病理生理机制。本实验方案的目的是建立一种具有临床相关性的新型大鼠出血性休克模型，该模型包括两个连续的固定容量放血阶段，随后进入一个固定的低血压阶段。
表1：用作失血性休克模型的物种3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66523/Table 1.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2：不同类型的出血性休克13。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66523/Table 2.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表3：通过固定压力方案诱导大鼠出血性休克的实验模型多样性的示例。 不同出血性休克实验模型的参数汇总。红色显示的血管为动脉，蓝色显示的血管为静脉。复苏时，以采血量作为参考（血液：以与休克期间采血量相等的体积进行复苏；x2：以采血量两倍的体积进行复苏；x4：以采血量四倍的体积进行复苏）。MAP：平均动脉压；RL：乳酸林格液14,15,16,17,18,19,20。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66523/Table 3.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

<table><tbody><tr><td>1 mL 注射器</td><td>TERUMO</td><td>MDSS01SE</td><td></td></tr><tr><td>2.5 mL 注射器</td><td>TERUMO</td><td>SS*02SE1</td><td></td></tr><tr><td>20 mL 注射器</td><td>TERUMO</td><td>MDSS20ESE</td><td></td></tr><tr><td>麻醉诱导室</td><td>TEMSEGA</td><td>HUBBIV4</td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 3 23 G 针头</td><td>Becton Dickinson</td><td>300800</td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 3 26 G 针头</td><td>Becton Dickinson</td><td>304300</td><td></td></tr><tr><td>血压换能器</td><td>emka TECHNOLOGIES</td><td>BP_T</td><td></td></tr><tr><td>Buprecare</td><td>Axience</td><td>N/A</td><td>1 mL 小瓶，每毫升含丁丙诺啡 0.3 mg</td></tr><tr><td>DE BAKEY 无创血管钳</td><td>ALLGAIER instrumente medical</td><td>09-543-150</td><td></td></tr><tr><td>皮肤用聚维酮碘 10%</td><td>Mylan</td><td>N/A</td><td>125 mL 瓶装</td></tr><tr><td>精细镊子 — 弯型/带齿</td><td>Fine Science Tools</td><td>11065-07</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8</td><td>GraphPad by Dotmatics</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>TEMSEGA</td><td>OPT/THERM_MATELASSTEREORATS</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠</td><td>PANPHARMA&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>5 mL 瓶装，每毫升含 5,000 UI</td></tr><tr><td>IOX2 软件</td><td>emka TECHNOLOGIES</td><td>IOX_BASE_4c + IOX_FULLCARDIO_4a</td><td></td></tr><tr><td>虹膜剪刀 — ToughCut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>利多卡因</td><td>Fresenius</td><td>N/A</td><td>10 mL 瓶装，含 8.11 mg 盐酸利多卡因</td></tr><tr><td>MiniHub-V3.2</td><td>TEMSEGA</td><td>PF006</td><td></td></tr><tr><td>Moria 201/A 血管夹 — 直型</td><td>Fine Science Tools</td><td>18320-11</td><td></td></tr><tr><td>非无菌敷料</td><td>Raffin</td><td>70189</td><td></td></tr><tr><td>非无菌手术单</td><td>Dutscher&amp;nbsp;</td><td>30786</td><td></td></tr><tr><td>Olsen-Hegar 带剪持针器&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯导管 PE10</td><td>PHYMEP</td><td>BTPE-10</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯导管 PE50</td><td>PHYMEP</td><td>BTPE-50</td><td></td></tr><tr><td>大鼠</td><td>Charles Rivers</td><td>-</td><td>雄性 WISTAR HAN（10 周龄）</td></tr><tr><td>直肠探头</td><td>TEMSEGA</td><td>SONDE_TEMP_RATS</td><td></td></tr><tr><td>乳酸林格液</td><td>Fresenius Kabi</td><td>964175</td><td></td></tr><tr><td>清洗用聚维酮碘 4%</td><td>Mylan</td><td>N/A</td><td>125 mL 瓶装</td></tr><tr><td>七氟烷</td><td>Abbott</td><td>N/A</td><td>250 mL 瓶装，100% 气体</td></tr><tr><td>七氟烷蒸发器</td><td>TEMSEGA</td><td>SEVOTEC3NSELEC</td><td></td></tr><tr><td>StatStrip 乳酸检测试纸条</td><td>Nova Biomedical</td><td>47486</td><td></td></tr><tr><td>StatStrip Xpress 乳酸分析仪</td><td>Nova Biomedical</td><td>47486</td><td></td></tr><tr><td>无菌敷料</td><td>Laboratoire SYLAMED</td><td>211S05-50</td><td></td></tr><tr><td>无菌手术单</td><td>M&amp;ouml;lnlycke</td><td>800330</td><td></td></tr><tr><td>无菌手套</td><td>MEDLINE</td><td>MSG7275</td><td></td></tr><tr><td>缝合线</td><td>Optilene</td><td>3097141</td><td></td></tr><tr><td>血管缝合线</td><td>SMI</td><td>8150046</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Vial m&amp;eacute;dical</td><td>16010</td><td></td></tr><tr><td>usbAMP</td><td>emka TECHNOLOGIES</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>凡士林</td><td>Cooper</td><td>N/A</td><td>10 mL 小瓶</td></tr><tr><td>维生素A软膏（ALLERGAN）</td><td>Allergan</td><td>N/A</td><td>10 g 软膏管，含视黄醇</td></tr></tbody></table>

开发一种临床相关的 rats 出血性休克模型

Developing a Clinically Relevant Hemorrhagic Shock Model in Rats

近年来，动物模型的开发使我们能够更好地理解各种病理过程，并发现新的治疗方法。失血性休克，即由于大量血液迅速丢失导致的器官功能衰竭，其病理生理机制极为复杂，涉及多个通路。目前已有的多种失血性休克动物模型致力于模拟人类中的实际情况，但这些模型在临床相关性、可重复性或标准化方面均存在局限性。本研究旨在优化现有模型，以建立一种新的失血性休克模型。简言之，通过控制性放血诱导雄性Wistar Han大鼠（11至13周龄）发生失血性休克，导致平均动脉压下降。随后的75分钟阶段维持较低的平均动脉压（介于32 mmHg至38 mmHg之间），以激活失血性休克的病理生理通路。实验方案的最后阶段模拟临床救治过程，通过静脉输注乳酸林格液以提升血压。在实验开始后16小时评估乳酸水平和行为学评分，而在损伤后24小时检测血流动力学参数及血浆生物标志物。失血性休克诱导24小时后，失血性休克组的平均动脉压和舒张压均显著降低（p &#60; 0.05），心率和收缩压则无明显变化。所有器官损伤标志物在失血性休克组中均升高（p &#60; 0.05）。与假手术组相比，失血性休克组的血乳酸水平和行为学评分也显著升高（p < 0.05）。综上所述，我们证明了本研究所描述的实验方案是一种具有临床相关性的失血性休克模型，可用于后续研究，特别是用于评估新分子的治疗潜力。

按照上述方案，在诱导出血性休克后24小时，我们评估了多项血流动力学参数。假手术组与出血性休克组在休克诱导前的基础平均动脉压相似（图2A）。如预期所示，出血性休克方案导致平均动脉压显著降低，这可由舒张压的下降来解释（平均动脉压：假手术组：92 mmHg ± 3 mmHg；出血性休克组：82 mmHg ± 2 mmHg；舒张压：假手术组：73 mmHg ± 3 mmHg；出血性休克组：61 mmHg ± 2 mmHg）（图2B、C）。出血性休克对收缩压、脉压和心率无显著影响（图2D–F）。休克指数（心率/收缩压比值）和改良休克指数（MSI，心率/平均动脉压比值）是重症患者死亡率的两个预测指标14，15。数值越高，死亡风险越大。在本模型中，两组间的休克指数无显著差异，而改良休克指数在出血性休克组有升高趋势（MSI：假手术组：4.24 ± 0.11；出血性休克组：4.70 ± 0.15）（图2G、H）。
<img alt="失血性休克研究；柱状图比较血压、心率、休克指数等指标。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66523/66523fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：失血性休克对血流动力学参数的影响。(A) 基础平均动脉压，(B) 平均动脉压，(C) 舒张压，(D) 收缩压，(E) 脉压，(F) 心率，(G) 休克指数，以及 (H) 假手术组与失血性休克动物组之间的改良休克指数。结果以均值 ± 标准误表示。采用非配对t检验评估统计学显著性。*：p &lt; 0.05；***：p &lt; 0.001。n = 6–12。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66523/66523fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
失血性休克期间的全身代谢功能障碍可通过乳酸血症进行评估。正如预期，乳酸血症在实施失血性休克方案后以及16小时后均升高（实验终点：假手术组：1.13 mmol/L ± 0.14 mmol/L；休克组：5.98 mmol/L ± 0.39 mmol/L；休克后16小时：假手术组：1.95 mmol/L ± 0.23 mmol/L；休克组：2.95 mmol/L ± 0.19 mmol/L）（图3A，B）。体温和呼吸频率是全身炎症反应综合征（SIRS）的两个组成部分，SIRS是一种以休克状态为特征的促炎性反应。在诱导失血性休克后16小时，两组之间的体温和呼吸频率均无显著变化（图3C，D）。我们评估了失血性休克对若干行为学参数（如姿势、活动度等）的影响（补充文件1）。在实验方案实施16小时后，失血性休克组的行为评分显著升高（假手术组：0.33 ± 0.21；休克组：2.27 ± 0.69）（图3E）。
<img alt="乳酸血症、体温、呼吸频率、行为评分图；失血性休克研究结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66523/66523fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：失血性休克对乳酸血症、体温、呼吸频率和行为评分的影响。（A）失血性休克实验方案结束时的乳酸血症，（B）乳酸血症，（C）体温，（D）呼吸频率，以及（E）假手术组与失血性休克动物组在诱导失血性休克后16小时的行为评分。结果以均值±标准误表示。采用非配对t检验评估统计学显著性。*：p &lt; 0.05；**：p &lt; 0.01；***：p &lt; 0.001。n = 6–12。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66523/66523fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
失血性休克与器官功能障碍相关。为了评估该模型是否具有临床相关性，我们在实验方案实施后24小时检测了血浆中反映器官损伤的标志物。肌酐水平（假手术组：19.13 µmol/L ± 0.33 µmol/L；失血性休克组：28.88 µmol/L ± 2.69 µmol/L）、心肌肌钙蛋白T（假手术组：9.38 ng/L ± 1.87 ng/L；失血性休克组：35.62 ng/L ± 2.28 ng/L），以及天冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶（ASAT：假手术组：221 UI/L ± 48 UI/L；失血性休克组：963 UI/L ± 144 UI/L；ALAT：假手术组：36 UI/L ± 4 UI/L；失血性休克组：323 UI/L ± 13 UI/L）均显著升高，分别反映了肾脏、心脏和肝脏的损伤，且在失血性休克条件下均明显增加（图4）。
<img alt="比较出血性休克下血浆肌酐、肌钙蛋白、ASAT 和 ALAT 水平的柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66523/66523fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：出血性休克模型与器官功能障碍相关。 （A）肌酐血症，（B）心肌肌钙蛋白 T，（C）天冬氨酸氨基转移酶，以及（D）出血性休克诱导后 24 小时假手术组与出血性休克动物组之间的丙氨酸氨基转移酶水平。结果以均值 ± 标准误表示。统计学显著性通过非配对 t 检验评估。*：p &lt; 0.05；**：p &lt; 0.01；***：p &lt; 0.001。n = 4 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66523/66523fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充文件 1：行为学评分详情 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66523/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

每年，失血性休克在全球造成190万人死亡。小型动物常被用作失血性休克模型，但存在标准化、可重复性和临床相关性方面的局限，从而限制了其应用价值。本文介绍了一种在大鼠中建立新的具有临床相关性的失血性休克模型的方法。

在最近几十年中，动物模型的发展使我们能够更好地理解各种病理状况，并识别出新的治疗方法。出血性……

每年全球约有200万人死于失血性休克。我们正在研究失血性休克的病理生理机制，旨在发现新的治疗靶点，从而提出创新的治疗策略。失血性休克本身是一种复杂的临床状况，其特征为血流动力学紊乱，伴随代谢损伤和器官功能障碍。实验方案的多样性使得其研究更加复杂。在本研究中，我们拟建立一种可重复、标准化且具有临床相关性的大鼠失血性休克模型。我们希望该失血性休克模型能够成为未来研究中的标准模型之一。采用标准模型将有助于推动该领域的发展，至少因为它能够实现不同研究之间关于出血性休克工作的结果比较。首先，在手术过程中，将润滑的直肠探头插入麻醉大鼠体内以监测其体温。在麻醉大鼠右下颈部锁骨上方的颈区定位后，使用DeBakey无创镊子轻轻夹住皮肤，并用精细锐利的剪刀或手术刀进行精确切口。使用标准齿状镊子轻轻切开组织。找到颈静脉，并从其肌肉包膜中轻柔分离。用4-0丝线缝合线结扎颈静脉远端，确保牢固固定。使用持针器将缝线张紧于颈静脉。在颈静脉近端侧放置一根4-0缝线，并打一个外科结但暂不收紧。使用Vannas显微解剖剪，在颈静脉上做一个小切口。用小镊子小心夹住静脉壁后，将PE50导管插入颈静脉。轻微推进导管，为确认其位置正确，可抽出少量血液后再重新注入。收紧先前准备好的结，以固定导管。在切口区域滴加一滴利多卡因。用湿润的无菌纱布覆盖切口。使用德贝基无创镊夹住左腿斯卡帕三角区的皮肤，用精细锐利的剪刀或手术刀进行切开。使用标准纹式镊子轻柔地分离组织。找到股三角区，并将一把镊子置于三角下方。然后用第二把标准纹式镊子小心地将动脉与神经及股静脉分开。在股动脉远端放置一根4-0缝线，并用持针器夹住缝线，使股动脉处于张力状态。接着，在股动脉近端放置另一根4-0缝线，打一个外科方结但暂不收紧。夹闭血管后，使用Vannas显微解剖剪在股动脉上做一横向切口。用标准齿状镊夹住动脉壁，用镊子夹持导管插入股动脉。轻轻松开动脉夹，确保血液未反流进入导管。若信号良好，将导管稍向前推进入动脉，并拉紧先前准备好的外科结。向大鼠注射肝素，并在切口区域覆盖一块湿润的无菌纱布。稳定10分钟后，连续记录5分钟的基础血流动力学数值。为诱导出血性休克，使用1 mL注射器在5分钟内从股动脉抽取5 mL血液。在室温下配制50%乳酸林格液与50%采集血液的混合液。将装有该混合液的2 mL注射器连接至颈静脉导管末端。在维持出血性休克状态时，当平均动脉压超过38 mmHg，从股动脉抽出200 µL血液。若压力低于32 mmHg，则通过颈静脉注射200微升50%血液与50%乳酸林格液的混合液。用纱布对尾部进行无菌准备后，使用针尖从尾端采集一滴血液，以测定外周血乳酸水平。最后，使用20 mL注射器通过颈静脉导管，以注射泵输注乳酸林格液对大鼠进行复苏。出血性休克处理后，夹闭麻醉大鼠的颈静脉。从静脉中移除导管。结扎后，应确保血管无血液渗漏。现在，使用5-0无菌缝线通过皮下和皮肤缝合关闭切口区域。用10%聚维酮碘溶液对术区进行消毒。使用装有26号针头的1 mL注射器，皮下注射布托啡诺。苏醒后，将大鼠放置于其笼子内的加热垫上。在诱导出血性休克16小时后，从尾端采集一滴血液以测定血乳酸水平。将麻醉后的大鼠置于手术台上，并插入直肠探头。进行颈动脉插管时，使用DeBakey无创镊夹住皮肤，用精细锋利的剪刀或手术刀在颈部正中做切口。用标准型镊子轻轻钝性分离组织，分开唾液腺并切开气管肌，以暴露气管环。使用标准纹状镊将左侧颈动脉与神经分离，并用4-0丝线在远端结扎。接着，在动脉近端放置缝合线，打一个外科手术结但暂不收紧。夹闭后，使用Vannas显微解剖剪剪开颈动脉。使用标准手术镊轻轻夹住动脉壁以扩大开口，并用提供的导管进行动脉插管，操作时用镊子夹持导管。轻轻松开动脉夹，确保血液不会反流进入导管。确认获得正确的血压信号后，将导管稍向前推进入动脉，并拉紧先前准备好的外科结。假手术组与出血性休克组的基础平均动脉压相似。出血性休克诱导后24小时，由于舒张压降低，出血性休克组的平均动脉压显著下降。各组之间的收缩压、脉压和心率未观察到变化。尽管休克指数保持不变，但在出血性休克组中，改良休克指数显著升高。作为全身性代谢功能障碍指标的乳酸血症，在出血性休克后显著升高，并在出血性休克持续16小时后进一步上升。在出血性休克诱导后16小时，体温和呼吸频率（全身炎症反应综合征的标志）在各组之间无明显变化。行为学评估显示，出血性休克组的行为评分升高，提示其姿势和活动发生改变。

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开发大鼠临床相关的出血性休克模型

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本文旨在为研究人员提供建立婴儿猪出血性休克模型的详细且易于操作的指南。...

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关键词：幼猪，失血性休克，容积控制，动物模型，休克模型，实验外科，血流动力学，重症监护，创伤研究

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开发一种临床相关的 rats 出血性休克模型

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