Name: 使用 Fast Protein 液相色谱系统对 6X-His 标签蛋白进行亲和纯化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-26T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: 学习使用固定化金属亲和层析技术纯化带6X-His标签的FEN1蛋白，该方法基于FPLC系统实现高效分离，适用于DNA复制与修复相关蛋白质的功能研究。

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本工作由美国国家科学基金会（1929346）和美国癌症协会（RSG-21-028-01）的资助项目支持。我们还要感谢 Balakrishnan 实验室成员提供的有益讨论。

1. 样品制备
<ol>
	<li>为纯化重组FEN1蛋白，按照Ononye等人的先前描述，在BL21(DE3)细胞中表达构建体（pET-FCH-FEN1）8。
	<ol>
		<li>用1%的过夜培养物接种LB培养基（表1），在37 °C下培养细胞至OD达到0.6。</li>
		<li>加入0.4 M异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导，并继续培养3小时。</li>
		<li>在4 °C下以5,000 × g离心15分钟收集细胞。将沉淀物储存于-80°C冰箱中。</li>
		<li>在纯化当天，从-80 °C冰箱中取出细胞沉淀，置于冰上融化，并用100 mL裂解缓冲液（表1）重悬沉淀。 
		注意：操作过程中细胞裂解液应始终置于冰上，以防止蛋白降解。一旦融化后，整个纯化过程必须在同一天内完成。细胞裂解液不得在冰箱中过夜存放。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将悬浮液转移至250 mL烧杯中，在冰上进行超声处理，设置为35%振幅，工作30秒，间歇30秒，持续15分钟。 
	注意：请参考仪器制造商的设置以确定合适的振幅。</li>
	<li>将超声处理后的样品转移至离心管中，在4 °C下以27,000 × g离心30分钟，获得澄清的裂解液。将细胞裂解液置于4 °C冰箱中的冰上，直至上样。</li>
</ol>
2. 准备亲和层析柱
<ol>
	<li>将色谱柱（分别用于Ni-NTA树脂和钴基树脂）固定在夹具架上，确保色谱柱尽可能保持垂直，避免任何倾斜。确保色谱柱底部用塞子堵住，并在每根色谱柱底部加入1–2 mL起始缓冲液，以防止装柱过程中产生气泡。</li>
	<li>轻轻振荡树脂瓶，直至树脂完全重悬。打开色谱柱顶部，连续倒入10 mL每种浆液，避免混入气泡。倾倒时，将浆液沿置于色谱柱边缘的金属刮刀或玻璃棒流下，以防止柱内产生气泡。</li>
</ol>
使用流路适配器进行柱子填装
<ol>
	<li>拔下柱子的堵头，将底部连接到一段管路的一端。将管路的另一端连接至FPLC系统的紫外检测端口。</li>
	<li>确保床层支撑套筒已拉入流路接头本体中，然后将流路接头本体套在柱子顶部（图2A）。将凸轮卡扣置于位置1，缓慢放下流路接头，注意不要将其插入缓冲液中（图2B）。随后将凸轮卡扣切换至位置2（图2B）。连接管路至系统，并启动起始缓冲液流动1–2分钟，以排出管路中的空气，防止装柱过程中产生气泡。</li>
	<li>将卡扣切换回位置1，然后平稳地将流路接头一次性下压至缓冲液中，避免引入气泡，再将卡扣切换回位置2。此操作可使少量缓冲液进入流路接头，从而去除任何残留气泡。</li>
	<li>将卡扣切换至位置3，并拧紧凸轮基座和锁紧环（图2B）。</li>
	<li>以10 mL/min的流速开始缓冲液流动，进行柱子装填。持续此步骤3分钟，或直至树脂充分压实。</li>
</ol>
4. FPLC 系统样品环的预处理
<ol>
	<li>将样品环顶部的管路连接到FPLC系统的Loop E端口（图3）。</li>
	<li>将样品环底部的管路连接到FPLC系统的Waste 2端口。</li>
	<li>将一段管路插入FPLC系统的柱端口，并将另一端放入废液瓶中。</li>
	<li>将泵A的管路插入经过滤的双蒸水（ddH2O）中。</li>
	<li>在软件中双击泵设置（图4A，标记为2），并选择系统泵注入样品环模式（图4C）。</li>
	<li>点击流速设置（图4A，标记为1），将流速更改为10 mL/min，并在%B输入框中输入0%（图4B）。</li>
	<li>启动流速，用水冲洗样品环，推动滑动密封件向下移动。</li>
	<li>当滑动密封件到达样品环底部时，停止流速。将泵A从ddH2O切换至起始缓冲液。将样品环顶部的管路连接至Waste 2，底部管路连接至Loop E。柱端口的管路仍置于废液瓶中。</li>
	<li>以10 mL/min的流速启动流体。当流入的起始缓冲液推动滑动密封件上升至样品环顶部时，停止流速。此时样品环已准备就绪，可进行样品注入。</li>
</ol>
5. 样品注入
<ol>
	<li>双击pump settings，选择Manual load loop（图 4C）。</li>
	<li>拧下 Loop E 上的管路，并将其放入废液容器中。</li>
	<li>将柱端口的管路连接到流路接头顶部的管路上。</li>
	<li>使用 30 mL 注射器吸取样品，然后将注射器连接至进样口接头。</li>
	<li>将注射器拧入进样口并注入样品，确保样品明显进入样品环中。取 100 µL 样品（标记为input lysate）置于微量离心管中，于 -20 °C 保存，用于 SDS-PAGE 分析 
	注意：根据样品总体积，可能需要进行 2–3 次进样。</li>
	<li>用柱帽封闭进样口。</li>
	<li>将样品环底部的管路重新连接至 Loop E 端口。</li>
	<li>将泵 B 的管路放入洗脱缓冲液中。</li>
</ol>
6. 使用FPLC系统连接软件进行方法创建与分析
<ol>
	<li>进入“主页”选项卡，选择新建方法。</li>
	<li>在左侧栏选择方法设置选项卡，进入柱类型下拉菜单，选择自定义（图5）。</li>
	<li>输入柱体积（5 mL）。</li>
	<li>输入运行所需的流速（1 mL/min）。</li>
	<li>进入单位选择，选择CV（柱体积）作为方法基本单位。</li>
	<li>确保入口A设置为缓冲液A&#160;，入口B设置为缓冲液B&#160;（默认设置）。</li>
	<li>在左侧菜单中选择方法流程选项卡。按以下顺序添加纯化步骤：平衡、上样、柱洗涤和洗脱。
	<ol>
		<li>在平衡步骤下，将平衡体积设为10 CV。确保缓冲液设置保持在0% B。</li>
		<li>在上样选项卡下，通过观察样品环确定上样体积。滑动密封圈的位置指示样品体积。</li>
		<li>在柱洗涤步骤下，将洗涤体积设为5 CV。此步骤禁用组分收集&#160;；运行期间将洗涤液整体收集至烧杯中，而非分组分收集。</li>
		<li>对于洗脱，设置梯度体积为14 CV，从0% 缓冲液B线性升至100% 缓冲液B。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>保存方法并开始运行。</li>
	<li>确保组分收集器从第一组分位置开始收集。</li>
	<li>输入运行名称，然后点击开始。</li>
	<li>在平衡阶段，实时监测紫外吸收曲线。确保所有连接处牢固无泄漏；通过观察缓冲液是否流入废液容器来确认系统形成完整回路。若在平衡末期紫外曲线仍未稳定，延长平衡步骤直至曲线稳定（图6）。</li>
	<li>上样时，将通向废液容器的管路切换至洁净烧杯。此步骤中，将从废液管流出的未结合蛋白作为穿流液收集（标记为FT）。</li>
	<li>观察紫外吸收曲线是否出现急剧上升，通常达到最大读数3,000 maU（图6）。 
	注：典型的曲线在大部分上样过程中会稳定在3,000 maU。</li>
	<li>在柱洗涤过程中，随着残留的未结合蛋白被洗脱，仅保留结合蛋白在树脂上，应观察到紫外吸收曲线急剧下降（图6）。若在洗涤步骤结束时紫外曲线仍未下降，点击保持步骤延长洗涤时间，直至紫外吸收充分下降。此步骤开始时，将废液管从FT烧杯转移至另一个标记为洗涤的洁净烧杯。</li>
	<li>当洗脱步骤开始时，确保组分收集器移动至正确位置并开始收集组分。通过观察紫外吸收曲线中的峰来判断蛋白的洗脱情况（图6）。</li>
	<li>运行完成后，进入主页选项卡，选择打开运行。打开运行文件以查看色谱图，并在顶部菜单中选择峰积分，标记运行中获得的峰。</li>
	<li>选择组分选项卡，以可视化含有洗脱蛋白的组分。</li>
</ol>
7. SDS-PAGE 分析
<ol>
	<li>混合15 &#181;每份含蛋白质的组分各取 5 L &#181;L 的 SDS 上样缓冲液（表1). 将样品在 95 ℃ 加热 &#176;5 分钟，5 °C。</li>
	<li>将样品加入预制胶中，与预染蛋白质标记物一同在160 V电压下电泳运行45分钟。</li>
	<li>将凝胶置于考马斯亮蓝染色液中染色 30 分钟（表 1).</li>
	<li>用ddH₂O洗涤凝胶2O（重复3次）</li>
	<li>用脱色液对凝胶脱色1小时（表 1).</li>
	<li>观察蛋白质条带；在42 kDa处检测FEN1。</li>
	<li>合并含有FEN1的组分，并使用10 kDa离心滤器浓缩。分装后于-80 ℃保存。&#730; &#176;C 冷冻柜</li>
</ol>

Optimizing FPLC for Efficient Purification of His-Tagged FEN1 Protein

<ol><li>Balakrishnan, L., Bambara, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flap+endonuclease+1%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Flap endonuclease 1.</a> Annu Rev Biochem. 82, 119-138 (2013).</li>
<li>Asagoshi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FEN1+functions+in+long+patch+base+excision+repair+under+conditions+of+oxidative+stress+in+vertebrate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">FEN1 functions in long patch base excision repair under conditions of oxidative stress in vertebrate cells.</a> Mol Cancer Res. 8 (2), 204-215 (2010).</li>
<li>Lyamichev, V., Brow, M. A., Dahlberg, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-specific+endonucleolytic+cleavage+of+nucleic+acids+by+eubacterial+DNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure-specific endonucleolytic cleavage of nucleic acids by eubacterial DNA polymerases.</a> Science. 260 (5109), 778-783 (1993).</li>
<li>Bornarth, C. J., Ranalli, T. A., Henricksen, L. A., Wahl, A. F., Bambara, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+flap+modifications+on+human+FEN1+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of flap modifications on human FEN1 cleavage.</a> Biochemistry. 38 (40), 13347-13354 (1999).</li>
<li>Xu, Y., Potapova, O., Leschziner, A. E., Grindley, N. D., Joyce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contacts+between+the+5%27+nuclease+of+DNA+polymerase+I+and+its+DNA+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Contacts between the 5' nuclease of DNA polymerase I and its DNA substrate.</a> J Biol Chem. 276 (32), 30167-30177 (2001).</li>
<li>Wen-Hui, K., Kuo, K., Chase, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+interactions+between+poly-histidine+fusion+tagsand+immobilized+metal+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Lett%22%5BJournal%5D)">Exploiting the interactions between poly-histidine fusion tagsand immobilized metal ions.</a> Biotechnol Lett. 33 (6), 1075-1084 (2011).</li>
<li>Charlton, A., Zachariou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilized+metal+ion+affinity+chromatography+of+native+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immobilized metal ion affinity chromatography of native proteins.</a> Methods Mol Biol. 421, 25-35 (2008).</li>
<li>Ononye, O. E., Njeri, C. W., Balakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+DNA+processing+enzyme+FEN1+and+its+regulation+by+protein+lysine+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of DNA processing enzyme FEN1 and its regulation by protein lysine acetylation.</a> Methods Mol Biol. 1983, 207-224 (2019).</li>
<li>Econo-column flow adaptor instruction manual. Bio-Rad. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M7380014.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M7380014.pdf</a> (2015).</li>
<li>NGC Chromatography systems and ChromLab software instrument guide version 3.3. Bio-Rad. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10026252.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10026252.pdf</a> (2015).</li>
</ol>

作者不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。

亲和层析是一种广泛用于纯化DNA结合蛋白的技术。固定化金属离子亲和层析（IMAC）是亲和层析的一种特定类型，利用金属离子捕获肽序列中的组氨酸残基。因此，通常将&#34;6X-His标签&#34;或&#34;多聚组氨酸标签&#34;连接到待纯化蛋白的N端或C端。镍和钴是最常用的金属离子，它们与纯化过程中常用的BME和DTT等试剂的兼容性有所不同。尽管已有在1 mM BME或DTT浓度下完成纯化的报道，但这些试剂的使用仍可能不可靠。在平衡过程中可能观察到不兼容现象。如果流经树脂的缓冲液呈现棕色，表明金属离子发生了氧化，可能导致金属离子从树脂上脱落。这会显著降低树脂的结合能力。
为了确保蛋白质的高纯度和高得率，应优先促进金属离子与His标签之间的亲和相互作用，避免其他可能的电荷相互作用。这将确保所有蛋白质在一次洗脱中完成，而不是在洗脱的不同阶段逐步洗脱。为实现这一目标，蛋白质在纯化过程中应带有极低的净电荷。如果缓冲液的pH值接近目标蛋白质的等电点，则可使蛋白质的电荷保持在较低水平。由于FEN1的等电点约为8.8，因此我们使用的缓冲液pH值维持在8。
带有 Ni 离子的 Ni-NTA 树脂被认为具有更高的蛋白质结合能力，与基于钴的 TALON 树脂相比，预期可获得更多的蛋白质产量。这也意味着非特异性蛋白质结合的可能性更大，因此纯度较低。TALON 较低的结合能力由更高的特异性结合所弥补，从而获得高纯度的蛋白质。这与我们的实验结果一致，即从 Ni-NTA 获得的纯化蛋白质产量高于 TALON。
无论使用何种树脂，其纯度和得率均显著受到柱层析填装效果的影响。通过将流路适配器连接至NGC自动化层析系统，可实现高效的柱填装9。在足够高的流速下，流路适配器能够有效压实树脂，并防止缓冲液在柱内积聚。流路适配器与NGC系统的结合，可通过精确调控流速、压力和洗脱梯度，实现对两种树脂性能的准确比较，同时高效收集蛋白组分。
通过 Chromlab 软件，可实时监测运行条件10。在运行过程中，可随时更改流速。在上样过程中，系统压力可能超过阈值（600 psi）。此时，可在上样步骤期间降低流速以减小压力。该软件还具有暂停步骤功能，可根据需要延长任意步骤。此功能在柱洗涤和洗脱步骤中尤为有用。在柱洗涤过程中，预期紫外（UV）图谱会下降并接近 0，这表明大部分未结合的蛋白质已被洗出树脂。如果紫外曲线持续上升或未能下降，可延长洗涤步骤，直至观察到预期的图谱。类似地，在洗脱过程中，可通过紫外图谱中的峰来观察目标蛋白的洗脱情况。如果意外未观察到峰，可延长洗脱步骤，直至出现预期的峰。
技巧与提示 
在平衡步骤期间，必须将缓冲液注入色谱柱，同时废液应持续排入废液瓶中；这可确保所有连接处紧密且无泄漏。若发现 NGC 任何部位出现泄漏，必须检查该区域周围的所有接口，因为泄漏的源头可能与观察到泄漏的位置不同。如果流动已经启动，但无缓冲液进入色谱柱，可能是管路中困有气泡。请在继续操作前对系统进行排空处理。
在样品进样过程中，如果系统背压阻碍进样，必须将管路从Loop E上拧下，并在进样期间置于废液瓶中。在启动程序前，务必将其重新拧回Loop E。如果在运行过程中平衡缓冲液或样品在柱内积聚，应暂停运行并移除流路接头。需将管路从柱底部拧下，使缓冲液或样品流出。若样品流出，请务必收集流出液。
如果SDS-PAGE凝胶电泳的组分显示有较高水平的污染蛋白，则可收集色谱图中峰两侧的组分。对于表达量较低的蛋白，纯化组分在紫外吸收图谱中通常不会显示出明显的峰。
了解镍基树脂与钴基树脂在性质上的差异，有助于为纯化蛋白的后续应用选择最合适的树脂。例如，用于 体外 生化检测要求蛋白质具有尽可能高的纯度，此时钴基树脂较为适用。然而，若蛋白用于抗体生产，则需要获得较高产量的纯化蛋白，此种情况下镍-NTA树脂可能是更佳选择。本文旨在通过FEN1蛋白的纯化，阐明这两种树脂之间的差异。

理解细胞生物学的方法多种多样。其中一种方法是采用自上而下的策略，即在某个基因中引入遗传突变，随后评估模式生物中由此产生的表型变化。相反，还原论方法则首先阐明特定蛋白质的分子机制及其酶学功能，并表征其与其他细胞组分的相互作用，进而评估该蛋白质对生物通路的影响。尽管每种研究方法都有其固有的优势和局限性，但要全面理解一个生物通路，仍需开展跨学科的研究工作。
DNA作为生命的遗传蓝图，过去七十多年来，人们对DNA复制及基因组维持机制的研究一直充满浓厚兴趣。在DNA复制领域开展的研究已获得大量关于多种复制蛋白各自结构与功能的数据。这些研究涵盖复制机制的解析与生物化学活性检测，其可行性依赖于复制蛋白的纯化，从而得以在体外对这些蛋白进行精细深入的分析 体外 环境。因此，蛋白质纯化成为大多数致力于揭示DNA复制机制的研究工作中不可或缺且普遍使用的技术。
本文介绍了一种从细菌细胞中过表达并纯化带有6X-组氨酸标签的DNA复制蛋白的方法。该目标蛋白为人源 flap 内切酶1（FEN1），是一种具有结构特异性的核酸酶，在滞后链DNA复制中发挥关键作用，同时也参与碱基切除修复（BER）等重要的DNA修复通路1,2,3。FEN1的主要功能是切割DNA复制或BER过程中产生的5'-突出flap结构的基部。早期针对FEN1酶活性的生化研究表明其可能通过一种&#34;追踪&#34;机制发挥作用，即核酸酶识别flap结构的游离5'-磷酸末端后，沿flap移动至其基部并进行切割4。后续研究发现，FEN1实际上是通过一种&#34;穿线&#34;机制发挥作用：它首先结合到flap结构的基部，随后将游离的5'端穿入其活性位点，最终完成切割（图1）5。实现FEN1的过表达与重组蛋白的分离，推动了这些研究突破，使科研人员能够将其广泛应用于生化分析与结构研究中。
亲和层析是一种常用的分离方法，用于纯化DNA。该技术利用目标蛋白与固定在树脂上的配体之间的可逆结合亲和力，特异性捕获目标蛋白。其中应用最广泛的生物亲和作用之一是组氨酸氨基酸与镍、钴等金属离子之间的强相互作用，因此可通过带有Ni2+或Co2+的树脂进行捕获。
编码6至9个组氨酸残基（His）的DNA序列通常被插入到编码目标蛋白的质粒构建体中（位于N端或C端），从而为该蛋白添加6×His标签或聚组氨酸标签。随后可通过固定化金属亲和层析（IMAC）方便地纯化带His标签的蛋白；IMAC是亲和层析的一种亚型，其原理是树脂上的金属离子可捕获带有亲和标签的蛋白，并可通过适当的洗脱剂将其洗脱。过渡金属离子如Ni2+和Co2+可被固定在由N,N,N'-三（羧甲基）-乙二胺或次氮基三乙酸（NTA）基团衍生的琼脂糖或硅胶基质上6。
已知金属配体对物理、化学和生物因素引起的降解具有较强的抗性，这一优势使其优于其他类型的配体6,7。此外，His标签相对较小，通常不会显著影响蛋白质的结构或功能7。然而，在细菌表达系统中，许多染色体表达的蛋白质对金属离子具有亲和性，可能与目标蛋白共同纯化。镍和钴是IMAC基质中常用的典型金属离子。Ni-NTA树脂和基于钴的TALON树脂常用于纯化带His标签的蛋白质。
Ni-NTA 与 TALON 的比较 
Ni-NTA 和 TALON 的相应金属离子均通过 NTA 配体固定在树脂上。据认为，Ni-NTA 具有更高的结合容量，可结合高达 100 mg/mL 的蛋白质。这可能导致更高的蛋白得率，但需注意的是，可能会共纯化杂质蛋白。相比之下，TALON 树脂对 His 标签蛋白具有更高的结合特异性，可能获得纯度更高的蛋白组分。在本研究中，我们旨在利用所引用的自动化快速蛋白液相色谱系统（NGC 系统）（参见材料表）来比较两种树脂的纯化效率。
缓冲液及其相容性 
在蛋白质纯化过程中，细胞裂解、样品制备、树脂平衡以及从树脂上洗脱目标蛋白等步骤均需要使用缓冲液。Tris、MOPS 和 HEPES 缓冲液在浓度不超过 100 mM 时，均适用于 Ni-NTA 树脂。缓冲液中通常添加还原剂以防止蛋白质氧化和聚集。然而，当还原剂浓度超过一定阈值时，可能导致树脂上的金属离子被剥离。对于上述基于镍和钴的树脂，建议还原剂（如 β-巯基乙醇（BME）或二硫苏糖醇（DTT））的浓度应低于 1 mM。
纯化hFEN1所用的缓冲液为含有NaCl、BME、苯甲基磺酰氟（PMSF）、EDTA和甘油的Tris缓冲液。NaCl可维持蛋白质的可溶性，并破坏如DNA结合等分子间相互作用。BME能够还原被氧化的蛋白质，从而防止蛋白质聚集。PMSF是一种蛋白酶抑制剂，可防止目标蛋白被蛋白酶降解。EDTA可去除样品中的二价阳离子，阻止其与核酸酶和蛋白酶结合。甘油可增强蛋白质在水溶液中的稳定性。此外，裂解缓冲液中还含有完整的蛋白酶抑制剂片剂，以确保在细胞裂解过程中目标蛋白最大程度地免受降解性蛋白酶的破坏。平衡缓冲液和洗脱缓冲液中含有咪唑，其中洗脱缓冲液含有更高浓度的咪唑，以便在洗脱过程中将结合的蛋白质从树脂上置换下来。
下一代色谱系统（NGC） 
该自动化中压色谱系统专为快速流速蛋白液相色谱（FPLC）设计，采用双泵系统可同时输送两种不同的缓冲液，并能够注入250 µL至100 mL范围内的多种样品体积。该系统配备样品环（在此系统中称为Dynaloop），可实现较大样品体积的进样。系统通过Chromlab软件进行操作，该软件支持自定义方法的创建、纯化运行过程的调控，以及对紫外吸收峰和蛋白质组分的分析。

<table><tbody><tr><td>4x Laemmli 样品缓冲液</td><td>BioRad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Merck</td><td>UN2789</td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙醇（BME）</td><td>Sigma</td><td>M-6250</td><td></td></tr><tr><td>Chromlab 软件版本 6.1.27.0</td><td>BioRad</td><td></td><td>用于操作 NGC 系统</td></tr><tr><td>Complete MINI 蛋白酶抑制剂片剂</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 R</td><td>Sigma</td><td>B0149</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Dot Scientific</td><td>DSD11000</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Column 玻璃层析柱</td><td>BioRad</td><td>7371512</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Dot Scientific</td><td>DSE57020</td><td></td></tr><tr><td>流路适配器</td><td>BioRad</td><td>7380014</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Dot Scientific</td><td>DSG22020</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Dot Scientific</td><td>DSI52000</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>Mini PROTEAN TGX 凝胶</td><td>BioRad</td><td>4561084</td><td></td></tr><tr><td>NGC 层析系统</td><td>BioRad</td><td></td><td>自动化液相层析系统&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ni-NTA 琼脂糖</td><td>Qiagen</td><td>1018244</td><td></td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟</td><td>Dot Scientific</td><td>DSP20270</td><td></td></tr><tr><td>PreScission Plus 蛋白双色标准品&amp;nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Dot Scientific</td><td>DSS23020</td><td></td></tr><tr><td>TALON 金属亲和树脂</td><td>Takara</td><td>635502</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td></td><td>DST60040</td><td></td></tr></tbody></table>

使用快速蛋白液相色谱系统亲和纯化6x-his标签蛋白

Affinity Purification of a 6X-His-Tagged Protein using a Fast Protein Liquid Chromatography System

对蛋白质进行功能表征需要大量高纯度的蛋白质表达与纯化，以开展生化检测。快速蛋白液相色谱（FPLC）系统可实现复杂蛋白质混合物的高分辨率分离。通过调节FPLC中的多种参数，例如选择合适的纯化介质、控制蛋白质样品的温度、调节样品在介质上的流速以及洗脱速率，可有效保持蛋白质的稳定性与功能活性。在本实验方案中，我们将展示FPLC系统在纯化于细菌培养物中表达的6X-His标签 flap endonuclease 1（FEN1）蛋白方面的广泛应用性。为提高蛋白质纯化效率，我们将重点关注多个关键因素，包括色谱柱的正确装填与准备、使用进样环进行样品注入、样品上柱时的流速控制以及洗脱参数的优化。最后，将分析层析图谱以鉴定富含目标蛋白的组分，并讨论重组蛋白长期保存的注意事项。优化蛋白质纯化方法对于提升蛋白质分析的精确性与可靠性至关重要。

表达hFEN1的BL21 (DE3)细胞裂解液分别通过预平衡的Ni-NTA和TALON树脂。Ni-NTA树脂由Ni2+离子活化，具有高结合容量。结果显示，与TALON树脂相比，Ni-NTA树脂获得的FEN1蛋白产量更高（图7）。已知Ni-NTA树脂还会非特异性结合其他染色体表达的蛋白质。通过钴基树脂纯化的样品虽然纯度较高，但得率低于Ni-NTA树脂。与许多其他DNA结合蛋白类似，FEN1进一步通过凝胶过滤树脂以去除杂质。hFEN1可在43 kDa位置被识别。
<img alt="DNA加工模型示意图；酶相互作用：5'端结合、追踪与穿线模型的解释。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66529/66529fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：hFEN1介导的切口切割机制：追踪模型与穿线模型。 最初认为FEN1（图中显示为黄色）会结合到切口结构的5'端，并沿切口移动至切口基部（左图）。后续研究表明，FEN1首先结合到切口基部，再将5'切口端穿入其活性位点（右图）。缩写：hFEN1 = 人切口内切酶1。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66529/66529fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="色谱系统示意图；流路适配器组件；标注了床层支撑和锁紧环。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66529/66529fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：流路适配器。 （A）用于柱子装填和纯化过程的流路适配器各组件；（B）凸轮锁扣的三个位置，用于拧紧或松开O型圈并固定适配器。放大图像自上而下显示O型圈在位置1、2和3时的状态（松开/拧紧）。图片经9许可使用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66529/66529fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="色谱流体控制的高效液相色谱阀示意图；系统包括色谱柱、泵和废液管路。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66529/66529fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：快速蛋白液相色谱系统的进样模块。 进样模块的各个端口将快速蛋白液相色谱系统连接至色谱柱、样品环和废液管路。该图像已获10许可使用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66529/66529fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="液相色谱系统设置：梯度流动控制、样品进样阀、组分收集。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66529/66529fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：系统控制。（A）系统控制选项卡，可在此调整流速设置并查看流路；（B）流速设置窗口；（C）泵设置窗口。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66529/66529fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="色谱图；紫外检测；色谱柱装置；蛋白质纯化系统；流速控制。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66529/66529fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图5：方法设置窗口。 用于输入纯化参数的窗口，例如色谱柱类型、柱体积、方法基本单位以及运行流速。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66529/66529fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="色谱过程；紫外吸光度随时间变化曲线；平衡、上样、洗涤、洗脱。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66529/66529fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
图6：FPLC过程中紫外吸收曲线的示意图：紫外吸收曲线随纯化阶段的不同而上升或下降。在平衡初期，由于管路中存在气泡或污染物，紫外曲线可能出现畸变。随着平衡过程的进行，曲线应逐渐稳定为一条平坦的直线；在上样过程中，未结合到树脂上的蛋白质流出，导致紫外吸收值上升，直至达到最大阈值。在洗涤阶段，残留的未结合蛋白被冲洗出去，紫外吸收值逐渐下降。最后，在洗脱阶段，当目标蛋白被洗脱下来时，紫外曲线中会出现一个明显的峰。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66529/66529fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示通过Ni-NTA和钴树脂纯化蛋白质的SDS-PAGE凝胶图，分子量为42.5 kDa。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66529/66529fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图7"> 
图7：SDS-PAGE凝胶图像。 第1道—分子量标记物；第2道—1% Ni-NTA上样样品（细胞裂解液）；第3道—Ni-NTA树脂的1%穿流组分；第4道—从Ni-NTA树脂纯化的hFEN1；第5道—1%上样样品（细胞裂解液）；第6道—钴基树脂的1%穿流组分；第7道—从钴基树脂纯化的hFEN1；黑色箭头表示分子量为42.5 kDa的FEN1。缩写：SDS-PAGE = 十二烷基硫酸钠；MW = 分子量；hFEN1 = 人 flap 内切酶1；NTA = 次氮基三乙酸。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66529/66529fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>缓冲液与溶液</td>
			<td>组分</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="8">裂解缓冲液</td>
			<td>50 mM Tris–HCl [pH 8.0]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mM beta mercaptoethanol (BME)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mM phenyl-methylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1片完全蛋白酶抑制剂</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM imidazole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% glycerol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="6">平衡/洗涤缓冲液</td>
			<td>50 mM Tris–HCl [pH 8.0]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mM BME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mM PMSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM imidazole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% glycerol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="6">洗脱缓冲液</td>
			<td>50 mM Tris–HCl [pH 8.0]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mM BME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mM PMSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M imidazole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% glycerol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">SDS 样品上样缓冲液</td>
			<td>900 μL 4x Laemmli 样品缓冲液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 μL BME</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">考马斯亮蓝染色液</td>
			<td>50% ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Acetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Coomassie brilliant blue R-250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">脱色液</td>
			<td>50% ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Acetic acid</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：缓冲液成分。

本文提供了一种人源重组蛋白 flap 内切酶 1（FEN1）的亲和纯化方法，该蛋白带有 6X-组氨酸标签。该方案利用两种不同的固定化金属离子柱对带标签的蛋白进行纯化。

使用快速蛋白液相色谱系统亲和纯化6X-His标签蛋白

蛋白质的功能表征需要大量表达并纯化出高纯度的蛋白质，以进行生化检测。

本研究旨在利用亲和层析技术纯化一种关键的DNA复制蛋白——瓣状内切酶1（flap endonuclease 1，FEN1）。这将使我们能够在可控的体外环境中研究FEN1在DNA复制与修复中的功能，从而加深对其功能及生物学作用的理解。目前有多种层析技术可用于纯化DNA结合蛋白，其中最常用的是亲和层析。在亲和层析中，固定化金属亲和层析是纯化带组氨酸标签（His-tagged）蛋白质的最有效工具之一，因为组氨酸标签与金属离子（通常为镍或钴）之间的相互作用非常强。蛋白质纯化过程成功的两个关键因素是蛋白质得率和蛋白质纯度。根据蛋白质的预期用途，可能更倾向于获得较高的得率或更高的纯度。我们的研究结果表明，为纯化带组氨酸标签的蛋白质选择合适的树脂，可能获得适合该蛋白质后续应用的理想结果。首先，将层析柱尽可能垂直地固定在夹具支架上。用塞子堵住每根层析柱的底部。向每根层析柱底部加入一到两毫升起始缓冲液，以防止装柱过程中产生气泡。然后打开层析柱顶部，将10毫升每种浆液连续倒入柱中，同时用金属刮刀或玻璃棒抵住柱口边缘，以防止产生气泡。取下柱塞，并将层析柱底部连接至一段管路的一端。将管路的另一端连接至FPLC系统的紫外检测端口。确认床层支撑外壳已插入流路适配器主体中。将流路适配器主体沿柱子顶部滑入，此时凸轮锁扣位于位置1，然后降低流路适配器。然后将卡扣转至位置2。将管路连接至系统，并启动缓冲液流动1到2分钟，以排出管路中的空气，防止装柱过程中产生气泡。随后，将卡扣切换回位置1，平稳地将流路接头浸入缓冲液中，避免产生气泡，再将卡扣切换回位置2。将卡扣从位置2切换到位置3后，拧紧凸轮基座和锁紧环。然后以每分钟10毫升的流速开始缓冲液流动，持续3分钟，或直至树脂充分压紧。FPLC色谱柱填装完成后，将样品环顶部的管路连接至FPLC系统上的Loop E。将样品环底部的管路连接至FPLC系统的废液管路2（Waste 2）。然后将管路的一端插入FPLC系统的色谱柱接口，另一端放入废液瓶中。将泵A的管路插入经过滤的双蒸水中。接下来，打开软件。点击系统控制选项卡。双击泵设置，选择系统泵进样环。单击流速设置，将流速设定为 10 毫升每分钟。在 B 相百分比框中输入 0%。然后启动流动，用水冲洗样品环，推动滑动密封向下移动。当滑动密封件到达样品环底部时，停止流动。然后将泵A从双蒸水中切换至起始缓冲液。将样品环顶部的管路连接至废液管2，底部管路连接至环路E。将柱端口的管路保留在废液中，并以每分钟10毫升的流速重新开始流动。首先，装填FPLC色谱柱并准备样品环以进行样品上样。然后打开软件，双击“泵设置”并选择“手动上样环”。现在将色谱柱接口的管路连接到流路适配器上方的管路上。拧下 Loop E 的管路并将其放入废液容器中。然后使用一个 30 毫升注射器抽取样品，并将注射器连接到进样口适配器上。将注射器拧入进样口并注入样品，确保样品明显进入样品环。现在用色谱柱端盖堵住进样口。将样品环底部的管路连接到 Loop E 端口。然后将泵B的管路放入洗脱缓冲液中。进入“主页”选项卡并选择“新建方法”。接着，在左侧栏选择“方法设置”选项卡。转到柱类型下拉菜单并选择自定义。将柱体积输入为 5 mL，将运行所需的流速输入为 1 mL/min。进入单位选择界面，选择 CV（柱体积）作为方法的基本单位。确认进样口 A 设置为缓冲液 A1，进样口 B 设置为缓冲液 B1。然后在左侧菜单中选择“方法概要”选项卡。在“平衡”部分，将平衡体积设置为 10 CV。在“样品上样”选项卡中，通过观察样品环来设定样品体积。进入“柱清洗”步骤，将清洗体积设置为 5 CV。对于洗脱过程，设置梯度体积为 14 CV，缓冲液 B 从 0% 线性增加至 100%，保存方法并开始运行。确保组分收集器从第一管的位置开始。输入运行名称，然后点击“开始”。在上样过程中，将通向废液容器的管路切换至一个干净的烧杯中。收集从这些管中流出的未结合蛋白，作为流穿液（flow through）并标记为 FT。运行结束后，转至“主页”选项卡并选择“打开运行”。打开运行文件以查看色谱图。在顶部菜单中选择“峰积分”以标记所获得的峰。选择“组分”标签，以可视化含有洗脱蛋白的组分。

affinity-purification-6x-his-tagged-protein-using-fast-protein-liquid

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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