Name: 解开聚糖-蛋白质相互作用:核磁共振 （NMR） 来拯救 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T14:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 学习利用核磁共振技术解析聚糖与蛋白质的相互作用机制，掌握饱和转移差谱和化学位移扰动分析方法。该方案为结构糖生物学和分子识别研究提供精确的实验流程，助力糖基治疗药物的开发。

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感谢西班牙国家研究局（Agencia Estatal de Investigación）提供的塞韦罗·奥乔亚卓越中心认证 CEX2021-001136-S（由 MCIN/AEI/10.13039/501100011033 资助）以及CIBERES（西班牙卡洛斯三世健康研究所（ISCIII，西班牙马德里）的一项倡议）。&#160;同时感谢欧盟委员会对 GLYCOTWINNING 项目的支持。

Advanced NMR Techniques for Glycan-Protein Interaction Analysis

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作者无任何利益冲突需要披露。

饱和转移差值核磁共振（Saturation transfer difference NMR，STD-NMR）已成为研究配体-蛋白质相互作用中最常用且最灵活的核磁共振方法。如上所述，该方法基于饱和转移现象，实验设置包括采集两个一维（1D）谱图 1H谱：在共振时&#172; 以及 &#172;离共振光谱。在共振实验期间，通过在一定时间内（饱和时间通常为1-3秒）施加一串低功率射频脉冲，实现对蛋白质特定质子的饱和。为了避免对配体产生直接饱和，需优化饱和脉冲的频率和持续时间，以选择性地照射蛋白质的特定质子；即脉冲应施加在无配体信号的频率位置，并具有适当的持续时间（图1）。对于50毫秒的饱和脉冲，通常应使饱和区域与最近的配体信号之间保持1 ppm的差异。一般而言，对蛋白质脂肪族区域施加选择性饱和脉冲可获得更强的饱和效应。如果配体分子不含芳香信号，也可选择照射芳香族质子（6–7 ppm）。这对于天然存在的糖类尤为有用，因为它们不含芳香基团。一旦蛋白质的特定区域被选择性照射，饱和效应将通过偶极相互作用在蛋白质内部传播 1H-1H交叉弛豫（自旋扩散）。最终，饱和效应到达结合位点处的蛋白质质子，并进一步传递给与其紧密接触（r &#60; 5 &#197;通过分子间作用与受体 1H-1H NOE。显然，被饱和的配体质子信号强度会降低。在接收到饱和效应后，由于结合动力学的作用，瞬时结合的配体（需满足快速交换条件）发生解离，饱和信息因而累积于游离状态中。由于该过程，核磁共振共振频率处的谱图呈现出减弱的信号图2).
为了清晰展示结合态糖类1H核的信号强度变化，需在相同条件下采集一个对照质子核磁共振谱（离共振谱），其中饱和脉冲施加在远离任何受体或糖类信号的位置（通常在40–100 ppm之间）。将离共振谱与共振谱相减后得到的一维差谱仅显示配体中信号强度发生改变的1H核信号：即那些距离受体结合位点足够近、能够接收到磁化转移的质子信号（图2）。
然而，并非所有 1结合态碳水化合物中的H核接收到相同程度的饱和。理论上，磁化从受体向结合配体的转移具有距离依赖性（1/r6）。这意味着在糖链中传递的饱和度强度 1H核包含配体质子与受体质子之间空间接近性的信息，且质子与受体越接近，饱和转移差（STD）NMR信号强度越大。因此，STD NMR实验还可用于确定碳水化合物的结合表位图2 和 图3因为位于蛋白质表面附近的配体质子信号强度高于不直接参与结合的质子。
该实验适用于弱至中等亲和力的体系，极少适用于低 µM 或 nM 范围内高亲和力的体系。实际上，该方法要求解离速率在弛豫时间尺度上较快；否则，在配体解离之前，饱和转移信息会因弛豫而丢失。
另一方面，基于蛋白质的核磁共振（NMR）实验能够以氨基酸水平的精度揭示配体-蛋白质相互作用，而无需解析原子分辨率的结构。该方法可直接在溶液中检测分子识别现象，无需共结晶。化学位移扰动（CSP）分析作图在发现配体和绘制蛋白质结合位点方面具有极强的能力（图4 和 图5）。该方法适用于毫摩尔（mM）至纳摩尔（nM）范围内的各种亲和力，即使对于在化学位移时间尺度上交换速率较慢的体系也同样适用21。
然而，由于弛豫问题，该方法可能不适用于分子量超过30-40 kDa的蛋白质。此时可采用TROSY方法18，尤其是与蛋白质氘代技术联用时效果更佳。此外，蛋白质应均匀标记15N（并另准备一份同时标记13C和15N的样品，以完成必要的骨架归属）。因此，应优化包括相应表达系统在内的蛋白质表达条件，以获得毫克量级的蛋白质。倾向于寡聚化或聚集的蛋白质也不适用于此类分析。本研究中用于采集NMR数据的仪器为配备TCI低温探头的Bruker 800 MHz谱仪。若使用低于600 MHz的仪器或无低温探头的设备，实施该方法将极具挑战性。

糖类分子的分子识别对于许多与健康和疾病相关的过程至关重要。生物受体（如凝集素、抗体、酶）对糖类的特异性和选择性在很大程度上取决于焓（CH-π 和范德华力、氢键、静电作用）与熵（疏水性、动态变化、溶剂化-去溶剂化）各组分之间复杂平衡的调节1。
鉴于聚糖具有高度的化学多样性和动态特性，核磁共振（NMR）方法已被广泛用于解析聚糖相互作用超过25年2，因为这些方法能够以原子分辨率提供分子识别事件的精确细节信息3,4，即使在其他方法无法获得所需相互作用证据的情况下亦能实现。关键在于，NMR技术具有高度的灵活性，能够在不同时间尺度上研究原子水平的动态过程，是目前研究溶液中聚糖结构、构象和动力学特性的最佳技术。然而，解析这些信息可能是一个相当复杂的过程，需要采用明确的策略并结合细致的数据分析5。
核磁共振（NMR）技术具有多样性，实际上有多种方法可用于解析聚糖-蛋白质相互作用6。本文介绍了目前用于解析聚糖-受体相互作用的两种基本NMR方法7,8，重点阐述如何解析关键聚糖表位及其蛋白质结合位点的结构特征9。
在任何分子识别事件中，当受体与特定配体结合时，会发生一种化学交换过程，该过程会影响结合双方的多个核磁共振（NMR）参数10。因此，从NMR的角度来看，这种相互作用既可以从糖类配体的角度进行监测，也可以从蛋白质受体的角度进行观察11。一般来说，蛋白质受体是一种较大的生物大分子（具有较慢的旋转运动，时间尺度在纳秒级别，因此横向弛豫较快），而相互作用的糖类则可被视为中等或较小尺寸的分子（具有较快的旋转运动，时间尺度在皮秒级别，横向弛豫较慢）12。从常规角度来看，糖类的NMR信号较窄，而受体的信号则较宽13。
基于配体的核磁共振（NMR）方法依赖于许多糖类NMR参数在从游离态转变为结合态时发生的显著变化14。饱和转移差（STD-NMR）是最常用的实验性NMR技术，用于评估多种糖类结合特性15，从推断溶液状态下是否存在结合，到确定糖类的结合表位；即与蛋白质受体接触的配体原子16。
或者，基于受体的核磁共振（NMR）方法通过监测在糖类存在下蛋白受体信号相对于其无配体状态（apo state）所发生的变化来开展研究17。这类方法主要聚焦于分析蛋白信号在两种状态之间的化学位移扰动。最常采用的实验是1H-15N HSQC实验，或其TROSY替代方法18。
两种方法的结合使得核磁共振技术可应用于多种多样的体系，这些体系表现出广泛的亲和力范围。然而，与基于配体的方法不同，基于受体的核磁共振方法需要获得相对大量的可溶性、非聚集态、稳定同位素标记（15N）的蛋白质。
本文描述了这两种方法，并强调了它们各自的优点和缺点。需要注意的是，本实验方案中所述的基本步骤仅作为布鲁克（Bruker）波谱仪使用示例，因此命令和参数名称均与TopSpin（布鲁克波谱仪的控制软件）中所使用的保持一致。

<table><tbody><tr><td>5 mm Shigemi 微量管套装，带垫圈</td><td>CortecNet SAS</td><td>S30BMS-005B</td><td></td></tr><tr><td>α-乳糖-琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich 公司&amp;iacute;mica S.L.</td><td>7634-5ML</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵（15 N，99%）</td><td>LC-0179-N-50G</td><td>Tracer Tecnolog&amp;iacute;作为分析&amp;iacute;tics S.L</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素（钠盐）&amp;nbsp;</td><td>Melford Laboratories LTD</td><td>A40040</td><td></td></tr><tr><td>BIOVIA Discovery Studio&amp;nbsp;</td><td>BIOVIA，达索系统&amp;egrave;间期</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) 化学感受态细胞&amp;nbsp;</td><td>默克生命科学有限公司</td><td>CMC0014-40X40UL</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>贝克曼库尔特</td><td>Allegra X-22R</td><td></td></tr><tr><td>D&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>剑桥同位素实验室公司</td><td>DLM-4-1000</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Eppendorf</td><td>Innova 42</td><td></td></tr><tr><td>IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷） &amp;szlig;-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷)</td><td>VWR国际欧罗实验室有限公司</td><td>VW437144N</td><td></td></tr><tr><td>LacNAc</td><td>Elicityl</td><td>GLY008</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB) 培养基</td><td>默克生命科学有限责任公司</td><td>3397-1KG</td><td></td></tr><tr><td>5000 mL 锥形瓶&amp;nbsp;</td><td>VWR International Eurolab S.L.</td><td>214-1137</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1610780</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>PyMOL 分子图形系统</td><td>版本 2.0 Schr&amp;ouml;dinger</td><td></td></tr><tr><td>超声波破碎仪</td><td>声学 &amp;amp; Materials, Inc.</td><td>VC 505</td><td></td></tr><tr><td>超导核磁共振磁体</td><td>布鲁克</td><td>600 MHz AVANCE III</td><td></td></tr><tr><td>超导核磁共振磁体</td><td>Bruker</td><td>800 MHz AVANCE III</td><td></td></tr></tbody></table>

解析糖-蛋白质相互作用：核磁共振（nmr）大显身手

Disentangling Glycan-Protein Interactions: Nuclear Magnetic Resonance (NMR) to the Rescue

糖类与蛋白质的相互作用调控着众多与健康和疾病相关的生物学事件。事实上，这些识别事件的发生及其生物学后果与双方分子的三维结构、动态特性以及它们在相应细胞区室中的呈现方式密切相关。核磁共振（NMR）技术在解析这些特性方面具有独特优势，目前已发展并应用了多种基于NMR的方法来监测糖类与其受体之间的结合事件。本实验方案概述了两种在NMR糖生物学领域中最为强大的NMR技术——1H-饱和转移差谱（STD）和1H,15N-异核单量子相干（HSQC）滴定实验——的数据采集、处理与分析流程。这两种方法分别从糖类和蛋白质的角度提供互补信息，联合使用时可构成一套强有力的工具，用于阐明分子识别过程中的结构与动态特征。这一综合策略有助于加深对糖类-蛋白质相互作用的理解，并推动化学生物学领域相关研究的进展。

在此，我们介绍一种利用 1H-STD 核磁共振及 1H-15N HSQC实验以揭示凝集素与小寡糖结合相互作用的细节。通过LacNAc分子识别分析所获得的结果 h半乳糖凝集素-7（Galectin-7）hGal-7）被包含在内，作为该实验方案成功实施以及这些NMR方法在研究分子识别过程精细细节方面有效性的示例说明。 图3 显示 1LacNAc 相互作用的 H-STD NMR 谱 hGal-7。STD NMR 信号的存在表明发生了结合（图3A）。此外，只有那些与蛋白质密切接触的质子所产生的信号才会显现，从而能够确定结合表位。图3B). 图4 重点展示了&#160;1H-15蛋白质的N HSQC谱可作为其指纹图谱， 图5 说明了……的应用 1H-15N异核单量子相干（HSQC）滴定实验，用于确定化学位移扰动 hGalectin-7 骨架酰胺基团在结合 LacNAc 时的变化。这些数据不仅揭示了相互作用的存在，还明确了该凝集素的结合界面。 图6 展示了如何通过滴定数据分析来估算 LacNAc 的结合亲和力 h半乳糖凝集素-7，其浓度处于高微摩尔范围。该发现与采用其他技术获得的结果一致。
<img alt="图 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig01.jpg" /> 
图 1：共振频率的选择。 显示的是在 pH 7.4 的氘代磷酸盐缓冲液中 LacNAc:hGal-7 50:1 比例的 1H-NMR 谱图。配体（LacNAc）的信号集中在 2.0–5.2 ppm 区域。饱和频率经过仔细选择，以确保在 1–2 ppm 范围内无配体质子信号，从而实现对蛋白质质子的选择性照射。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig02.jpg" /> 
图 2：STD NMR 实验。 STD 实验的示意图：第一个谱图（离共振）作为参考，而第二个谱图（在共振）中对蛋白质进行饱和。饱和效应在蛋白质内部高效传播，并传递给与蛋白质紧密接触的配体质子。所得的差谱（STD 谱）仅显示那些经历过饱和的共振信号。通过分析 STD 实验，可实现结合糖的表位作图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig03.jpg" /> 
图 3：从配体角度分析结合情况。 （A）LacNAc 与 hGal-7 相互作用的去共振谱和 1H STD-NMR 谱叠加图。在 STD 谱中，仅显示与蛋白质密切接触的质子对应的信号。配体的 1H 共振信号归属标注于去共振谱中。（B）将相对 STD 强度映射至 LacNAc 的化学结构并以颜色标注。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig04.jpg" /> 
图4：蛋白的 1H-15N HSQC 谱图代表其指纹图谱。（A）游离态下100 µM hGal-7 的 1H-15N HSQC 谱图。谱图在25 °C下采集。部分NH交叉峰标注了相应氨基酸的标签。（B）每个NH对均表现出独特的化学位移，该位移取决于化学环境，因而取决于蛋白的三维结构。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig05.jpg" /> 
图5：从蛋白质角度进行的结合分析。（A）显示了将LacNAc滴定至hGal-7溶液中所记录的1H-15N HSQC谱图的叠加结果。通过观察谱图中多个交叉峰发生的化学位移变化，可明显看出存在相互作用。（B）根据LacNAc（15当量）滴定至hGal-7所得数据，计算出的主链酰胺信号最大化学位移扰动（maxCSP）图谱。（C）根据化学位移扰动（CSP）分析，hGal-7中扰动最显著的氨基酸残基被映射到5gal PDB结构上。在三维模型中，红色区域表示CSP值超过2σ，粉红色区域表示CSP值介于1σ至2σ之间。这些着色区域很可能代表了结合位点。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig06.jpg" /> 
图6：基于1H-15N HSQC 滴定实验的KD测定。 （A）根据体系在NMR时间尺度下的化学交换速率（快速、中等或慢速），1H-15N HSQC 谱图滴定模式的示意图。LacNAc与hGal-7 相互作用表现为快速交换模式。（B）通过CSP分析在不同配体浓度下获得的拟合曲线及KD估算结果，模型体系为hGal-7 与LacNAc二糖。报告的KD值为20个不同氨基酸数据的平均值，并包含相应的误差范围；（C）1H,15N-HSQC 谱图片段，显示滴定过程中选定交叉峰的化学位移变化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种实验方案，详细阐述了用于表征溶液中蛋白质-聚糖相互作用的一系列核磁共振（NMR）实验的样品制备、数据采集、处理与分析方法。文中概述了目前常用的基于配体和基于蛋白质的研究方法，这些方法无疑将推动结构糖生物学和分子识别研究领域的发展。

解析糖-蛋白质相互作用：核磁共振（NMR）大显身手

糖类与蛋白质的相互作用调控着众多与健康和疾病相关的生物学过程。事实上，这些识别事件的建立以及……

我们的研究深入探讨了多种聚糖-凝集素系统，探索其与健康和疾病之间的关联。我们融合了化学、生物学和生物医学的方法，深入研究了这些系统在免疫反应中的作用，涉及从癌症到细菌和病毒感染等多种病理过程。近年来，糖科学领域取得了突破性进展，推动了聚糖设计合成的发展，并在从原子水平到细胞水平的结构分子识别方面实现了分析技术的革新。这些进展共同为先进糖类靶向疗法的蓬勃发展奠定了基础。本实验方案概述了获取、处理和分析糖类研究领域中两种最强大核磁共振（NMR）技术的操作流程。这两种方法——饱和转移差谱法（saturation transfer difference）和化学微扰分析法（chemical shift perturbation analysis），能够互补地提供有关糖类分子识别过程中结构特征与动态行为的精确信息。首先制备含有蛋白质-配体复合物的样品。然后使用移液器将0.6毫升制备好的溶液小心转移至5毫升核磁共振（NMR）样品管中。为将NMR仪器调节至所需温度，使用edte命令打开温度控制监视器，并设定目标温度。然后将样品放入样品更换器中。使用自动进样器将样品插入磁体，并运行命令 sx，后接样品在自动进样器托盘中的位置编号。此后，样品即进入核磁共振磁体中。为锁定溶剂信号，请输入 lock 命令并从菜单中选择合适的溶剂。使用自动模块 ATMA 或手动模块 ATMM 完成调谐和匹配过程。现在使用 topshim 命令，启动自动匀场。然后执行 pulsecal 命令以确定质子 90 度脉冲。接着，创建一个新的数据集并上传 STD NMR 脉冲序列。在 ACQUPARS 窗口的 FQ 列表项下，定义 STD NMR 实验的关共振和开共振频率。在无配体或蛋白质质子信号的区域设定偏共振频率，随后在无糖类信号的谱图区域选择共振频率。在 ASED 窗口的 ACQUPARS 参数中定义饱和时间内所使用的 shaped pulse。随后，设定质子90度脉冲长度，调整总饱和时间为三秒，并将弛豫延迟设为三秒。扫描次数设为8的倍数，虚扫描次数设为8。然后将F2的采样点数设为16K、32K或64K，F1设为2。现在使用自动命令 rga 设置接收增益，以避免溢出。使用实验命令计算总实验时间。最后，使用 zg 命令启动实验采集。实验结束后，对第一个自由感应衰减信号（fid）进行傅里叶变换，并选择处理后谱图的保存位置。然后使用 lb 命令调整线宽展宽因子。要手动调整谱图的相位，请进入处理选项卡，然后选择调整相位子菜单。单击并拖动相应的按钮，执行零阶和一阶相位校正，并保存相位校正结果。对第二次实验进行傅里叶变换后，使用不同的编号保存处理后的谱图。使用多重功能载入两个已处理的谱图，并在多重可视化界面中利用减法按钮对它们进行相减。然后打开偏共振谱，执行 md 命令以启动多图显示窗口。随后载入 STD 谱。接下来，对 STD NMR 谱中信号的频率和强度进行比较分析。在离共振实验中，测量信号强度。通过菜单选择处理，然后选择积分。仔细定义感兴趣区域，并将积分值记录到文件中。同样，测量STD NMR实验中的信号强度，确保使用相同的参数，并将这些积分值记录在单独的文件中。或者，可通过比较STD谱与远离共振谱之间的信号强度来确定STD值。为计算以百分比表示的相对STD值，将具有最大STD强度的质子指定为100%。人半乳糖凝集素-7与N-乙酰乳糖胺相互作用的质子STD NMR谱显示了表明结合的STD NMR信号。此外，属于质子且与蛋白质近距离接触的信号出现，从而可以界定结合表位。首先使用感兴趣的凝集素制备样品。配制缓冲溶液时，使用由90%水和10%重水组成的混合液。在获取质子核磁共振谱后，新建一个数据集并选择脉冲程序HSQCETFPF3GP，然后设定所需的实验参数。发送实验进行数据采集，并使用命令xfb处理自由感应衰减信号（fid）。接下来，对不同比例的15N-半乳糖凝集素-7与N-乙酰乳糖胺结合的样品进行相同的实验，并比较其谱图。然后使用辅助软件，生成所有观测到的交叉峰对应的质子和氮15频率的综合列表。之后，计算最大化学位移扰动值。构建一个二维图，将最大的化学位移扰动值绘制在垂直的 y 轴上，对应氨基酸残基绘制在水平的 x 轴上。如果蛋白质的三维结构可获得，使用适当的软件打开相应的 PDB 文件。用一种明显的颜色突出显示化学位移扰动最大的残基，以确定可能的结合位点。将N-乙酰乳糖胺滴定至人源半乳糖凝集素-7溶液中所记录的氢-氮15 HSQC谱图叠加显示，多个交叉峰出现化学位移变化，表明两者之间存在相互作用。受扰动最显著的人源半乳糖凝集素-7氨基酸残基被映射到五聚半乳糖PDB结构中。着色区域可能代表结合位点。

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