Name: 使用 HEK293 悬浮细胞生产高产腺相关载体批次 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 了解利用HEK293悬浮细胞高效生产腺相关病毒载体的优化方案。该方法显著提高产量并降低劳动强度，为中枢神经系统损伤的基因治疗提供可靠技术支持。

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本工作由荷兰皇家艺术与科学学院（KNAW）研究基金和Start2Cure（0-TI-01）资助。我们感谢Leisha Kopp在本实验方案建立过程中提供的意见和建议。图示使用Biorender制作。

所有实验操作均经荷兰皇家科学院（KNAW）机构动物护理与使用委员会批准，并符合项目编号 AVD8010020199126 下的荷兰动物实验法。在图1中，提供了完整实验流程的示意图。从细胞接种到腺相关病毒（AAV）纯化，该流程共需6天完成。
1. 试剂准备
<ol>
	<li>质粒纯化
	<ol>
		<li>按照生产商说明进行质粒提取，并进行若干调整以确保质粒的无菌性。</li>
		<li>使用无菌蒸馏水和纯乙醇配制70%乙醇。</li>
		<li>在异丙醇离心步骤后，将质粒置于超净台中干燥，向离心管中加入无菌70%乙醇。乙醇沉淀后，再次在超净台中干燥质粒，并用无菌蒸馏水重悬质粒。注意使用无菌的微量离心管。</li>
		<li>取部分样品用于定量、限制性酶切分析，以及必要时进行测序。建议检查反向末端重复序列（ITRs）的完整性，因为突变可能对产量产生负面影响。将样品浓度调整至1 µg/µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>10倍Tween裂解缓冲液的配制
	<ol>
		<li>将30.3 g Tris缓冲液和2.033 g MgCl2·6H2O溶解于400 mL无菌蒸馏水中，调节pH至8.0，并加水定容至450 mL。</li>
		<li>保持Tween 20无菌状态，在超净台中向缓冲液中加入50 mL Tween 20，并使用0.2 µm真空滤器过滤除菌。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>碘克沙醇稀释液的配制
	<ol>
		<li>碘克沙醇溶液的初始浓度为60%。使用该原液配制15%、25%和40%的溶液。</li>
		<li>配制15%溶液：将60 mL 60%碘克沙醇溶液与48 mL 5 M NaCl和48 mL PBS-MK（含5 mM MgCl2和12.5 mM KCl的5倍PBS）混合，再用蒸馏水定容至240 mL。</li>
		<li>配制25%溶液：将67 mL 60%碘克沙醇溶液与32 mL PBS-MK混合，用蒸馏水定容至160 mL，充分混匀后加入1.6 mL酚红溶液。</li>
		<li>配制40%溶液：将160 mL 60%碘克沙醇溶液与48 mL PBS-MK混合，用蒸馏水定容至240 mL。配制60%溶液时，向100 mL 60%碘克沙醇溶液中加入1 mL酚红溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>含5%蔗糖的PBS溶液
	<ol>
		<li>将25 g蔗糖加入500 mL不含钙和镁的DPBS瓶中，充分振荡溶解，使用0.2 µm瓶式真空滤器过滤除菌。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>聚乙二醇（PEG）8000溶液
	<ol>
		<li>将400 g PEG 8000和24 g NaCl溶于无菌蒸馏水中，定容至1000 mL。加热搅拌至完全溶解，用pH试纸调节pH至7.4。</li>
		<li>使用0.2 µm瓶式真空滤器过滤除菌，得到40% PEG 8000溶液。注意由于溶液黏度较高，过滤过程耗时较长，过滤后储存于4 ˚C。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. HEK293 悬浮细胞的培养
<ol>
	<li>使用浸有70%乙醇的擦拭布进行清洁。清洁生物安全柜，并准备和清洁细胞培养所需的所有材料。</li>
	<li>将30 mL悬浮细胞培养基预热至37℃ &#176;C，置于50 mL锥形培养管中。从液氮中取出病毒生产细胞，迅速在37 &#176;C 水浴中。在冻存管即将完全解冻前，用浸有70%乙醇的擦拭纸清洁管体，并将冻存管转移至生物安全柜中。 
	注意：此处所用病毒生产细胞的详细信息见于 材料表.</li>
	<li>迅速将细胞转移至预热的50 mL锥形培养管中。在37℃摇床培养箱中培养细胞。 &#176;C，80% 湿度，8% CO₂2,&#160;200 转/分钟（RPM），振荡直径为 50 毫米。当细胞活力高于 90% 且细胞密度高于 1–3 × 10⁶ 个细胞/毫升时进行传代。6 细胞/毫升 
	注意：所使用的摇床振幅为50 mm；若振幅不同，应相应调整培养条件。</li>
	<li>在解冻后3-4天传代细胞。检查培养管是否有污染迹象；例如，真菌污染会呈现有色（黑色或绿色）环状物。</li>
	<li>准备 400 &#181;每份样品使用1 mL移液条加入0.4%台盼蓝溶液。</li>
	<li>快速从培养箱中取出悬浮细胞。立即吸取500 &#181;用1 mL移液器从管中吸出L。轻轻吹打混匀。</li>
	<li>加入100 &#181;将细胞悬液1 L加入预先准备好的台盼蓝管中。轻轻颠倒混匀，切勿使用移液器吹打混匀，以免导致细胞死亡。将细胞放回培养箱继续培养。</li>
	<li>取 50 &#181;取10 μL经台盼蓝处理的细胞悬液，加入血细胞计数板。计数总活细胞数，并计算次日传代或转染所需的细胞悬液和培养基体积。</li>
	<li>将培养基在培养箱中预热10–15分钟。将细胞悬液加入预热的培养基中，然后放回培养箱。若计划连续传代培养3天（即周一至周四），接种密度设为0.5 × 10⁶ cells/mL。6 细胞/mL；若需传代培养4天（即周四至周一），设定为0.3 × 106 细胞/毫升 
	注意：根据制造商说明，病毒生产细胞每26小时倍增一次，细胞密度应维持在3.5 × 106 和 5.5 x 106 传代前。细胞最多可传代至第20代。</li>
</ol>
3. 转染
<ol>
	<li>第1天
	<ol>
		<li>转染前24 h，将1 × 106 每毫升培养基中3×10⁸个细胞，在300 mL培养基中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天
	<ol>
		<li>将培养基、质粒和转染试剂 warming 至室温。具体配制用量参见 表 1.</li>
		<li>轻轻涡旋质粒和试剂。将质粒加入已准备好的培养基中，涡旋混匀。加入转染试剂，短暂涡旋。此后步骤中不得震荡混合物。室温孵育30分钟。</li>
		<li>同时，对第1天制备的细胞进行计数。细胞数量应在2至2.5 × 106 每毫升细胞数 &#62; 95% 存活率。</li>
		<li>孵育后，将转染混合物逐滴加入细胞中，同时轻轻摇动管子。孵育72-96小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 收获细胞
<ol>
	<li>第5天
	<ol>
		<li>加入33 mL 10倍浓缩的细胞裂解缓冲液（500 mM Tris pH 8，10% Tween 20，20 mM MgCl2），轻轻振荡混匀，于37 °C振荡孵育1.5小时。</li>
		<li>在4 °C下以3428 × g离心60分钟。使用0.45 µm PES真空滤器过滤以澄清细胞裂解液，使澄清后的裂解液保留在滤器容器中。 
		注意：过滤后可选步骤：取50 µL样品用于定量PCR（Q-PCR）。</li>
		<li>向360 mL过滤后的细胞裂解液中加入90 mL 40% PEG 8000溶液。</li>
		<li>用70%乙醇清洗搅拌子后加入样品中，在冰上或冷室中以300 RPM搅拌1小时。随后在4 °C静置过夜。 
		注意：已测试1至72小时的孵育时间。过长的孵育时间会对总蛋白沉淀产生不利影响。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 碘克沙醇纯化
<ol>
	<li>第6天
	<ol>
		<li>将全部经 PEG 沉淀的培养物体积样品转移至一个洁净的大锥形管中，在 2820 × g 以及&#160;4&#176;15 分钟，4 °C</li>
		<li>弃去上清液，将聚乙二醇沉淀物重悬于15 mL含钙和镁的DPBS中。沉淀物难以重悬，需耐心仔细操作。</li>
		<li>将重悬的部分转移至一个洁净的50 mL离心管中。聚乙二醇（PEG）将残留在生物反应器管的管壁上。再加入额外的10 mL溶液，注意收集所有PEG沉淀物。将全部液体转移至一个50 mL容器中，总体积为25–30 mL。</li>
		<li>加入40 &#181;DNaseI（10 U/μL）&#181;L）。置于培养箱中孵育 1 小时 37 分钟&#176;C. 
		注意：DNase 孵育后可选步骤：取 50 &#181;Q-PCR 用样品的升数。</li>
		<li>使用氯化物溶液清洗用于聚乙二醇沉淀的搅拌子，随后用70%乙醇冲洗。将搅拌子保存在70%乙醇中，以备下次实验使用。</li>
		<li>使用玻璃巴斯德吸管，将15.5 mL浓缩的细胞裂解液加入每个25 mm × 89 mm的聚烯烃管中。加入细胞裂解液后，更换为新的玻璃巴斯德吸管。</li>
		<li>从15%到60%依次加入碘克沙醇溶液：将9 mL 15%碘克沙醇溶液轻轻注入细胞裂解液下方。随后加入5 mL 25%和40%碘克沙醇溶液，最后加入5 mL 60%碘克沙醇溶液。</li>
		<li>使用含有钙镁的DPBS通过注射器加满离心管，以去除大部分气泡，注意不要扰动碘克沙醇层。使用电动封管机密封离心管。</li>
		<li>在非摆动转子中离心，4°C 下 490,000 × g 离心 1 小时 10 分钟 g 16时 &#176;在超速离心机中离心。从超速离心机中取出，将离心管装入金属夹具中，并准备好收集管。在生物安全柜中打开转子，以防离心过程中发生泄漏。</li>
		<li>准备一个50 mL离心管（用于弃去转子管），一个15 mL离心管（用于收集病毒），一个5 mL注射器，以及每个梯度所需的30G和19G针头。</li>
		<li>用30G针头在管盖顶部刺一个小孔，针头留在原位。在注射器上安装一个19G针头。</li>
		<li>在40%/60%界面下方小心穿刺试管，该界面可通过酚红指示剂观察到。确保针头斜面朝向40%层。</li>
		<li>用非惯用手从管子顶部取下30G针头。针头斜面朝上，缓慢吸取病毒/碘克沙醇溶液，目标吸取量为3 mL至4.5 mL。当吸至约一半并深入40%/清晰层时，将针头旋转至斜面朝下，继续吸取，以避免从蛋白层中收集样品。</li>
		<li>用非惯用手握住50 mL离心管，小心拔出针头，同时将针头放入50 mL离心管中并丢弃。用DPBS将AAV/碘克沙醇悬浮液稀释5倍，定容至15 mL。</li>
		<li>转移至离心过滤管中，在3428 × g, 4 &#176;4 ℃ 下离心 10 分钟。弃去滤液；轻轻取出滤器支架，将底部容器中的液体倒入废液瓶。向滤液中加入 15 mL PBS-5% 蔗糖溶液，重悬。</li>
		<li>3428 × g 离心 g 4 ℃时 &#730;C 下孵育 20 分钟。至少重复缓冲液置换 3 次。储存病毒（约 150–250 &#181;L）于 4 ℃ &#176;C（PHP.B 变体最长 3 个月）或分装为 50 &#181;L 等分试样，于 -80 保存 &#176;长期保存于 C。 
		注意：PHP.B 衣壳变体对冻融敏感，因此应避免冻融。</li>
		<li>按照先前方案中所述进行滴定10.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Simplified and Efficient AAV Production Using HEK293 Suspension Culture

<ol><li>Zhou, K., Han, J., Wang, Y., Zhang, Y., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routes+of+administration+for+adeno-associated+viruses+carrying+gene+therapies+for+brain+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Routes of administration for adeno-associated viruses carrying gene therapies for brain diseases.</a> Front Mol Neurosci. 15, 988914(2022).</li>
<li>Pietersz, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PhP.B+Enhanced+adeno-associated+virus+mediated-expression+following+systemic+delivery+or+direct+brain+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">PhP.B Enhanced adeno-associated virus mediated-expression following systemic delivery or direct brain administration.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 679483(2021).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Several+rAAV+vectors+efficiently+cross+the+blood%E2%80%93brain+barrier+and+transduce+neurons+and+astrocytes+in+the+neonatal+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22MolTher%22%5BJournal%5D)">Several rAAV vectors efficiently cross the blood–brain barrier and transduce neurons and astrocytes in the neonatal mouse central nervous system.</a> MolTher. 19 (8), 1440-1448 (2011).</li>
<li>Deverman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-dependent+selection+yields+AAV+variants+for+widespread+gene+transfer+to+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.</a> Nat Biotechnol. 34 (2), 204-209 (2016).</li>
<li>Chan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+AAVs+for+efficient+noninvasive+gene+delivery+to+the+central+and+peripheral+nervous+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems.</a> Nat Neurosci. 20, 1172-1179 (2017).</li>
<li>Goertsen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+capsid+variants+with+brain-wide+transgene+expression+and+decreased+liver+targeting+after+intravenous+delivery+in+mouse+and+marmoset%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">AAV capsid variants with brain-wide transgene expression and decreased liver targeting after intravenous delivery in mouse and marmoset.</a> Nat. Neurosci. 25 (1), 106-115 (2022).</li>
<li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2008).</li>
<li>Challis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+AAV+vectors+for+widespread+and+targeted+gene+delivery+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents.</a> Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).</li>
<li>Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Production Holt, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((purification%2C+and+quality+control+for+adeno-associated+virus-based+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors.</a> J Vis Exp. (143), e58960(2019).</li>
<li>Fagoe, N. D., Eggers, R., Verhaagen, J., Mason, M. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compact+dual+promoter+adeno-associated+viral+vector+for+efficient+delivery+of+two+genes+to+dorsal+root+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Thr%22%5BJournal%5D)">A compact dual promoter adeno-associated viral vector for efficient delivery of two genes to dorsal root ganglion neurons.</a> Gene Thr. 21 (3), 242-252 (2014).</li>
<li>Verhaagen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+gene+therapy%2C+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinal gene therapy, methods and protocols.</a> Meth Mol Biol. 1715, 3-17 (2018).</li>
<li>Nasse, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addgene+AAV+data+hub%3A+A+platform+for+sharing+AAV+experimental+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Addgene AAV data hub: A platform for sharing AAV experimental data.</a> Nat Meth. 20 (9), 1271-1272 (2023).</li>
<li>Grieger, J. C., Soltys, S. M., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+using+suspension+HEK293+cells+and+continuous+harvest+of+vector+from+the+culture+media+for+GMP+FIX+and+FLT1+clinical+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector.</a> Mol Ther. 24 (2), 287-297 (2016).</li>
<li>Blessing, D., Déglon, N., Schneider, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+mammalian+cells%2C+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in mammalian cells, methods and protocols.</a> Meth Mol Biol. 1850, 259-274 (2018).</li>
</ol>

Mirus 公司为初步测试提供了 TransIT 试剂的免费样品，后续实验所用试剂则为自行购买。作者没有其他需要申报的相互竞争的经济利益。

系统性给予 AAV 是一种强大的工具&#160;将基因转移至中枢神经系统；然而，腺相关病毒（AAV）的生产过程成本高昂且费时费力。通过使用悬浮细胞，相较于在15 cm培养皿中贴壁培养HEK293T细胞，可减少人力投入和塑料耗材的使用。2 培养板。此外，本实验所采用的锥形管易于操作，并能最大限度地利用实验室空间。该方案由两名研究人员建立，随后被实验室其他人员推广应用。三位独立研究人员进行的一系列生产实验平均每次制备的病毒载体足以注射6至7只小鼠。
此前已有文献描述过HEK293悬浮细胞的使用13,14。然而，该文献中所述的悬浮细胞系并未对科研用途免费开放，这为学术研究人员应用所述方法带来了瓶颈。本实验方案中描述的悬浮细胞系可免费用于科研目的。悬浮细胞的培养采用锥形管而非锥形瓶，以节省空间和时间。使用锥形瓶最多可同时培养4个反应，而使用锥形管则可同时培养12个反应。锥形管可直接转移至离心机中进行收获。
悬浮细胞培养系统的另一种选择是杆状病毒系统。杆状病毒系统的一个优势在于，这些细胞和培养基均为公开可得，且易于应用。对于学术研究者而言，Addgene 等质粒库提供了大量即用型腺相关病毒（AAV）转移质粒的资源12。尽管这些质粒也可能存在一些问题，例如ITR序列缺陷，但它们仍可作为即插即用实验的良好来源。本研究选择保留基于HEK293的生产系统，因为现有的质粒可直接用于生产，无需将构建体转移至杆状病毒中。
在转染过程中，聚乙烯亚胺相对便宜，因此是首选的转染试剂。作为替代方案，评估了一种新型转染方法（TransIt），以提高载体的产量。使用该方法时，仅需一半量的质粒即可实现三倍的产量提升。这使得TransIt在需要制备较大批次载体时成为一种具有吸引力的替代转染试剂。然而，其局限性在于成本较高，因此在小批量制备中吸引力较低。
综上所述，本文介绍了一种可在学术实验室环境中利用悬浮细胞高效生产腺相关病毒（AAV）的实验方案。同时描述了在学术实验室条件下可用于高效生产AAV的工具。

腺相关病毒（AAV）于1965年被发现，此后已广泛应用于多种研究领域1。在神经科学研究中，AAV被用于研究基因和神经元功能、绘制神经环路图谱，或构建疾病动物模型2。传统上，这些应用通常通过直接注射到目标部位实现，因为大多数天然血清型无法穿过血脑屏障，或需要高剂量才能穿透1,2,3。
随着AAV.PHP.B4以及下一代衣壳（如AAV.PHP.eB5和AAV.CAP-B106）的发现，现已可通过简单的全身性注射靶向中枢神经系统（CNS）。空间定位图谱揭示了AAV.PHP.eB在细胞水平上所靶向的细胞类型6,7。结合特定的启动子/增强子，这些衣壳为神经科学家提供了广泛的研究机会，使其能够通过无创的AAV递送方式研究基因与脑功能4,8。
与AAV9（通常为4 × 1012基因组拷贝（GC）/小鼠）相比，AAV.PHP.eB所需的剂量较低（通常为1至5 × 1011基因组拷贝（GC）/小鼠）7，但相较于直接注射策略（通常为1 × 109 GC/µL注射），仍需制备更多的病毒载体。大多数天然血清型可通过经典的贴壁细胞培养系统结合碘克沙醇纯化方法进行生产9,10,11,12。然而，对于AAV.PHP.eB而言，该方法需要耗费大量人力进行细胞培养与转染，才能获得一次实验所需的足够载体量8。因此，开发了在锥形管中进行悬浮细胞培养以生产AAV的方法。容量可达300 mL的锥形管结构紧凑，可节省培养箱空间和塑料耗材。与在15 cm培养皿上的贴壁细胞相比，悬浮细胞更易于大规模培养和操作。本方案中的转染组分保持不变，因此先前用于贴壁细胞系统的质粒可直接用于基于悬浮细胞的本方案。该方案已成功转移至实验室其他研究人员，并已成功应用于多种衣壳和载体构建体的制备。

<table><tbody><tr><td>39 mL，快速密封圆底聚丙烯管，25 x 89 mm - 50个/包</td><td>Beckman Coulter</td><td>342414</td><td></td></tr><tr><td>600 mL 锥形管适配器，用于 S-4x1000 转子&amp;nbsp;</td><td>eppendorf</td><td>5920701002</td><td></td></tr><tr><td>适配板，适用于 16 个 600 mL 生物反应器</td><td>Infors HT/ TPP</td><td>587633</td><td></td></tr><tr><td>防气溶胶盖，用于 750 mL 圆形桶</td><td>eppendorf</td><td>5820747005</td><td></td></tr><tr><td>离心机 5920 R G，230 V，50-60 Hz，包含 S-4x1000 转子、圆形桶及 15 mL/50 mL 锥形管适配器</td><td>eppendorf</td><td>5948000315</td><td></td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td>Gibco</td><td>15230147</td><td></td></tr><tr><td>DNase I 重组，RNase-free</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I 重组，RNase-free</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>含钙、镁的 DPBS</td><td>Gibco</td><td>14040091</td><td></td></tr><tr><td>无钙、无镁的 DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 一次性 PES 滤器单元 0.2 µm</td><td>Fisher</td><td>FB12566504</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 一次性 PES 滤器单元 0.45 µm</td><td>Fisher</td><td>FB12566505</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 培养管支架，也适用于 Falcon 管</td><td>Infors HT/ TPP</td><td>31362</td><td></td></tr><tr><td>600 mL 细胞培养管支架</td><td>Infors HT/ TPP</td><td>66129</td><td></td></tr><tr><td>培养箱 Minitron 50 mm</td><td>Infors HT</td><td>500043</td><td></td></tr><tr><td>LV-MAX 生产培养基</td><td>Gibco</td><td>A3583401</td><td></td></tr><tr><td>N-Tray 通用型</td><td>Infors HT/ TPP</td><td>31321</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep - 碘克沙醇</td><td>Serumwerk bernburg</td><td>1893</td><td></td></tr><tr><td>PEI MAX - 转染级线性聚乙烯亚胺盐酸盐（分子量 40,000）</td><td>Poly-sciences</td><td>24765-100</td><td></td></tr><tr><td>酚红溶液&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72420100</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇 8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-VirusGEN</td><td>Mirus</td><td>Mir 6706</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液，0.4%</td><td>Gibco</td><td>5250061</td><td></td></tr><tr><td>TubeSpin 生物反应器-50 mL</td><td>TTP</td><td>87050</td><td></td></tr><tr><td>TubeSpin 生物反应器-600 mL</td><td>TTP</td><td>87600</td><td></td></tr><tr><td>病毒生产细胞</td><td>Gibco</td><td>A35347</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 20 超滤管，截留分子量 100,000</td><td>Cytvia</td><td>28932363</td><td></td></tr></tbody></table>

利用hek293悬浮细胞生产高产量腺相关病毒载体批次

Production of High-Yield Adeno Associated Vector Batches Using HEK293 Suspension Cells

腺相关病毒载体（AAVs）是研究中枢神经系统（CNS）的有力工具。新型衣壳如 AAV.PHP.eB 可通过尾静脉注射在小鼠中实现 CNS 的广泛转导。为达到相当的转导效率，需使用至少 1 x 1011 基因拷贝数/小鼠）相比，直接注射到中枢神经系统实质中所需的剂量更低。在我们课题组中，AAV的制备（包括AAV.PHP.eB）依赖于贴壁培养的HEK293T细胞和三质粒共转染法。采用贴壁细胞获得高产量AAV的过程需要大量人力和材料投入。这一限制促使我们开发了一种基于锥形管的悬浮细胞培养方案。我们将贴壁细胞生产的AAV与悬浮培养法生产的AAV进行了比较，并对比了使用聚乙烯亚胺（Polyethylenimine）或TransIt转染试剂进行悬浮培养的效果。AAV载体通过碘克沙醇梯度超速离心法纯化，随后使用离心过滤装置进行缓冲液置换和浓缩。采用贴壁培养方法，我们平均获得了2.6 × 1012 总基因组拷贝数（GC），而悬浮法和聚乙烯亚胺（Polyethylenimine）获得的结果为7.7 × 1012 GC 总量，而 TransIt 产生了 2.4 × 1013 GC 总量。两者之间没有差异 体内 与贴壁细胞系统相比，悬浮细胞系统生产的载体的转导效率。综上所述，本文介绍了一种基于悬浮培养HEK293细胞的AAV生产方案，该方案可显著减少载体生产所需的时间和劳动投入，同时使用商业供应商提供的用于科研目的的组分，可获得高出3至9倍的产量。

大多数学术实验室使用贴壁的HEK293T细胞进行AAV生产8,9。当需要少量AAV用于直接注射时，这种方法效果相对较好；但若使用AAV.PHP.eB等全身性衣壳实现相似的转导效率，则需要高100倍的滴度（至少1 × 1011 GC/小鼠）。
本方案建立了在锥形管中悬浮培养HEK293细胞生产腺相关病毒（AAV）的方法。小规模培养可在50 mL管中进行，大规模培养则使用600 mL管。针对特定摇床（见材料表），可使用一种支架，最多可同时培养16根大管。该支架需与专用于50 mL管的特殊插件配合使用（图2A）。该系统显著缩短了本方案中细胞培养和转染阶段的操作时间。初始生产实验采用表达荧光素酶和绿色荧光蛋白（GFP）的报告基因质粒进行10,11。同时，按照先前发表的方案12，在12个15 cm2培养板中平行制备GFP载体。使用聚乙烯亚胺（PEI）转染时，平均总产量达到7.7 × 1012 GC；使用TransIt转染时，总产量为2.4 × 1013 GC（图2B）。与贴壁培养获得的滴度（2.6 × 1012）相比，PEI转染的产量提高了近3倍，TransIt转染则提高了9.2倍。在转染悬浮细胞时，TransIt的产量比PEI高出约3倍（图2B）。
随后，对AAV载体的性能进行了测试 体内GFP 载体使用 PEI 和 TransIt 制备，并与采用经典贴壁系统制备的 GFP 载体进行比较。注射后 4 周，处死小鼠（6 周龄 C57BL/6 雌性小鼠，体重 20–25 g），通过组织学方法评估小鼠脑组织中的 GFP 表达图3A）。在脑部矢状切片上进行了比较分析。使用这些制备方法产生的病毒在转导模式上未观察到差异。图3B）。还评估了使用任一方法产生的载体的荧光素酶活性。转导效率通过测定 体内 3周；无论使用哪种转染试剂，随时间变化的表达模式均相似（图4).
接下来，该方案由团队其他成员进行了测试和实施（表2）。使用PEI制备其他衣壳均获得成功，平均产量为3.5 × 1012 GC病毒载体。在B10衣壳的生产中，使用TransIt相比PEI可实现3倍的产量提升。在另一项研究中，多个构建体在AAv.PHP.eB中包装后平均产量达到3.7 × 1012，足以以每只小鼠5 × 1011 GC的剂量静脉注射7只小鼠。这些结果表明，该方案可被多位研究人员成功应用于不同的衣壳与构建体组合。
<img alt="细胞转染示意图：从接种到碘克沙醇纯化及病毒浓缩的过程步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66532/66532fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：生产的示意图概述。 第1天（D1），在300 mL管中培养细胞。第2天（D2），用相应的质粒转染细胞。第5天（D5），收集细胞并使用10倍Tween裂解缓冲液裂解。裂解后，通过离心去除细胞碎片。随后，将细胞裂解物过滤以去除大分子蛋白，并使用聚乙二醇（PEG）8000沉淀腺相关病毒（AAV）。第6天（D6），进行碘克沙醇梯度纯化和浓缩。将前一天获得的PEG浓缩物用DNase处理，然后进行碘克沙醇梯度离心。纯化后的载体随后使用离心过滤器进行脱盐和浓缩。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66532/66532fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用生物反应器设置进行细胞培养实验；图表显示不同方法的总AAV产量：贴壁培养、PEI、TransIT。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66532/66532fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：培养箱设置及AAV产量。 （A）病毒生产细胞在具有50 cm振荡直径的摇床培养箱中培养。该培养箱配备由机电部门制造的适用于600 mL管的适配板和适用于50 mL管的特殊插件。（B）在初始设置后，采用聚乙烯亚胺（PEI；总产量7.7 × 1012 GC，n=5）或TransIt（总产量2.4 × 1013 GC，n=5）作为转染方法，并与经典贴壁培养方法所得产量（总产量2.6 × 1012 GC，n=5）进行比较，贴壁方法详见Verhaagen等12。数据以均值±标准差表示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66532/66532fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因编辑过程、GFP表达分析、示意图、小鼠模型实验设计与结果" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66532/66532fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：转染后GFP表达模式 在体 评估 (A典型的AAV载体结构示意图，包含普遍性启动子CMV立即早期增强子、鸡β-肌动蛋白启动子和兔β-珠蛋白剪接受体位点（CAG），其后依次为绿色荧光蛋白（GFP）、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（WHV WPRE）和多聚腺苷酸化尾部（pA）13在此实验中，6周龄雌性小鼠（n=3）通过尾静脉注射接受含有5 x 1011 总基因组拷贝数（gc）/小鼠。注射后4周处死小鼠，取脑组织进行组织学分析。B代表性描绘了使用贴壁的HEK293T细胞和悬浮细胞，辅以聚乙烯亚胺（PEI）或TransIt转染试剂时，在矢状切面上的转导模式，无论采用何种制备方法，均观察到相似的转导模式。比例尺 = 1000 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66532/66532fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠基因编辑；生物发光成像；荧光素酶检测；实验示意图；柱状图分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66532/66532fig04v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图 4：不同转染方法下荧光素酶活性相似。（A）所用构建体的示意图，包含普遍性启动子CMV早期增强子、鸡β-肌动蛋白启动子和兔β-珠蛋白剪接受体位点（CAG）驱动的荧光素酶（LUC），带有V5标签以及牛生长激素多聚腺苷酸化尾（BGHpA）；每只小鼠经尾静脉注射总量为5 × 1011 GC（n=3），每周检测颅部区域（示例图像中以红色圈出）的生物发光信号以评估荧光素酶活性。（B）生物发光活性以相对光单位（RLU）表示，蓝色柱代表PEI制备组，棕色柱代表TransIt组。两组在选定脑区的荧光素酶活性之间无显著差异。数据以均值±标准差表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66532/66532fig04largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：转染参数。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66532/table%201_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2：本实验方案的产量。 其他研究人员用于生产AAV的悬浮培养方案。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66532/table%202_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

本文介绍了一种基于悬浮培养HEK293细胞的腺相关病毒（AAV）生产方案，该方法利用商业供应商提供的可用于研究目的的组分，减少了病毒载体生产所需的时间和劳动投入。

利用HEK293悬浮细胞生产高产量腺相关病毒载体批次

腺相关病毒载体（AAVs）是研究中枢神经系统（CNS）的有力工具。新型衣壳，如 AAV.PHP.eB，……

我们的实验室利用病毒载体作为将治疗性基因递送至受损神经系统的平台。近年来，已开发出多种能够穿越血脑屏障的非侵入性病毒载体。这些载体的应用需要高滴度，因此需要改进其生产工艺。采用我们的HEK293悬浮细胞操作流程，使该AAV制备方案相比其他基于贴壁细胞的系统更省力，同时获得更高的AAV载体产量。目前尚无治疗手段可修复中枢神经系统损伤。我们的目标是利用非侵入性病毒载体促进中枢神经系统的修复。本方案的优势在于，我们现在能够以高产量制备病毒载体，从而实现对受损中枢神经系统的无创治疗性基因递送。我们目前的研究将为开发针对多种神经退行性疾病（如多发性硬化症、帕金森病和阿尔茨海默病）的无创基因疗法铺平道路。首先，将培养 HEK293 细胞所需的所有材料置于洁净的生物安全柜中。解冻后，将冻存管中的 HEK293 细胞悬液转移至含有 30 毫升预热悬浮细胞培养基的 50 毫升离心管中。于 37 摄氏度、80% 湿度、8% 二氧化碳及 200 RPM 条件下培养细胞三至四天。取 100 微升细胞悬液加入 400 微升 0.4% 台盼蓝溶液中，轻轻颠倒混匀管壁。将50微升经台盼蓝处理的细胞悬液加入血细胞计数板。计数总活细胞数，并计算转染所需的细胞悬液量。将所需量的细胞悬液加入预热的悬浮细胞培养基中，在37摄氏度、8%二氧化碳条件下孵育。在300毫升悬浮细胞培养基中加入每毫升100万个HEK293细胞的细胞悬液，并在37摄氏度、8%二氧化碳条件下培养。第二天，将悬浮细胞培养基、质粒和转染试剂恢复至室温。将质粒加入已准备好的培养基中，短暂涡旋混匀。然后，加入转染试剂，再次短暂涡旋混匀，室温孵育30分钟。在转染混合物孵育期间，计数第一天培养的细胞，如有需要，将细胞密度调整至每毫升200万至250万个细胞。30分钟后，将转染混合物逐滴加入细胞中，同时轻轻摇动离心管使混合均匀，继续孵育72至96小时。第五天，向细胞中加入33毫升10X细胞裂解缓冲液，轻轻振荡混匀。将悬液在37摄氏度下振荡孵育1.5小时。在4摄氏度下以3,428×g离心细胞悬液60分钟。将上清液通过0.45微米PES真空滤器过滤，并将澄清的裂解液收集至滤器容器中。在360毫升过滤后的细胞裂解液中加入90毫升40% PEG 8,000溶液。向细胞裂解液中加入经70%乙醇灭菌的搅拌子，在冰上或冷室中以300 RPM的速度搅拌一小时。然后，在4 °C下静置孵育过夜，不进行搅拌。首先，将全部经聚乙二醇沉淀的腺相关病毒HEK293培养物转移至一个大型锥形管中。在4 °C下以2,820 ×g离心15分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于15毫升含钙和镁的PBS中。将重悬后的液体转移至50毫升离心管中。加入10毫升PBS以收集残留的PEG沉淀，并将全部液体转移至50毫升离心管中。然后，加入 40 µL DNase 1，在 37 °C 下孵育 1 小时。使用玻璃巴斯德吸管，将 15.5 mL 浓缩细胞裂解液加入一支 25 mm × 89 mm 的聚碳酸酯离心管中。使用一支新的玻璃巴斯德吸管，将 9 mL 15% 碘克沙醇溶液轻轻注入细胞裂解液下方。然后，加入5 mL的25%和40%碘克沙醇溶液。最后，加入5 mL的60%碘克沙醇溶液。用注射器以PBS补满离心管，确保在不扰动碘克沙醇各层的前提下尽量去除气泡。使用电动封管机密封离心管。检查碘克沙醇各梯度层是否清晰可见。将离心管置于固定角转子离心机中，在16摄氏度下以490,000×g离心1小时10分钟。离心后，将离心管组装到一个金属夹具中。在注射器上安装一支19号针头。接着，使用30号针头在离心管顶部刺一个小孔，并保持针头插入状态。在酚红指示剂所示的40%与60%碘克沙醇界面下方小心穿刺管壁。确保针头斜面朝向40%层。用非优势手取下30号针头，同时缓慢吸取病毒与碘克沙醇的混合液。大约进行到一半时，将针头旋转，使斜面朝下，继续提取，避免从蛋白层中收集。提取后，立即将超速离心管转移至一个50毫升离心管中并弃去。将收集的AAV碘克沙醇悬浮液加入一个15毫升离心管中，并用PBS稀释五倍，定容至15毫升。将悬液转移至离心过滤管中，在4°C条件下以3,428 × g离心10分钟。弃去滤过液后，向滤渣中加入15毫升含5%蔗糖的PBS缓冲液并重悬。从离心过滤管中收集浓缩的AAV。最后，将病毒分装样品在4°C下保存，最长可保存三个月。

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科研

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神经科学

使用 HEK293 悬浮细胞生产高产腺相关载体批次

重组腺相关病毒（rAAVs）载体在动物体内研究中正变得越来越重要。in vivo...

重组腺相关病毒载体的制备与滴定

来源：Ehrke-Schulz, E., 等. 基于人5型腺病毒的高容量腺病毒载体的克隆与大规模生产。J. Vis. Exp.

大规模生产高容量腺病毒载体

介绍了一种生成高容量腺病毒载体的方案，该载体缺失所有病毒编码序列。载体基因组中转基因的克隆基于归巢核酸内切酶技术。病毒在贴壁生长或悬浮培养的生产细胞中的扩增依赖于提供病毒基因反式表达的辅助病毒。...

基于人5型腺病毒的高容量腺病毒载体的克隆与大规模生产

在此，我们介绍一种高效且可重复的策略，用于生产、滴定和质控腺相关病毒载体批次。该方法可使使用者获得高滴度的载体制备物 （≥1 × 1013 病毒基因组/毫升）和高纯度，可直接用于 体外 或 体内...

基于腺相关病毒载体的生产、纯化与质量控制

本文介绍了一种利用pAdEasy系统制备腺病毒的实验方案。该技术包括pAdTrack与pAdEasy-1质粒的重组、腺病毒的包装与扩增、从细胞裂解物和培养基中纯化腺病毒颗粒、病毒滴度测定以及腺病毒的功能验证。...

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本文提供了一种利用细胞工厂中培养的贴壁型HEK 293细胞及亲和层析纯化方法大规模制备研究级腺相关病毒（AAV）载体的详细操作流程。该方案可稳定获得 &gt;1 × 1013 拷贝/mL...

用于大型动物模型临床前研究的腺相关病毒载体在细胞叠层中的生产

重组腺相关病毒（rAAV）被广泛用于临床和临床前基因递送。rAAV 一个尚未受到足够重视的用途是，无需纯化即可高效转导培养细胞。针对初次接触 rAAV...

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利用HEK293悬浮细胞生产高产量腺相关病毒载体批次

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