利用HEK293悬浮细胞生产高产量腺相关病毒载体批次

我们的实验室利用病毒载体作为将治疗性基因递送至受损神经系统的平台。近年来，已开发出多种能够穿越血脑屏障的非侵入性病毒载体。这些载体的应用需要高滴度，因此需要改进其生产工艺。

采用我们的HEK293悬浮细胞操作流程，使该AAV制备方案相比其他基于贴壁细胞的系统更省力，同时获得更高的AAV载体产量。目前尚无治疗手段可修复中枢神经系统损伤。我们的目标是利用非侵入性病毒载体促进中枢神经系统的修复。

本方案的优势在于，我们现在能够以高产量制备病毒载体，从而实现对受损中枢神经系统的无创治疗性基因递送。我们目前的研究将为开发针对多种神经退行性疾病（如多发性硬化症、帕金森病和阿尔茨海默病）的无创基因疗法铺平道路。首先，将培养 HEK293 细胞所需的所有材料置于洁净的生物安全柜中。

解冻后，将冻存管中的 HEK293 细胞悬液转移至含有 30 毫升预热悬浮细胞培养基的 50 毫升离心管中。于 37 摄氏度、80% 湿度、8% 二氧化碳及 200 RPM 条件下培养细胞三至四天。取 100 微升细胞悬液加入 400 微升 0.4% 台盼蓝溶液中，轻轻颠倒混匀管壁。

将50微升经台盼蓝处理的细胞悬液加入血细胞计数板。计数总活细胞数，并计算转染所需的细胞悬液量。将所需量的细胞悬液加入预热的悬浮细胞培养基中，在37摄氏度、8%二氧化碳条件下孵育。

在300毫升悬浮细胞培养基中加入每毫升100万个HEK293细胞的细胞悬液，并在37摄氏度、8%二氧化碳条件下培养。第二天，将悬浮细胞培养基、质粒和转染试剂恢复至室温。将质粒加入已准备好的培养基中，短暂涡旋混匀。

然后，加入转染试剂，再次短暂涡旋混匀，室温孵育30分钟。在转染混合物孵育期间，计数第一天培养的细胞，如有需要，将细胞密度调整至每毫升200万至250万个细胞。30分钟后，将转染混合物逐滴加入细胞中，同时轻轻摇动离心管使混合均匀，继续孵育72至96小时。

第五天，向细胞中加入33毫升10X细胞裂解缓冲液，轻轻振荡混匀。将悬液在37摄氏度下振荡孵育1.5小时。在4摄氏度下以3,428×g离心细胞悬液60分钟。

将上清液通过0.45微米PES真空滤器过滤，并将澄清的裂解液收集至滤器容器中。在360毫升过滤后的细胞裂解液中加入90毫升40% PEG 8,000溶液。向细胞裂解液中加入经70%乙醇灭菌的搅拌子，在冰上或冷室中以300 RPM的速度搅拌一小时。

然后，在4 °C下静置孵育过夜，不进行搅拌。首先，将全部经聚乙二醇沉淀的腺相关病毒HEK293培养物转移至一个大型锥形管中。在4 °C下以2,820 ×g离心15分钟。

弃去上清液，将沉淀物重悬于15毫升含钙和镁的PBS中。将重悬后的液体转移至50毫升离心管中。加入10毫升PBS以收集残留的PEG沉淀，并将全部液体转移至50毫升离心管中。

然后，加入 40 µL DNase 1，在 37 °C 下孵育 1 小时。使用玻璃巴斯德吸管，将 15.5 mL 浓缩细胞裂解液加入一支 25 mm × 89 mm 的聚碳酸酯离心管中。使用一支新的玻璃巴斯德吸管，将 9 mL 15% 碘克沙醇溶液轻轻注入细胞裂解液下方。

然后，加入5 mL的25%和40%碘克沙醇溶液。最后，加入5 mL的60%碘克沙醇溶液。用注射器以PBS补满离心管，确保在不扰动碘克沙醇各层的前提下尽量去除气泡。

使用电动封管机密封离心管。检查碘克沙醇各梯度层是否清晰可见。将离心管置于固定角转子离心机中，在16摄氏度下以490,000×g离心1小时10分钟。

离心后，将离心管组装到一个金属夹具中。在注射器上安装一支19号针头。接着，使用30号针头在离心管顶部刺一个小孔，并保持针头插入状态。

在酚红指示剂所示的40%与60%碘克沙醇界面下方小心穿刺管壁。确保针头斜面朝向40%层。用非优势手取下30号针头，同时缓慢吸取病毒与碘克沙醇的混合液。

大约进行到一半时，将针头旋转，使斜面朝下，继续提取，避免从蛋白层中收集。提取后，立即将超速离心管转移至一个50毫升离心管中并弃去。将收集的AAV碘克沙醇悬浮液加入一个15毫升离心管中，并用PBS稀释五倍，定容至15毫升。

将悬液转移至离心过滤管中，在4°C条件下以3,428 × g离心10分钟。弃去滤过液后，向滤渣中加入15毫升含5%蔗糖的PBS缓冲液并重悬。从离心过滤管中收集浓缩的AAV。

最后，将病毒分装样品在4°C下保存，最长可保存三个月。