Name: 斑马鱼胚胎中小胶质细胞动力学的实时成像和表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: 了解斑马鱼胚胎中小胶质细胞动力学的实时成像方法。利用快速扫描共聚焦显微镜和Imaris软件追踪细胞运动与形态变化，为研究大脑发育中的神经免疫细胞行为提供有效工具。

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作者谨向Nicolas Bayens教授致以诚挚的感谢，感谢他慷慨提供了本研究所必需的共聚焦显微镜的使用权限。&#160;本工作部分由比利时科学基金（FNRS）资助，资助编号为F451218F和UG03019F；阿尔茨海默病研究基金会（SAO-FRA）（资助对象：V.W.）；A.M. 获得了FNRS研究奖学金的支持。图 1&#160;在biorender.com上制作。

斑马鱼的饲养遵循FELASA42以及机构（比利时布鲁塞尔自由大学，比利时布鲁塞尔；ULB）的指南和规定。所有实验程序均经布鲁塞尔自由大学动物福利伦理委员会（CEBEA）批准。
1. 斑马鱼饲养与胚胎制备
注意：本方案中所示的追踪数据使用了在巨噬细胞（包括小胶质细胞）中表达荧光 eGFP 蛋白的转基因斑马鱼品系 Tg(mpeg1:eGFP)gl22 获得。其他巨噬细胞报告品系可从 ZIRC 获取并同样适用。在选择转基因品系时，需注意较高的信号强度将有助于图像采集和细胞分割。
<ol>
	<li>在 28 °C 条件下饲养斑马鱼（Danio rerio），并按照既定方案进行管理11。</li>
	<li>在预期胚胎出生日期的前一天傍晚，将雌鱼和雄鱼共同放入带有网状底部和隔离板的繁殖缸中，以诱导交配。次日早晨移除隔离板，以控制鱼类交配时间。</li>
	<li>使用滤网收集受精卵，并将其转移至含有 E3 培养基（5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4）和 0.01% 亚甲蓝的 100 mm 培养皿中。根据所用转基因斑马鱼品系的遗传背景，若需抑制色素形成以利于成像，则从受精后 6 小时（hpf）开始，在胚胎发育所用的 E3 缓冲液中添加 0.003% 的 N-苯硫脲（PTU），并每 2 天更换一次溶液，直至达到目标发育阶段。 
	注意：为避免 PTU 长时间暴露可能对胚胎发育造成的影响12，建议在条件允许时使用色素缺陷型遗传背景的转基因品系（如 Casperw2），此类品系可在无需长期暴露于 PTU 的情况下实现清晰成像13。</li>
	<li>若待成像胚胎的年龄小于受精后 3 天（dpf），则在 24 hpf 时去除卵膜。使用体视显微镜确认所有胚胎均已成功去膜，并且未因酶处理而受损（见步骤 1.4.2）。
	<ol>
		<li>若卵子数量较少，可使用精细解剖镊手动操作：轻压卵膜并向外拉扯，小心地将每个胚胎从卵膜中释放出来。</li>
		<li>若卵子数量较多，可采用酶法批量去膜：将卵子置于室温（RT）下，用含 1 mg/mL 蛋白酶（Pronase）的 E3 溶液孵育短暂时间（通常为 5–10 分钟，直至在轻轻晃动下卵膜破裂）。随后弃去蛋白酶溶液，并用新鲜 E3 溶液彻底冲洗胚胎 3 次，以去除残留卵膜及酶液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 斑马鱼固定
<ol>
	<li>在 E3 缓冲液中配制 1% 的低熔点琼脂糖溶液。将琼脂糖置于台式加热块中冷却至 37 °C，并加入新配制的三卡因甲磺酸盐溶液（160 mg/L），以帮助在成像过程中保持胚胎处于麻醉状态。涡旋混匀溶液，确保充分均质。</li>
	<li>向盛有胚胎的 E3 缓冲液培养皿中加入 160 mg/L 的三卡因甲磺酸盐溶液以麻醉胚胎。检查确认胚胎运动已停止，并挑选出具有目标荧光信号的斑马鱼胚胎。使用明场体视显微镜观察胚胎心跳，评估其健康状况。使用宽口移液吸头吸取一至三条选定的胚胎，转移至底部为玻璃的成像培养皿中。</li>
	<li>在体视显微镜下，用移液器尽可能吸除培养基，注意避免触碰或损伤胚胎；随后用先前配制的 1% 低熔点琼脂糖溶液替换原有培养基。接着，将固定在解剖针末端的塑料细锥形吸头用于轻柔地将每条胚胎推至成像培养皿底部，并调整其方向，使胚胎背侧朝向玻璃，以确保获得良好的视顶盖视野，并尽量减少胚胎与玻璃之间低熔点琼脂糖的厚度。</li>
	<li>立即使用配备高质量平场复消色差物镜的倒置共聚焦显微镜对固定好的胚胎进行成像（此处使用 10x/0.45 Plan Apo 或 20x/0.75 Plan Apo 物镜）。若时间序列成像将持续较长时间（超过一小时），可在底部为玻璃的成像培养皿中添加一至两滴含三卡因甲磺酸盐（160 mg/L）的 E3 缓冲液，以防止低熔点琼脂糖过度干燥。 
	注意：必须等待琼脂糖完全凝固后，再向成像培养皿中添加 E3 缓冲液和三卡因甲磺酸盐溶液；否则，胚胎可能在后期发生横向和轴向缓慢移动，导致时间序列成像中出现样本漂移。</li>
	<li>开始设置所需时长的时间序列图像采集：将图像分辨率设为 1,024 × 1,024，像素大小为 0.49 µm。以 2–3 µm 的步长采集 Z 轴光学切片，以确保 Z 轴方向具备可接受的分辨率。在斑马鱼胚胎中，根据所用发育阶段，将视顶盖区域包含在 100–150 µm 的 Z 轴堆栈范围内。为确保细胞追踪成功，帧间时间间隔应保持在 30 秒至 60 秒之间。</li>
</ol>
3. 追踪分析与数据导出
<ol>
	<li>使用 Imaris 文件转换软件将延时文件转换为 IMS 格式（参见 材料表）。启动软件后，可将文件拖放到输入区域，或使用 添加文件… 按钮以手动选择它们。在 输出 菜单中指定转换后文件的保存位置，可选择与输入文件相同的文件夹，或指定一个特定文件夹。通过点击确认所显示的体素尺寸的数值正确无误 设置体素大小 按钮，确认体素大小后，按压 开始全部 按钮以开始文件转换（参见 补充文件 1 有关所有数据分析的分步指南）。 
	注意：如果同时对两个或多个胚胎进行延时成像，文件将被自动拆分为单个位置，每个胚胎分别保存为不同的文件。软件支持批量模式操作，可同时上传并转换多个文件。IMS 文件将在选定的目标文件夹或输入文件所在文件夹中生成并保存。</li>
	<li>启动后，让分析软件开始运行 竞技场；单击 观察文件夹 打开先前已转换的文件。文件加载到软件后，使用 切片 使用滑块浏览z轴堆栈图像 切片工具栏 位于左侧的 观察区域，使用指针工具通过绘制所选细胞的直径来测量部分细胞的直径。单击并拖动鼠标绘制一条贯穿细胞核心的线段；观察所绘制线段的长度 测量工具栏，位于右侧的 观察区域. 
	注意：使用步骤 2.5 中的成像设置，细胞体直径预计在 6 µm 至 8 µm 之间。</li>
	<li>要自动检测细胞，请返回到 3D 视图 并点击 斑点图标 在 对象工具栏 添加一个新的 斑点 对象列表中的对象并打开自动 斑点生成向导在向导的第一步中，勾选仅分割感兴趣区域的选项。然后，启用 随时间追踪斑点 计算追踪数据的选项， 以及对象-对象统计结果 以便在点样之间进行比较，并扩展后续分析中可用的数据范围。最后，通过单击向导中的下一步继续操作 下一步 向导窗口右下角的按钮</li>
	<li>在第二步中，确定一个包含胚胎视顶盖的感兴趣区域（ROI）。通过点击并拖动 ROI 各面上的小白箭头来调整 ROI 的大小。定义 ROI 大小后，通过调整时间间隔将其应用到所有记录的帧中。</li>
	<li>然后，选择作为 来源频道 用于检测细胞的通道，并将步骤 3.2 中先前获得的细胞直径测量值设置为 估计的 XY 直径. 启用 背景扣除 选项并点击 下一步.</li>
	<li>此时 点样创建向导，该软件包含一个质量筛选步骤，其中根据每个点中心处测得的信号强度，在检测到点的通道中对点进行筛选。调整 强度阈值 通过直接在数据字段中输入数值 较低 和 上限阈值框 或通过拖动底部直方图中对应颜色的线条 创建向导，以便检测所有细胞，包括位于组织较深层且通常信号强度较低的细胞。所有这些变化均可同时在 观察区域. 
	注意：此时可能观察到多个斑点标记同一个细胞，但这一问题可在后续分析中进行校正。 
	在较长时间的延时成像中，若观察到部分光漂白现象，请检查 观察区域 在设置阈值前，应检查多个帧，以确保所有细胞在最近且信号较弱的帧中也能被检测到。</li>
	<li>确认无误后，点击 下一步 以验证所选的质量阈值。所有满足质量阈值参数且直径与估计的XY直径相匹配的斑点将被标记为一个斑点。在预览中可视化显示此结果。 观察区域，满足这两个参数的斑点将叠加在源通道上。</li>
	<li>下一步，选择 自回归运动 使用追踪算法来追踪具有相对连续运动的细胞。通过仔细观察两帧之间斑点的运动，判断细胞在两个时间点之间移动的最长距离，并在其中输入估计数值 最大距离 该距离表示斑点允许偏离其预测未来位置的范围。</li>
	<li>设置 最大间隙 大小设置为斑点可能消失但不中断轨迹的最少时间点数。如果帧间间隔为 60秒以下，使用一个 3 的大小如果帧间时间间隔较长，可增大允许的最大间隙大小，以减少轨迹碎片化。</li>
	<li>启用 用所有检测到的物体填充空隙 将检测阈值降低至接近跟踪算法预测的预期位置，以连接因斑点检测失败而中断的轨迹。最后，点击 下一步 并让软件自动为所有先前生成的斑点生成轨迹。</li>
	<li>如果获得的轨迹数量过多或过于零散，请返回前一步骤 创建向导，通过点击 上一步 按钮，并调整先前定义的最大距离，通过增加或减少数值，使获得的大多数轨迹能够代表细胞运动。 
	注意：轨迹数量应大致与小胶质细胞数量相匹配，因此介于 30 和 50，具体数量取决于胚胎的年龄。然而，在分析完成之前，由于存在错误的轨迹，预期数值会更高。</li>
	<li>一旦计算出轨迹，软件将执行过滤步骤，以剔除所有持续时间极短的轨迹，因为这些轨迹通常不准确或缺乏信息价值。通过在数据字段中直接输入数值，排除短于3-8分钟（min）的轨迹 下限 轨迹持续时间滤波器的设置，或通过拖动底部直方图中对应颜色的线条来完成 创建向导. 点击 下一步 验证筛选器并在创建向导中继续下一步。 
	注意：如前所述，通过调整最大（max）和最小（min）轨迹持续时间阈值，可预览将被过滤并从分析中排除的轨迹。随后，可将过滤后的轨迹复制到新对象中以进行进一步分析。具体的过滤时间阈值可能因先前结果而异 创建向导 步骤。我们建议通过查看预览来微调这些滤镜设置 观察区域 为获得最佳结果。</li>
	<li>自从 Tg(mpeg1:eGFP) 转基因品系可标记所有单核吞噬细胞，因此在延时成像视频中除小胶质细胞外，皮肤巨噬细胞也会被检测到。请手动从分析中剔除由皮肤巨噬细胞产生的轨迹，以专注于脑实质小胶质细胞的分析图3).</li>
	<li>手动校正轨迹中其他可能的错误 轨迹编辑器，其中每个数据点均以轨道中的对象形式显示。激活 圆形选择模式 右侧的按钮 观察区域 并突出显示需要修改或调整的轨道。选择有问题的轨道后，使用 连接 和 断开连接 按钮，编辑以准确表示细胞运动。使用 轨迹编辑器 同时选择并删除那些错误地代表同一细胞的重复单个斑点或微小轨迹片段，方法是使用 圆形选择模式 并按压 癌症 或 删除 以消除它们。 
	注意：如果追踪参数设置正确，仅有小部分被追踪的细胞需要执行此步骤。</li>
	<li>如果将小胶质细胞报告基因品系与标记实质中其他细胞类型的荧光转基因联用，可通过创建新的表面对象或点状对象进行分割以实现可视化。操作时，重复上述步骤（从步骤3.2至3.14），并根据需要进行修改。 来源频道 步骤3.5中输入的参数将用于成像第二个细胞群体，需注意调整与目标细胞相关的特定描述性参数 估计的 XY 直径 （步骤 3.5）， 最大距离 （步骤 3.8）至新的细胞群体。其他步骤可无需更改地重复进行。 
	注意：若为新表面的创建， 估计的 XY 直径 基于阈值的选项所替代 背景扣除， 输入应为 能放入物体内的最大球体的直径. 该值可通过切片视图进行估算 测量工具栏 如步骤 3.2 所述。</li>
	<li>一旦对获得的轨迹满意，即可从中提取所需的追踪统计信息 统计学 标签。单击该标签 设置 按钮，选择将为此前创建的每个点对象或表面对象计算哪些统计量。如果在同一分析中创建了多个对象，例如两个点对象，或一个点对象和一个表面对象，则还可导出描述对象间相对位置的统计量，例如两者之间的最短距离。 
	注意：所有期望值可以是特定值或平均值，所有原始数据均可通过页面底部的按钮以逗号分隔值（CSV）文件格式下载 统计学 表。如果分析还包含其他细胞类型，则将提供关于一个对象相对于另一个对象的相对距离的额外统计信息。</li>
</ol>

Elucidating Microglia Behavior in Zebrafish Optic Tectum Development

<ol><li>Wolf, S. A., Boddeke, H. W., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Microglia in physiology and disease.</a> Annu Rev Physiol. 79, 619-643 (2017).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Sci Rep. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li>
<li>Peri, F., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuronal+degradation+by+microglia+reveals+a+role+for+v0-ATPase+a1+in+phagosomal+fusion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo.</a> Cell. 133 (5), 916-927 (2008).</li>
<li>Marın-Teva, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+promote+the+death+of+developing+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia promote the death of developing Purkinje cells.</a> Neuron. 41 (4), 535-547 (2004).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li>
<li>Hattori, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microglia-blood+vessel+interactions+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">The microglia-blood vessel interactions in the developing brain.</a> Neurosci Res. 187, 58-66 (2023).</li>
<li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+function+in+the+central+nervous+system+during+health+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration.</a> Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).</li>
<li>Xu, H. -T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).</li>
<li>Shin, J., Park, H. -C., Topczewska, J. M., Mawdsley, D. J., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+cell+fate+analysis+in+zebrafish+using+olig2+BAC+transgenics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Neural cell fate analysis in zebrafish using olig2 BAC transgenics.</a> Methods Cell Sci. 25 (1), 7-14 (2003).</li>
<li>Chi, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxn4+directly+regulates+tbx2b+expression+and+atrioventricular+canal+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Foxn4 directly regulates tbx2b expression and atrioventricular canal formation.</a> Genes Dev. 22 (6), 734-739 (2008).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+An+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196(2012).</li>
<li>Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenothiourea+sensitizes+zebrafish+cranial+neural+crest+and+extraocular+muscle+development+to+changes+in+retinoic+acid+and+IGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling.</a> PLoS ONE. 6 (8), e22991(2011).</li>
<li>Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+time-lapse+imaging+of+transgenic+zebrafish%3A+visualizing+retinal+stem+cells+activated+by+targeted+neuronal+cell+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation.</a> J Vis Exp. (43), e2093(2010).</li>
<li>Ferrero, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+microglia+derive+from+primitive+macrophages+and+are+replaced+by+cmyb-dependent+definitive+microglia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Embryonic microglia derive from primitive macrophages and are replaced by cmyb-dependent definitive microglia in zebrafish.</a> Cell Rep. 24 (1), 130-141 (2018).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案可实现 体内 脊椎动物胚胎中小胶质细胞动态的成像及获得的运动性数据的可视化。小胶质细胞在发育中的大脑中的定植发生于胚胎发生的早期阶段，并早于神经发生、星形胶质细胞发生、少突胶质细胞发生及其他多种细胞过程等关键事件的高峰期17因此，小胶质细胞在调控脑发育的特定方面发挥着重要作用也就不足为奇了18，例如通过调控神经元的分化、迁移和存活19,20,21以及突触修剪5&#160;和髓鞘形成22,23,24.
功能失调的小胶质细胞在神经发育障碍的发病机制和/或进展中的作用也正日益受到关注25。事实上，小胶质细胞在发育中大脑的早期出现使其暴露于不同的生理状态26&#160;和环境变化之中。考虑到小胶质细胞在啮齿类动物和人类中均为长寿命细胞，并通过局部前体细胞的自我更新在生命周期中持续维持27,28,29，这种暴露可能产生显著影响。我们认为，本方案可作为一种有力工具，用于更深入地表征小胶质细胞在脑形态发生的各个连续阶段中，随着其发育、成熟并建立网络时，在不同生理状态下的行为特征。
利用此处所述的实验装置，我们已成功对长达6天龄的斑马鱼幼鱼进行了成像并获取了数据。将分析扩展至更晚的发育阶段也可能取得成功，但需要调整成像装置，以考虑样本尺寸的增加，尤其是沿z轴方向的增大。在尝试此类扩展时，我们建议重点关注保持较低的信噪比和快速的扫描时间，因为这些是成功分析的关键参数。
建议最少成像时间为1小时，以实现小胶质细胞的追踪；本方案已测试的最长成像窗口为8小时。此外，为便于追踪分析，应尽可能缩短帧间时间间隔，理想范围为30秒至60秒。这将有助于在后续分析中获得更准确、更详细的追踪数据。因此，特别是在检测多个荧光染料时，必须避免光谱重叠，确保两种荧光染料发射光谱之间有足够的分离度，以实现同时采集且无信号串扰。
已有其他可用于高质量斑马鱼大脑延时成像的实验方案30，但本方案是首个能够成功在较长时间内追踪胚胎发育过程中所有小胶质细胞运动的方法。尽管本文所述工作流程主要聚焦于生理条件下小胶质细胞的追踪，但其同样可轻松应用于病理状态下小胶质细胞的分析。事实上，斑马鱼中已建立了多种神经发育障碍模型，例如自闭症31、癫痫32和精神分裂症33，以及神经退行性疾病34&#160;和癌症35，这些模型为研究疾病状态下小胶质细胞的反应与行为提供了独特的机会。
值得注意的是，该追踪方案具有高度的通用性，也可用于阐明各种细胞类型在斑马鱼胚胎不同解剖区域中的迁移模式，从而可能拓展出本文所述小胶质细胞研究范围之外的其他应用。此外，通过整合多种荧光转基因品系的能力，我们能够分辨小胶质细胞与脑微环境中其他细胞类型之间的空间关系，并以非侵入性的方式在延时成像记录中可视化细胞间的相互作用与信号交流。这有助于揭示小胶质细胞行为的生理意义，并推动对这些高度迁移性细胞的更深入表征。

作为中枢神经系统（CNS）中的常驻巨噬细胞，小胶质细胞是一类独特的非神经元细胞群体，在成年大脑所有胶质细胞中可占到15%。近年来，由于小胶质细胞在发育、生理和疾病中的重要作用已被证实，其生物学研究受到越来越多的关注1。在生理条件下，小胶质细胞具有高度动态性，持续地对脑实质进行巡查2,3。这种行为使小胶质细胞能够定植于大脑，并在脑发育过程中发挥关键作用，例如塑造神经元回路4、突触修剪5以及血管发生6。此外，这种固有的动态特性还使小胶质细胞能够持续监测中枢神经系统是否存在感染、损伤或任何偏离稳态的迹象7。为了深入解析这些复杂的细胞动态过程，对小胶质细胞在时空维度上的活体成像至关重要。幸运的是，体外发育的斑马鱼胚胎具有良好的光学通透性，同时存在多种已充分表征的转基因报告品系，可对小胶质细胞进行荧光标记，这使得斑马鱼成为此类研究的理想脊椎动物模型。在斑马鱼胚胎中进行活体成像是一种非侵入性方法，无需手术或复杂的组织操作，从而最大程度地减少了对中枢神经系统状态的潜在干扰。这一点在研究小胶质细胞时尤为关键，因为它们对外部微环境的细微变化极为敏感8。
在此，我们提供了一种成功追踪斑马鱼胚胎中三维小胶质细胞运动的指南，从而以前所未有的视角观察小胶质细胞在发育中脑实质完整结构内的行为（参见 图1&#160;有关该方案的图示概览）。本逐步操作方案详细介绍了如何建立并成像斑马鱼在不同发育阶段的小胶质细胞，以及如何提取小胶质细胞运动性的高分辨率数据，从而深入揭示其迁移模式及对环境信号的响应。我们还展示了该方案可进行调整以实现活体多色成像，因而可进一步扩展应用于结合标记邻近细胞（包括神经元）的转基因品系，共同研究小胶质细胞3少突胶质细胞9和内皮细胞10&#160;（如图所示） 图2通过扩展研究工具，使人们能够直接观察和表征小胶质细胞行为的动力学特征&#160;在生理和疾病状态下，该方案有望通过实时观察自然环境中的小胶质细胞，进一步阐明其在早期发育过程中的功能。

<table><tbody><tr><td>1 L 繁殖缸</td><td>Tecniplast</td><td>ZB10BTE</td><td></td></tr><tr><td>1-苯基-2-硫脲（PTU）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td>用 E3 培养基稀释至 0.2 mM，以防止胚胎色素沉积</td></tr><tr><td>底部玻璃成像皿</td><td>FluoroDish</td><td>FD3510-100</td><td></td></tr><tr><td>一次性刻度移液管</td><td>avantor</td><td>16001-188</td><td></td></tr><tr><td>干式恒温块加热器</td><td>Novolab</td><td>Grant QBD4</td><td>用于将低熔点琼脂糖维持在 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（Tricaine）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 10.0</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>分析软件</td></tr><tr><td>Imaris 文件转换器</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>https://imaris.oxinst.com/big-data</td></tr><tr><td>激光扫描共聚焦显微镜</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti2-E</td><td></td></tr><tr><td>亚甲蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140-25G</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器加载吸头（microloader tips）</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>NuSieve GTG 琼脂糖</td><td>Lonza</td><td>&amp;nbsp;50081</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（90 mm）</td><td>avantor</td><td>391-0559</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K（Pronase）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11459643001</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;不锈钢镊子 Dumont No. 5</td><td>FineScienceTools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>Leica M80</td><td>用于胚胎固定操作</td></tr><tr><td>解剖针（teasing needle）</td><td>avantor</td><td>76549-024</td><td></td></tr></tbody></table>

活体成像与斑马鱼胚胎小胶质细胞动态的表征

Live Imaging and Characterization of Microglia Dynamics in the Zebrafish Embryo

小胶质细胞是高度动态的细胞，其向脑实质的迁移和定植是大脑正常发育与功能实现的关键步骤。体外发育的斑马鱼胚胎具有光学透明性，结合已充分表征的、可荧光标记小胶质细胞的转基因报告品系，使斑马鱼成为研究此类过程的理想脊椎动物模型。本文利用斑马鱼模型的独特优势，对小胶质细胞的动态行为进行可视化观察。 体内 在生理条件下，我们利用共聚焦显微镜记录斑马鱼胚胎视顶盖中小胶质细胞的时间序列图像，随后使用 IMARIS 10.0 软件提取追踪数据，以获得小胶质细胞在不同发育阶段的迁移路径、平均速度及在视顶盖中的分布情况。该实验方案可作为阐明小胶质细胞行为在多种生理背景下功能意义的有效工具，有助于更深入地表征这些高度运动性细胞的特性。

根据所述方案，对表达绿色荧光蛋白（eGFP）的小胶质细胞和表达DsRed的内皮细胞的Tg(mpeg1:eGFPgl22; kdrl:cres898; actb2:loxP-STOP-loxP-DsRedexpress,sd5)三重转基因胚胎在3 dpf时进行成像14。单个斑马鱼胚胎被固定在底部为玻璃的培养皿中的1%低熔点琼脂糖中，成像过程在采集期间未影响胚胎的正常发育。时间序列成像使用商用点扫描共聚焦显微系统完成，配备10倍0.45 NA干式物镜，分别采用488 nm和561 nm激发激光对小胶质细胞和内皮细胞进行成像。此外，时间间隔、图像分辨率、像素大小和z轴步进分别为30秒（s）、1024×1024、0.49 µm和2.5 µm。时间序列记录持续3.5小时（h）。
所获取的视野覆盖了胚胎的整个头部，但分析重点集中在视顶盖区域，因为在发育的第一周内，小胶质细胞主要局限于中脑背侧该区域的神经元胞体层，从而使研究者能够同时观察到整个细胞群体15。三维追踪分析使用 Imaris 10.0 软件进行，方法如上所述。如图4所示，追踪成功，共获得25条轨迹，与3 dpf时视顶盖中预期存在的小胶质细胞数量相符16。仅需极少的手动轨迹校正。图5展示了一次成功追踪实验所能提取数据的示例。巨噬细胞与内皮细胞的同时标记使得研究人员能够量化小胶质细胞相对于后者的空间位置，从而随时间可视化每个细胞与最近内皮细胞之间的相对距离，并分析潜在相互作用的发生频率和数量（图5）。
<img alt="胚胎准备与固定示意图；细胞追踪研究的成像及数据分析步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66533/66533fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：实验流程概览。（A）斑马鱼胚胎的准备与麻醉。（B）样品的固定与定位。（C）图像采集。（D）图像处理与运动性数据提取。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="神经和细胞成像、荧光显微镜、斑马鱼脑、神经元、巨噬细胞、光学分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66533/66533fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：斑马鱼胚胎中小胶质细胞的成像及其与脑内细胞环境的相互作用。（A）3 dpf 斑马鱼胚胎头部和脑的明场图像（背侧视图），标注了视顶盖和后脑。由于胚胎斑马鱼脑体积小且具有光学透明性，此阶段可对其进行整体成像。（B-D）通过使用转基因品系，如（B,C）Tg(mpeg1:eGFP)gl22 和（D）Tg(mpeg1:mcherry)gl23，并聚焦于视顶盖（OT），可观察小胶质细胞的位置和行为。（B）利用报告基因品系 Tg(XlTubb:DsRed)zf148 可识别神经元及其细胞体，并通过共表达两种转基因的品系合并双通道图像，可视化小胶质细胞与神经元的相互作用。图中显示绿色（小胶质细胞）和红色（神经元，以品红色显示）信号的合并图像。（C,D）报告基因品系还可揭示小胶质细胞（绿色）与内皮细胞的相互作用，此处使用（C）双转基因 Tg(kdrl:cres898; actb2:LOXP-STOP-LOXP-Dsredexpress, sd5）以红色标记内皮细胞；或与胶质细胞（如少突胶质细胞及其前体细胞）的相互作用，使用（D）双转基因 Tg(olig2:EGFP; mpeg1:mcherry) 品系。1：视顶盖中的少突胶质细胞及其前体细胞；2：小脑中的广树突神经元。比例尺 = 50 µm。缩写：dpf = 受精后天数；OT = 视顶盖；HB = 后脑。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="三维荧光显微镜；细胞结构分析；亚细胞蛋白定位；图像拼接" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66533/66533fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图33天斑马鱼胚胎中皮肤巨噬细胞与小胶质细胞的形态学与空间分布差异 (A，B背侧视图 Tg(mpeg1:eGFPgl22 3 天龄斑马鱼胚胎，显示（A) 实质性小胶质细胞（由品红色星号标记）与皮肤巨噬细胞（白色星号标记），根据其在z轴方向上的相对位置进行鉴别，如（B），显示的是使用 z 轴颜色编码渲染的单色 3D 图像。C，D) 侧视图（CA 和（DB，展示z轴深度 mpeg1:eGFP+ 胚胎头部内的细胞，并突出显示皮肤巨噬细胞相对于小胶质细胞的浅表定位。E-K每个星号所指示细胞的高倍放大图像 A 和 B，提供不同形态之间详细的可视化对比E-G) 阿米巴样小胶质细胞和 (H-K细长的皮肤巨噬细胞。比例尺= 30 µm缩写：dpf = 受精后天数。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="三维显微追踪示意图；紫色血管网络及随时间变化的粒子轨迹。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66533/66533fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4在3天龄斑马鱼胚胎中追踪小胶质细胞 (A) 3 dpf Tg( 的头部背侧视图kdrl:cres898; actb2LoxP-STOP-LoxP-DsRed表达，sd5;mpeg1:eGFPgl22）三重转基因胚胎，显示小胶质细胞（绿色）和血管的表面重建（品红色）。B-D) 小胶质细胞运动的代表性追踪图，时间跨度为 (B3.5 小时时间窗口内，可观察到单个细胞遵循复杂的轨迹。C) 时间序列细节，显示上方区域的放大视图 B 由虚线方框标示的区域。展示了视频中的六个帧（间隔45分钟），记录了小胶质细胞与其微环境中内皮细胞建立瞬时接触的过程。D) 视顶盖内单个小胶质细胞迁移轨迹，其中X、Y、Z轴代表空间维度。比例尺 = 50 µm缩写：dpf = 受精后天数。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="运动分析图表；速度、距离、位移数据；箱线图、时间图；统计学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66533/66533fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5数据获取结果的可视化。 使用所述方案可获得的空间数据示例。图中显示了（A) 小胶质细胞的平均移动速度，(B）它们在1小时内移动的平均距离，（C）其均方位移，以及（D）它们在不同时期的空间分布。血管的表面渲染还允许测量任意时刻小胶质细胞与内皮细胞之间的最短距离，包括在（E单细胞水平以及作为（F）全球平均值。对于 AB，以及 D每个点代表一个单独的细胞。N = 一个胚胎。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
补充文件 1： <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533_20240306_SupplementalFile1%20(2).zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

我们展示了一种利用快速扫描共聚焦显微镜对发育中斑马鱼视顶盖内的小胶质细胞进行活体成像的方法，从而实现对这些细胞动态行为的分析 体内.

小胶质细胞是高度动态的细胞，其迁移并定植于脑实质是大脑正常发育的关键步骤。

我的研究项目聚焦于表征斑马鱼胚胎发育第一周内小胶质细胞的动态行为、形态学特征及功能。小胶质细胞具有高度动态性，我们认为，更深入地刻画其行为模式和形态变化，将有助于揭示其在发育中大脑中的成熟过程与活动机制。此类成像的主要挑战在于，需以高质量和优异的时间分辨率同时捕获多个通道信号。然而，共聚焦技术的进步如今使我们能够有效应对这一挑战。我们认为，本方案是一种强有力的工具，可促进在多种条件下对小胶质细胞动态特征的表征。这不仅包括发育的不同阶段，还包括小胶质细胞稳态受到破坏的各种背景环境。首先，在 E3 缓冲液中获取已麻醉的斑马鱼胚胎。挑选出具有目标荧光的胚胎后，使用明场体视显微镜观察其心跳。用宽口移液管吸取最多三个胚胎，并转移至底部为玻璃的成像培养皿中。在体视显微镜下，使用移液器将胚胎周围的培养基替换为1%低熔点琼脂糖溶液。使用连接在解剖针上的塑料细锥形吸头，轻轻将每个胚胎推至成像培养皿底部，并使背侧朝向玻璃面。将胚胎置于倒置共聚焦显微镜下进行观察。设置延时成像采集参数后，开始采集图像。打开 Imaris 文件转换软件，将文件拖放到输入区域。在输出菜单中，指定转换后文件的保存位置。单击“设置体素大小”以确认，然后按“全部开始”按钮，启动文件向IMS格式的转换。启动后，让分析软件在工作区中自动运行。单击“观察文件夹”以打开先前已转换的文件。文件加载到软件后，单击切片视图以浏览c堆栈。使用切片工具栏中的滑块，在用指针绘制所选细胞的直径后测量细胞直径。单击并拖动鼠标绘制跨越细胞核心的线段，并在视图区域右侧的测量工具栏中观察所绘制线段的长度。为了自动检测细胞，请返回3D视图，然后单击对象工具栏中的斑点图标，在对象列表中添加一个新的斑点对象，并打开自动斑点创建向导。在向导的第一步中，勾选“仅分割感兴趣区域”的选项。然后启用“随时间跟踪斑点”选项，以同时计算跟踪数据和目标对象的统计信息，从而实现斑点之间的比较并扩展数据范围。单击向导窗口右下角的“下一步”按钮。指定一个感兴趣区域（ROI），使其包围胚胎的视顶盖。通过单击并拖动 ROI 每个面上的小白色箭头，调整 ROI 的大小。然后将其扩展到所有记录的帧，并根据时间间隔进行调整。接着选择一个源通道，并将先前获得的细胞直径测量值设置为估计的XY直径。启用背景扣除选项，然后点击下一步。直接在下限和上限阈值框中输入强度阈值，以确保检测到所有细胞。单击“查看区域”可实时观察所有这些变化。确认无误后，单击“下一步”以确认选定的质量阈值，并单击“查看区域”以可视化满足这两个参数的斑点，这些斑点将叠加显示在源通道上。接下来，选择“自动激进运动”作为跟踪算法，以追踪具有大致连续运动的细胞。观察两个帧之间斑点的运动情况，判断细胞在两个时间点之间移动的最长距离，并在“最大距离”字段中输入估计数值。设置最大间隙大小时，如果帧间时间间隔小于60秒，使用大小为3；对于更长的时间间隔，则相应增加该数值。启用“用所有检测到的对象填充空隙”以降低检测阈值并连接轨迹。然后单击“下一步”，让软件为之前生成的所有斑点自动创建轨迹。如果获得的轨迹数量过多或出现碎片化，请使用“上一步”按钮返回创建向导，并调整先前定义的最大距离。为了排除短于三到八分钟的轨迹，请直接在轨迹持续时间过滤器的下限数据字段中输入数值。单击“下一步”以确认过滤条件并进入创建向导。手动移除由皮肤巨噬细胞生成的轨迹，以便专注于脑实质小胶质细胞的分析。使用轨迹编辑器手动校正轨迹中的其他潜在错误。在视图区域右侧，激活圆形选择模式按钮，并高亮显示需要修改或调整的轨迹。选定问题轨迹后，使用连接和断开按钮对其进行编辑，以准确反映细胞的运动轨迹。使用轨迹编辑器，选择圆形选择模式以删除重复的单个斑点。如果将小胶质细胞报告基因与其它荧光标记的实质细胞联合使用，请根据新的细胞群体调整估计的 XY 直径和最大距离。修改图像的源通道输入。最后，使用统计选项卡提取所需的追踪统计数据。单击设置按钮，选择用于计算先前创建的每个斑点对象或表面对象的统计参数。对整个胚胎斑马鱼的大脑进行了成像，并可视化了神经元相对于小胶质细胞的位置。通过本方案获得的空间数据展示了小胶质细胞的平均移动速度、每小时移动的平均距离、均方位移以及在不同时间点的空间分布情况。

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免疫学与感染

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