活体成像与斑马鱼胚胎小胶质细胞动态的表征

我的研究项目聚焦于表征斑马鱼胚胎发育第一周内小胶质细胞的动态行为、形态学特征及功能。小胶质细胞具有高度动态性，我们认为，更深入地刻画其行为模式和形态变化，将有助于揭示其在发育中大脑中的成熟过程与活动机制。此类成像的主要挑战在于，需以高质量和优异的时间分辨率同时捕获多个通道信号。

然而，共聚焦技术的进步如今使我们能够有效应对这一挑战。我们认为，本方案是一种强有力的工具，可促进在多种条件下对小胶质细胞动态特征的表征。这不仅包括发育的不同阶段，还包括小胶质细胞稳态受到破坏的各种背景环境。

首先，在 E3 缓冲液中获取已麻醉的斑马鱼胚胎。挑选出具有目标荧光的胚胎后，使用明场体视显微镜观察其心跳。用宽口移液管吸取最多三个胚胎，并转移至底部为玻璃的成像培养皿中。

在体视显微镜下，使用移液器将胚胎周围的培养基替换为1%低熔点琼脂糖溶液。使用连接在解剖针上的塑料细锥形吸头，轻轻将每个胚胎推至成像培养皿底部，并使背侧朝向玻璃面。将胚胎置于倒置共聚焦显微镜下进行观察。

设置延时成像采集参数后，开始采集图像。打开 Imaris 文件转换软件，将文件拖放到输入区域。在输出菜单中，指定转换后文件的保存位置。

单击“设置体素大小”以确认，然后按“全部开始”按钮，启动文件向IMS格式的转换。启动后，让分析软件在工作区中自动运行。单击“观察文件夹”以打开先前已转换的文件。

文件加载到软件后，单击切片视图以浏览c堆栈。使用切片工具栏中的滑块，在用指针绘制所选细胞的直径后测量细胞直径。单击并拖动鼠标绘制跨越细胞核心的线段，并在视图区域右侧的测量工具栏中观察所绘制线段的长度。

为了自动检测细胞，请返回3D视图，然后单击对象工具栏中的斑点图标，在对象列表中添加一个新的斑点对象，并打开自动斑点创建向导。在向导的第一步中，勾选“仅分割感兴趣区域”的选项。然后启用“随时间跟踪斑点”选项，以同时计算跟踪数据和目标对象的统计信息，从而实现斑点之间的比较并扩展数据范围。

单击向导窗口右下角的“下一步”按钮。指定一个感兴趣区域（ROI），使其包围胚胎的视顶盖。通过单击并拖动 ROI 每个面上的小白色箭头，调整 ROI 的大小。

然后将其扩展到所有记录的帧，并根据时间间隔进行调整。接着选择一个源通道，并将先前获得的细胞直径测量值设置为估计的XY直径。启用背景扣除选项，然后点击下一步。

直接在下限和上限阈值框中输入强度阈值，以确保检测到所有细胞。单击“查看区域”可实时观察所有这些变化。确认无误后，单击“下一步”以确认选定的质量阈值，并单击“查看区域”以可视化满足这两个参数的斑点，这些斑点将叠加显示在源通道上。

接下来，选择“自动激进运动”作为跟踪算法，以追踪具有大致连续运动的细胞。观察两个帧之间斑点的运动情况，判断细胞在两个时间点之间移动的最长距离，并在“最大距离”字段中输入估计数值。设置最大间隙大小时，如果帧间时间间隔小于60秒，使用大小为3；对于更长的时间间隔，则相应增加该数值。

启用“用所有检测到的对象填充空隙”以降低检测阈值并连接轨迹。然后单击“下一步”，让软件为之前生成的所有斑点自动创建轨迹。如果获得的轨迹数量过多或出现碎片化，请使用“上一步”按钮返回创建向导，并调整先前定义的最大距离。

为了排除短于三到八分钟的轨迹，请直接在轨迹持续时间过滤器的下限数据字段中输入数值。单击“下一步”以确认过滤条件并进入创建向导。手动移除由皮肤巨噬细胞生成的轨迹，以便专注于脑实质小胶质细胞的分析。

使用轨迹编辑器手动校正轨迹中的其他潜在错误。在视图区域右侧，激活圆形选择模式按钮，并高亮显示需要修改或调整的轨迹。选定问题轨迹后，使用连接和断开按钮对其进行编辑，以准确反映细胞的运动轨迹。

使用轨迹编辑器，选择圆形选择模式以删除重复的单个斑点。如果将小胶质细胞报告基因与其它荧光标记的实质细胞联合使用，请根据新的细胞群体调整估计的 XY 直径和最大距离。修改图像的源通道输入。

最后，使用统计选项卡提取所需的追踪统计数据。单击设置按钮，选择用于计算先前创建的每个斑点对象或表面对象的统计参数。对整个胚胎斑马鱼的大脑进行了成像，并可视化了神经元相对于小胶质细胞的位置。

通过本方案获得的空间数据展示了小胶质细胞的平均移动速度、每小时移动的平均距离、均方位移以及在不同时间点的空间分布情况。