离体加压淋巴管中绝对胞质游离 Ca²⁺ 浓度与相应收缩力的实时评估

我们研究淋巴管收缩的机制以及淋巴流动，以更深入地理解癌症相关淋巴水肿的潜在病理生理学，以及淋巴系统与高血压之间的关联。我们的目标是鉴定淋巴血管系统中的治疗靶点，从而为淋巴系统疾病开发新的治疗方法。近年来，在淋巴管平滑肌细胞和内皮细胞中发现的多种离子通道，因其参与调控细胞内钙离子动态变化，已被证明对推动该领域的发展具有重要作用。

分离血管和活体显微镜技术对于研究淋巴管功能至关重要。近年来，使用器官芯片和微加工血管来研究淋巴生物学多个方面的趋势日益上升。由于组织尺寸极小，对淋巴血管系统的研究面临挑战，需要耗费大量时间、耐心，并推动新技术的开发。

缺乏淋巴管肌细胞特异性标记物是整个科学界面临的另一大难题。本方案的优势在于能够在同一血管内同时测量淋巴管收缩活动和绝对钙离子浓度。这为钙信号传导、收缩机制的研究提供了更深入的见解，同时也使得不同处理组之间的基线比较成为可能，而其他技术可能仅依赖于钙离子的相对变化或使用已麻痹的血管进行测量。

首先，取商用的硼硅酸盐玻璃微移液管。将其切割并抛光至约一到两厘米的长度，用于离体血管灌流室。将安装好的每根玻璃套管连接至独立的压力传感器，该传感器与独立的重力驱动压力调节器对齐，并通过聚乙烯管连接。用生理盐溶液反向灌注灌流室、玻璃微移液管、重力驱动压力调节器以及聚乙烯管，然后夹闭压力通路，确保套管未受压力作用。

首先，取一根编织的丝线缝合线，将其分离成单根纤维。使用两把带有微钝尖端的杜蒙特5号镊子，用其中一把镊子在另一把镊子的尖端绕成双环，用形成环的镊子夹住缝合线的自由端，并小心地将其从两个环中拉出。使用瓦纳斯弹簧剪刀修剪两侧多余的缝合线。

将安乐死的大鼠断头后，沿腹壁正中线做一纵向切口。然后将肠系膜游离出来，在幽门括约肌下方约距离盲肠上方两到三厘米处剪断连接，并剪断与直肠的连接。随后用200毫升冰冷的生理盐溶液冲洗完整剥离的肠系膜。

随后，在体视显微镜下使用Dumont 5号不锈钢精细镊子和Vannas弹簧剪，将组织转移并固定于含冰冻生理盐溶液的硅胶衬里培养皿中，剥离肠系膜二级淋巴管周围的脂肪和结缔组织。接着将分离出的淋巴管转移至血管灌流腔室，准备在玻璃套管上进行插管。预先在每个玻璃套管上滑入一个打好结的线圈，以备后续将血管固定于套管时使用。

取少量脂肪组织，确定淋巴管的走向，并将远端套入P1端。将结向导管方向滑动并扎紧，以固定淋巴管。随后在灌流室中将淋巴管加压至4至5毫米汞柱。

在浴槽室中放置一个通有7%二氧化碳和93%氧气的鼓泡石，以维持生理pH值，将浴槽室连接至温度调节器，并设定为37摄氏度。首先，分离并插管已处死大鼠的肠系膜淋巴管。在灌流室中对淋巴管加压，使其平衡并产生稳定的自发性收缩。

然后在避光条件下，将淋巴管与Fura-2-乙酰甲氧基酯（Fura-2-acetoxymethyl ester）和普鲁尼克酸（pluronic acid）共同孵育30分钟。孵育结束后，使用负压真空装置排空整个浴槽液体，并用温度匹配的无试剂生理盐溶液冲洗三次。随后，将淋巴管在避光条件下继续孵育额外15分钟，以去除多余的染料并完成去酯化反应。接着，将样品室转移至配备LED光源、20倍荧光物镜、细胞定位适配器和相机的倒置荧光显微镜下，进行每秒15帧的荧光信号采集。

将显微镜连接至配备成像软件的计算机，以记录荧光信号并进行边缘检测。启动LED光源和荧光系统接口。然后运行Ion wizard软件。

在文件选项卡下，选择“新建”选项。然后转到采集选项卡，选择实验。加载所需的实验模板，然后点击确定。

单击屏幕底部的开始按钮以启动实验。接下来，调整屏幕上的曲线，按降序显示血管直径、340 信号、380 信号和比值。如需修改 Y 轴刻度以获得更好的曲线可视化效果，请进入“Traces”选项。

确保取消勾选自动限制，并选择编辑用户限制。选择要调整的参数。输入坐标轴的最小值和最大值，然后选择确定以确认。

使用边缘检测软件，调节光照条件，使淋巴管壁呈现为深色线条。选择一个无脂肪和碎片的感兴趣区域（ROI），并确保该区域在后续操作中保持固定。设置阈值，以确保在整个收缩周期中均能检测到血管壁的边缘。使用LED照明器激活光电倍增管后，交替采用340和380纳米波长，以50毫秒曝光时间激发Fura-2，以15赫兹的频率在整个成像视野中采集510纳米处的发射光谱。

为测量信噪比，首先将淋巴管置于视野中央，获取340和380荧光信号。随后将视野移至浴槽边缘无血管处，以采集背景信号，接着用温度匹配的无试剂生理盐溶液更换浴槽溶液。为去除过量的Fura 2染料，记录约30分钟的Fura 2荧光基线信号及自发性收缩。

然后记录硝苯地平的累积浓度反应，并对每种药物浓度获取背景测量值。每次实验结束时，用温度匹配的无钙生理盐溶液冲洗淋巴管，以获得无钙离子条件下Fura 2荧光信号的最小值和淋巴管的最大直径；随后将浴槽溶液更换为含10毫摩尔钙离子并加入离子霉素的温度匹配生理盐溶液，以获得钙离子饱和条件下Fura 2荧光信号的最大值和淋巴管的最小直径。钙峰振幅、基础钙水平和峰值钙等参数随着向灌流室中逐步添加硝苯地平而呈浓度依赖性降低。

同时，收缩参数如收缩频率、幅度以及计算流速也均表现出逐步下降的趋势。曼哈顿图显示了各淋巴管在节律性指标上的个体反应，包括收缩间隔、收缩时间和舒张时间。