Name: 实时评估隔离、加压淋巴管中的绝对、胞质、游离 Ca2+ 和相应的收缩力 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 学习使用荧光显微镜实时测量分离淋巴管中的胞质钙浓度和血管收缩力。该方法可同时检测钙信号与收缩动力学，为研究淋巴管功能及开发淋巴疾病新疗法提供可靠技术平台。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，包括美国普通医学科学研究所、生物医学研究卓越中心（COBRE）、癌症治疗宿主反应研究中心 [P20-GM109005]、美国国家癌症研究所 [1R37CA282349-01] 以及美国心脏协会博士前奖学金 [资助编号：23PRE1020738；https://doi.org/10.58275/AHA.23PRE1020738.pc.gr.161089]。本内容仅由作者负责，不代表NIH或AHA的官方观点。&#160;图1 和 图3 使用 BioRender.com 制作。

购自商业供应商的9至13周龄雄性Sprague-Dawley大鼠。到达后，所有大鼠均饲养并维持在美国阿肯色大学医学科学分校（UAMS）实验动物医学部（DLAM）设施中，给予标准实验室饮食，并置于25 oC、12小时光照:12小时黑暗循环的环境中。所有操作均按照UAMS机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的动物使用方案#4127进行。
1. 肠系膜淋巴管的分离与插管
注意：在分离肠系膜淋巴管之前，必须先安装灌流室，以确保灌流过程中无中断或泄漏，避免影响实验。
<ol>
	<li>灌流浴槽制备
	<ol>
		<li>购买硼硅酸盐玻璃微量移液管（外径 1.2 mm，内径 0.68 mm，拉制后尖端外径为 75-100 &#181;m）从商业供应商处购买。将微移液管（又称套管）切割并抛光至约1-2 cm长度，以便安装到离体血管灌流腔中。</li>
		<li>将血管灌注室中每个安装好的玻璃套管通过聚乙烯管连接到独立的压强传感器，该传感器与独立的重力驱动压强调节器串联。 
		注意：根据研究设计的不同，可独立调节流入压和流出压。 图1 详细展示了该装置。</li>
		<li>用生理盐溶液（PSS；119 mM NaCl；24 mM NaHCO₃；11 mM 葡萄糖；4.7 mM KCl；1.2 mM KH₂PO₄；1.6 mM CaCl₂；1.2 mM MgSO₄）填充灌流室（5 mL）、玻璃微移液管以及独立的重力驱动压力调节器及其聚乙烯管路3；1.17 mM NaH2PO4；4.7 mM KCl；1.17 mM MgSO₄4；5.5 mM C6H12O6 （葡萄糖）；0.026 mM C10H16N2O8 （EDTA）；以及 1.6 mM CaCl2）且无任何气泡。然后夹闭压力管，使套管不处于加压状态。 
		注意：该溶液的 pH 值约为 7.5。灌流浴槽中的 pH 值通过 CO 维持在 7.42 气泡作用于PSS中的碳酸氢盐缓冲系统，具体操作如步骤1.3.7所述。此处使用EDTA以螯合过量的Ca2+ 离子</li>
	</ol>
	</li>
	<li>结的制备
	<ol>
		<li>在显微镜下使用编织丝线缝合线（8-0规格）打双重外科结。关键步骤如图所示 图2.
		<ol>
			<li>分离单根细丝。</li>
			<li>使用两把尖端微钝的Dumont #5镊子，用其中一把镊子在另一把镊子的尖端绕成双环。</li>
			<li>用环形镊子夹住缝线的游离端，将其穿过两个线环，注意不要将结完全拉紧，需留出一个小开口。</li>
			<li>使用Vanna弹簧剪从两侧剪除多余的缝线。稍后利用这些线结将左心室固定在插管上。 
			注意：请勿使用同一把镊子进行解剖或插管操作，因为在打结过程中更容易损坏镊子尖端。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肠系膜淋巴管的分离与插管
	<ol>
		<li>用5%异氟烷（1.5 L/min氧气）深度麻醉动物2 过量麻醉后断头放血处死。</li>
		<li>沿腹壁中线做纵行切口，暴露肠系膜，然后在幽门括约肌下方以及盲肠上方约2-3 cm处剪断连接，并剪断与直肠相连的部分，以分离完整的肠系膜用于后续肠系膜淋巴管的解剖。</li>
		<li>将解剖得到的完整肠系膜用200 mL冰冻的PSS洗涤，然后转移至含冰冻PSS的硅胶衬里（8-10 mm）培养皿（100 mm）中，并固定。</li>
		<li>在体视显微镜下，使用解剖用Dumont #5 Inox精细镊子和Vanna弹簧剪，将二級腸系膜淋巴管從周圍脂肪和結締組織中分離。為便於在組織中辨識淋巴管兩端，於淋巴管近端保留一小塊脂肪組織。</li>
		<li>将分离的淋巴管转移至灌流 chamber，以便在玻璃插管上进行插管。</li>
		<li>使用两把预先磨尖的Dumont #5 Inox精细镊子（直头，0.05 × 0.01 mm），将淋巴管远端连接至P1插管（流入端），近端连接至P2插管（流出端），以模拟淋巴液流动方向。 
		注意：P1 和 P2 套管完全相同，仅在连接左心室（LV）的末端位置上有所区别。应使用尖端完全贴合且无损伤的镊子，以便于夹住较薄的血管壁。
		<ol>
			<li>将一个预先打好的结滑至每根玻璃套管上，以便后续将血管固定在套管上。</li>
			<li>利用一小块脂肪组织帮助确定左心室方向，首先将远端套接到 P1 上。</li>
			<li>将结滑至套管末端并收紧以固定左心室，注意不要过度收紧而导致套管尖端断裂。</li>
			<li>在灌注室内将左心室压力加压至4-5 mm Hg。 
			注意：在本实验中，我们将 P1 和 P2 压力设定为相等；然而，根据具体实验条件，可分别调节每根套管处的压力以诱导剪切应力或回流。</li>
			<li>重复步骤 1.3.6.1–1.3.6.4，将左心室近端插管至 P2。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将通有7%二氧化碳（CO₂）的鼓泡石放入2)/93% 氧气（O₂2在浴槽室中维持生理 pH。</li>
		<li>将腔室连接至温度调节器，并将其设定为37 oC，使LVs达到平衡并产生稳定、自发的收缩（约30分钟）。 
		注意： 图1 详细展示了该装置。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 左心室中[Ca2+]i绝对浓度的测定
<ol>
	<li>离体灌注淋巴管的Fura-2AM染色
	<ol>
		<li>自发性收缩出现后（自步骤1.3.8起），将左心室肌条与Fura-2乙酰甲酯（Fura-2AM； 2 &#181;M 或 10 &#181;L/5 mL）和泊洛沙姆酸（PA；0.02% W/V 或 5 &#181;L暗处孵育30分钟（每5 mL加入20% PA）。 
		注意：加入 Fura-2AM 后，所有后续步骤均须在避光条件下进行。</li>
		<li>30分钟后，使用负压真空装置将灌流室中的溶液完全吸出，并用温度匹配的（37℃）新溶液替换，重复此过程3次。 oC) 无试剂PSS。 
		注意：此操作应迅速完成，以尽量减少左心室暴露在空气中的时间。建议双手操作，例如，右手操作真空装置，左手更换新的无试剂PSS。</li>
		<li>洗涤后，将LVs在避光条件下孵育15分钟，以去除过量指示剂并完成去酯化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>捕获 Ca2+ 荧光与血管直径
	<ol>
		<li>将培养室转移至倒置荧光显微镜载物台上，显微镜配备LED光源、20倍S Fluor物镜、细胞定位适配器和高速CMOS视频摄像系统，可实现每秒15帧的逐帧荧光图像采集。 
		注意：此工作流程设置的示意图如下所示 图3钙2+ 可使用帧速率为每秒15帧或更高的CCD相机捕获信号。</li>
		<li>将显微镜连接至配备成像软件的计算机，以记录荧光和边缘检测。 
		注意：所提及的软件还支持同步压力记录；但本文未包含该操作。</li>
		<li>打开LED光源和荧光系统接口。 
		注意：此处描述的软件操作说明适用于所引用的软件，但也可使用其他软件获取此类数据。</li>
		<li>开放软件（IonWizard）。</li>
		<li>在……下方 文件 标签，选择 新.</li>
		<li>在……下方 收集 标签，选择 实验.</li>
		<li>加载所需的实验模板并点击 好的. 
		注意：您需要设置一个包含待测参数的实验模板。有关模板设置的说明，请参见软件手册。29.</li>
		<li>调整屏幕上的轨迹以观察 血管直径，分子 (340 信号)， 分母 （380 信号），以及 比率 按降序排列。</li>
		<li>根据需要调整 y 轴刻度，以帮助观察曲线轨迹。
		<ol>
			<li>在下方 痕迹，选择 编辑用户权限确保取消勾选“自动限制”。</li>
			<li>选择您希望调整的参数，输入坐标轴的最小值和最大值，然后选择 好的.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>开始实验，请点击 开始 （屏幕底部）</li>
		<li>为同时测量左心室（LV）直径，使用成像系统内置的边缘检测软件，该软件可生成在3 Hz条件下的左心室收缩轨迹。利用这些测量数据，分析第3节所述及图中所示的收缩性和节律性参数。 图4.
		<ol>
			<li>务必调整光照，使左心室壁呈现为暗线。</li>
			<li>选择一个无脂肪和碎片的感兴趣区域（ROI）。实验开始后，不要移动该ROI。</li>
			<li>确保设定的阈值能够在整个收缩周期中检测到血管壁的边缘。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>进行荧光测量时，打开光电倍增管（PMT）。</li>
		<li>使用LED光源，以50 ms曝光交替激发340 nm和380 nm波长，激发Fura-2这一比率型指示剂，并在整个成像视野中以15 Hz频率采集510 nm处的发射光谱。 
		注意：为获得可重复的Ca信号，在整个系列实验中必须保持所有光学参数（激发设置、发射滤光片、物镜和二向色镜）一致。2+ 测量。</li>
		<li>通过以下步骤测量信噪比：首先，将左心室置于视野中央，获取340和380的荧光信号（信号值）；随后，使用载物台操纵器将视野移至浴槽边缘无血管的位置（注意避开硅胶衬边，或清除浴槽中的任何碎片），采集背景信号。 
		注意：每次进行 Ca 检测时，必须返回血管的原始节段2+ 测量</li>
		<li>用温度匹配的无试剂PSS更换灌流液，以去除浴液中过量的指示剂。可能需要多次更换灌流液才能充分去除过量的Fura-2，因此请重复此步骤，直至信号与背景的比值达到约10:1。</li>
		<li>记录基础Fura-2荧光信号及自发性收缩约30分钟，随后给予尼群地平（NIF；0.1–100 nM）累积浓度反应，该药物为电压依赖性Cav1.x 拮抗剂。获取每种药物浓度的背景测量值。</li>
		<li>每次实验结束时，用温度匹配的 Ca 溶液冲洗 LVs2+无钙PSS以获得最低的Fura-2荧光信号（R分钟) 以及在无钙条件下LVs的最大直径2+务必测量背景值。 
		注意：Ca2+无钙PSS的成分与PSS相同，但不含CaCl₂2，EDTA 被替换为 1 mM EGTA（C14H24N2O10)（pH ~7.5）。</li>
		<li>更换灌流液为温度匹配的含 10 mM Ca 的 PSS2+ 和离子霉素（10 &#181;M IONO），一种Ca2+ 离子载体，以获得最大Fura-2荧光信号（R最大值) 和在钙饱和条件下LV的最小直径2+务必测量背景值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测量绝对[Ca2+]i&#8203;
	<ol>
		<li>使用 R分钟 和 R最大 校准340 nm与380 nm波长的比值，并计算细胞质游离Ca²⁺的绝对浓度2+ 浓度（[Ca2+]i).</li>
		<li>计算细胞质游离Ca的绝对浓度2+ 浓度（[Ca2+]i) 使用公式(1)26: 
		<img alt="公式 1" src="/files/ftp_upload/66535/66535eq01.jpg" style="margin: auto;" />&#160; &#160; &#160;(1) 
		其中 Kd = 225 nM（Fura-2 的解离常数）26，R = 340/380 比值，R分钟 无钙条件下340/380的比值2+，R最大 = 饱和 Ca 条件下的 340/380 比值2+ 条件，S自由 无钙条件下380信号2+，S结合的 = 380 信号与饱和 Ca2+ 条件 
		注意：所有荧光信号均已校正背景荧光。</li>
		<li>图5 是钙的一个示例2+ 基线Ca记录参数的详细信息2+ 最低静息Ca2+ 在Ca之前2+ 尖峰和峰值钙2+ 作为最高的 Ca2+ 在Ca期间实现2+ 峰电位。振幅是峰值与基线Ca之间的差值2+. 除Ca频率外，所有参数均直接从成像软件导出2+ 尖峰，将在离线情况下计算为 Ca 的数量2+ 尖峰/秒。以下是参考软件中获取这些参数的关键步骤。 
		注意：完整的轨迹可导出为 .txt 文件，所有参数均可在您选择的软件中进行分析或计算。</li>
		<li>对于 R分钟，高亮显示在Ca背景下与分子信号相对应的分子轨迹部分2+无PSS。此时将打开一个对话框，并提供该部分轨迹的数值。</li>
		<li>下 操作步骤，选择 常数.</li>
		<li>选择 钙-数值背景 输入上一步骤中获得的分子和分母的背景数值，然后单击 好的.</li>
		<li>突出显示比率轨迹中对应于 Ca 期间最低比率的部分2+无PSS。这是R分钟同时记录该部分的分母值；此值为 S自由.</li>
		<li>重复步骤 2.3.4 至 2.3.7，针对 R 进行最大值 和 S结合的 与高钙对应的迹线区段2+ 游离PSS和最高比例</li>
		<li>下方 操作步骤，选择 常数.</li>
		<li>选择 钙-钙校准 并输入所列出的数值 公式 1点击 好的.</li>
		<li>按照步骤2.2.8中所述调整其中一个屏幕上的波形，以便能够观察到 钙-数值相减钙.</li>
		<li>执行单调瞬态分析以获取其余参数，相关操作说明详见软件手册30.</li>
		<li>或者，以下情况 导出，选择 当前示踪.</li>
		<li>选择要导出 .txt 文件的位置，然后单击 好的. 
		注意：请务必点击您想要导出的单个轨迹。您可以导出整个轨迹或轨迹的选定部分。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 左心室收缩力和节律性的测量
<ol>
	<li>成像系统中集成的边缘检测软件可生成心室收缩轨迹，用于测量左心室（LV）直径，具体方法如上所述。利用这些测量数据来分析收缩功能和节律参数。 图4 是一条示例性收缩曲线，用于说明需要记录的收缩参数。通过影像分析软件中“单相瞬时分析”功能，直接从直径曲线导出所有参数30，但收缩频率、计算流量和间隔需离线计算。 
	注意：可将完整轨迹导出为 .txt 文件，并使用以下方程在您选择的软件中对所有参数进行分析或计算。</li>
	<li>EDD、ESD、振幅、频率和计算的血流测量值
	<ol>
		<li>测量左心室在节律性自发收缩过程中所能达到的最大和最小直径（分别为舒张末期直径 [EDD] 和收缩末期直径 [ESD]）。</li>
		<li>将收缩幅度（AMP）计算为舒张末期直径（EDD）与收缩末期直径（ESD）之间的差值。</li>
		<li>以每次测量时间段（单位：s）内的收缩次数计算频率。</li>
		<li>计算计算流量每 &#181;m 使用公式（2): 
		计算流速 = &#960;/4(EDD2- 内镜黏膜下剥离术2F&#160; &#160; &#160;&#160;(2) 
		何处为 EDD2 = 静息状态下的血管横截面积，ESD2 = 血管收缩时横截面积的测量值，F = 收缩频率/秒</li>
	</ol>
	</li>
	<li>节律性：收缩与舒张时间：
	<ol>
		<li>左心室节律性的其他测量指标包括收缩时间和舒张时间。</li>
		<li>将收缩时间定义为左心室（LV）每次收缩达到收缩末期容积（ESD）所需的时间。</li>
		<li>将舒张时间定义为左心室（LV）每次舒张达到舒张末期直径（EDD）所需的时间，该参数可整体反映与绝对[Ca2+]i 在特定时间范围内。</li>
		<li>计算时间间隔（&#916;T）来自公式（3). 
		&#916;t = t2 (ESD2)- t1 (ESD1)&#160;(3)</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Real-Time Analysis of Calcium and Contractility in Isolated Lymph Vessels

<ol><li>Takahashi, T., Shibata, M., Kamiya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+macromolecule+concentration+in+collecting+lymphatics+in+rat+mesentery%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanism of macromolecule concentration in collecting lymphatics in rat mesentery.</a> Microvasc Res. 54 (3), 193-205 (1997).</li>
<li>Ishikawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+renal+lymphatics+under+normal+and+pathological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">The human renal lymphatics under normal and pathological conditions.</a> Histopathology. 49 (3), 265-273 (2006).</li>
<li>Fanous, M. Y. Z., Phillips, A. J., Windsor, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenteric+lymph%3A+the+bridge+to+future+management+of+critical+illness%5BTitle%5D)+AND+%22JOP%22%5BJournal%5D)">Mesenteric lymph: the bridge to future management of critical illness.</a> JOP. 8 (4), 374-399 (2007).</li>
<li>El-Chemaly, S., Levine, S. J., Moss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatics+in+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Lymphatics in lung disease.</a> Ann N Y Acad Sci. 1131 (1), 195-202 (2008).</li>
<li>Klotz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+lymphatics+are+heterogeneous+in+origin+and+respond+to+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cardiac lymphatics are heterogeneous in origin and respond to injury.</a> Nature. 522 (7554), 62-67 (2015).</li>
<li>Louveau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+features+of+central+nervous+system+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels.</a> Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

由于淋巴管（LVs）结构脆弱且尺寸微小，在解剖和插管过程中必须格外小心。即使对血管造成轻微损伤，也可能导致淋巴管无法存活，或引发细胞内钙离子浓度（[Ca2+]i）瞬变的异常。在整个实验过程中，保持激发条件的一致性同样至关重要，以确保对照组与处理组之间[Ca2+]i]测量结果具有可比性。若未能维持统一的设置，则存在显著高估或低估同一批次实验中不同血管[Ca2+]i]水平的风险。同样，在每次实验过程中，准确识别并持续监测同一血管区域也极为重要。
使用比率型荧光探针 Fura-2AM 可校正因组织厚度不均、荧光探针分布/泄漏或光漂白等因素引起的荧光信号波动，这些问题在单波长染料应用中较为常见。31 这使得本实验方案中所述的连续监测成为可能。然而，由于 Fura-2 通过螯合 Ca2+ 起作用，可能会导致淋巴管（LV）过载，从而减少可用于收缩或药物反应的胞内 [Ca2+]i 浓度。在此类情况下，仍可观察到 Ca2+ 峰值信号，但节律性收缩可能消失。淋巴管长度的变化也可能导致这一现象。尽管这些 Ca2+ 测量结果可能仍然有效，但在重复实验中可能需要降低 Fura-2AM 的浓度，以成功同时获得 Ca2+ 和管径的测量数据。本研究的结果仅包含在基线状态下同时存在 Ca2+ 峰值信号和节律性收缩的淋巴管样本。
测量 R分钟 和 R最大 是计算绝对[Ca2+]i。因为 R分钟 应为无 Ca 时的 Fura-2 比值2+，已向 Ca 中添加了高浓度 EGTA2+-free PSS 以确保螯合任何残留的 Ca2+. 初始研究在 Ca 存在 EDTA 的情况下进行2+-无PSS，这导致血管出现零星收缩，并伴随相应的Ca2+ 尖峰。对于 R最大值，高浓度的 Ca2+ 已将离子载体离子霉素（ionomycin）添加至PSS中，以最大程度提高[Ca2+]i 信号。高 Ca2+ 溶液可能会析出沉淀，可能需要从PSS中去除EDTA。重要的是，这些额外的R测量分钟 和 R最大值 提供评估生理学相关[Ca2+]i，可提供有关膜兴奋性和收缩性机制的信息27 以及允许与仅报告 Fura-2 的 340/380 比值的方案相比，在实验组之间进行基线比较。未能获得足够的 R分钟 和 R最大 数值排除了计算绝对[Ca2+]i.
由于淋巴管（LVs）具有收缩特性，该方法只能测量整体Ca2+水平，而无法检测在去神经或麻痹血管中可观察到的局部Ca2+释放事件32。然而，与使用麻痹血管或单个细胞的方法相比，该方法在将绝对[Ca2+]i动态变化与收缩功能相关联方面具有优势28,32。采用此方法时，通常假设所测得的Ca2+信号主要来源于淋巴管平滑肌细胞。但需注意的是，这些分离的LVs中也存在内皮细胞，可能对总体Ca2+信号有所贡献33。该贡献可通过使用已去除内皮的LVs进行估算34。此外，在LV收缩过程中，血管壁可能在收缩周期中轻微地进出焦平面，因此应使用较短的血管节段，并将其适度拉紧，但避免过度拉伸血管。
除了在集合淋巴管（LVs）中的应用外，该方法还可用于研究来自其他血管床的分离血管，包括小动脉和静脉，并在神经生物学及其他血管生物学分支中具有潜在应用前景。探索作用于不同信号转导通路的各种激动剂或拮抗剂的影响，是研究潜在Ca2+动态机制的另一途径。此外，该技术也可用于对来自相应动物的对照样本与处理样本进行比较研究。更重要的是，该方法可适应于细胞水平的研究，例如在分离的淋巴管平滑肌细胞中应用，仅需对灌流室和显微镜物镜进行 минималь的调整。总之，该方法提供了与集合淋巴管收缩性和节律性相关的全局Ca2+动态的生理学相关见解，并为评估可能调控集合淋巴管Ca2+动态的因素提供了可靠的手段。

淋巴管系统存在于多种器官系统中，包括脑、心脏、肺、肾和肠系膜1,2,3,4,5,6，其功能是将组织间隙液（淋巴液）推动至中心静脉导管，以维持体液稳态7,8,9,10。该系统起始于血管毛细床内的盲端淋巴毛细管，随后汇入集合淋巴管（LVs）。集合淋巴管由两层细胞构成：内层为内皮细胞，外层为淋巴管肌细胞（LMCs）10,11。淋巴液的运输依赖于外在力量（例如新淋巴液的形成、动脉搏动、中心静脉压波动）和内在力量共同作用12。
淋巴转运的内在驱动力是收集性淋巴管（LVs）的自发节律性收缩，这也是大多数研究淋巴功能的课题所关注的重点。这种内在的淋巴泵功能主要由细胞质内游离Ca²⁺浓度的周期性升降所调控。2+ ([Ca2+]i）。LMC细胞质膜的自发去极化会激活电压门控 &#34;L型&#34; Ca2+ (Cav1.x) 通道引发 Ca2+ 流入及随后的左心室节律性收缩8,9,10。这一作用通过阻断Cav1.x 与特定试剂（如硝苯地平）作用，可抑制左心室收缩并引起血管扩张13,14. 胞内钙离子浓度[Ca2+]i 或 &#34;Ca2+ 刺突&#34; 由 Ca 介导的 LMCs 中v1.x 型通道也可能动员细胞内 Ca2+ 通过激活三磷酸肌醇（IP3)受体和肌浆网（SR）上的兰尼碱受体（RyRs）15,16,17,18. 目前的证据表明IP3 受体贡献更多的Ca2+ 与RyRs相比，对正常左心室收缩所必需15,16,19,20,21；然而，在病理条件下或对药物干预的反应中，兰尼碱受体（RyRs）可能发挥一定作用17,18。此外，Ca²⁺的激活2+激活的K+ 通道22 和ATP敏感性钾（KATP通道23,24 可使LMC膜超极化并抑制其自发性收缩活动。
在集合淋巴管（LVs）中，还有许多其他离子通道和蛋白质可能调控Ca2+动态。利用实时研究药理学试剂对Ca2+变化及血管收缩性的响应的方法，对于理解这些潜在的调控因子至关重要。先前已有研究描述了使用Fura-2测量LV内[Ca2+]i相对变化的方法25。由于Fura-2与Ca2+的解离常数已知26，因此可以计算出Ca2+的实际浓度，这扩展了该方法的应用范围，并为Ca2+信号传导、膜兴奋性以及收缩机制提供了更深入的见解27，同时也允许在不同实验组之间进行基线比较。后一种方法已在心肌细胞中应用28，因此也可被适配用于LVs。本文介绍了一种改进的方法，结合上述两种方法，可在离体加压的LVs中连续、实时地测量并计算绝对[Ca2+]i的变化以及血管收缩性/节律性。我们还提供了经尼卡地平处理后的LVs的代表性实验结果。

<table><tbody><tr><td>20x S 荧光物镜</td><td>美国奥林巴斯公司（宾夕法尼亚州森特瓦利，美国）</td><td>UPlanSApo</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃微移液管</td><td>Living Systems Instrumentation（美国佛蒙特州伯灵顿）</td><td>GCP-75-100</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙（CaCl2）</td><td>Fisher Bioreagents（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）</td><td>BP510-500</td><td></td></tr><tr><td>二氧化碳（CO2）</td><td>nexAir（美国田纳西州孟菲斯）</td><td>UN3156</td><td></td></tr><tr><td>解剖镊</td><td>Fine Science Tools（美国加利福尼亚州福斯特城）</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>EDTA（C10H16N2O8）</td><td>Fisher Bioreagents（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）</td><td>BP118-500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA（C14H24N2O10）</td><td>Fisher Bioreagents（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）</td><td>O2783-100</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2AM</td><td>Invitrogen（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖（C6H12O6）</td><td>Fisher Bioreagents（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>重力供液式压力调节器</td><td>实验室自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热装置</td><td>Living Systems Instrumentation（美国佛蒙特州伯灵顿）</td><td>TC-09S</td><td></td></tr><tr><td>成像软件</td><td>IonOptix（美国马萨诸塞州韦斯特伍德）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒置荧光显微镜</td><td>美国奥林巴斯公司（宾夕法尼亚州森特瓦利，美国）</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Invitrogen（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）</td><td>I24222</td><td></td></tr><tr><td>IonOptix 细胞固定适配器</td><td>IonOptix（美国马萨诸塞州韦斯特伍德）</td><td>665 DXR</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Piramal Critical Care（特伦甘纳，印度）</td><td>NDC 66794-017-10</td><td></td></tr><tr><td>离体血管灌流室</td><td>Living Systems Instrumentation（美国佛蒙特州伯灵顿）</td><td>CH-1</td><td></td></tr><tr><td>打结钳</td><td>Fine Science Tools（美国加利福尼亚州福斯特市）</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>LED光源</td><td>美国奥林巴斯公司（宾夕法尼亚州森特瓦利，美国）</td><td>TL4</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁（MgSO4）</td><td>Acros Organics（美国新泽西州）</td><td>213115000</td><td></td></tr><tr><td>MyoCam-S3 快速 CMOS 视频系统</td><td>IonOptix（美国马萨诸塞州韦斯特伍德）</td><td>MCS300</td><td></td></tr><tr><td>硝苯地平</td><td>Sigma（美国密苏里州圣路易斯）</td><td>N7634</td><td></td></tr><tr><td>眼科缝线</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氧气（O₂）</td><td>nexAir（美国田纳西州孟菲斯）</td><td>UN1072</td><td></td></tr><tr><td>泊洛沙姆酸</td><td>Sigma（美国密苏里州圣路易斯）</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Fisher Bioreagents（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>压力监测系统</td><td>Living Systems Instrumentation（美国佛蒙特州伯灵顿）</td><td>PM-4</td><td></td></tr><tr><td>压力传感器</td><td>Living Systems Instrumentation（美国佛蒙特州伯灵顿）</td><td>PT-F</td><td></td></tr><tr><td>硅胶衬里培养皿</td><td>实验室自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠（NaHCO₃）</td><td>Fisher Bioreagents（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Fisher Bioreagents（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠（NaH2PO4）</td><td>Fisher Bioreagents（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）</td><td>BP329-500</td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley 大鼠</td><td>Envigo RMS（印第安纳波利斯，印第安纳州，美国）</td><td>雄性</td><td>9-13 周龄</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>徕卡显微系统公司（德国韦茨拉尔）</td><td>S9D</td><td></td></tr><tr><td>万纳斯弹簧剪</td><td>Fine Science Tools（美国加利福尼亚州福斯特城）</td><td>15000-03</td><td></td></tr></tbody></table>

离体加压淋巴管中绝对胞质游离 ca2+ 浓度与相应收缩力的实时评估

Real-time Evaluation of Absolute, Cytosolic, Free Ca2+ and Corresponding Contractility in Isolated, Pressurized Lymph Vessels

淋巴管系统现在常被称为&#34;第三循环&#34;，广泛分布于多种重要器官系统中。淋巴管系统主要的机械功能是将细胞外间隙的液体回输至中心静脉导管。淋巴液的运输依赖于淋巴管（LVs）自发的节律性收缩。LV的收缩主要受细胞质中游离钙离子浓度（[Ca2+]i）周期性升降的调控。
本文介绍了一种在离体加压的淋巴管（LVs）中实时同步计算[Ca2+]i绝对浓度变化和血管收缩性/节律性变化的方法。利用分离的大鼠肠系膜淋巴管，我们研究了药物添加后[Ca2+]i和收缩性/节律性的变化。将离体淋巴管负载比率型Ca2+感应探针Fura-2AM，并结合视频显微镜与边缘检测软件，连续实时采集[Ca2+]i&#160;和管径的测量数据。
每个左心室（LV）的Fura-2AM信号均根据每条血管的最小和最大信号进行校准，并用于计算绝对[Ca2+]i。利用直径测量值计算收缩参数（振幅、舒张末期直径、收缩末期直径、计算血流量）和节律性参数（频率、收缩时间、舒张时间），并与绝对[Ca2+]i测量值进行关联分析。

左心室的收缩力及胞质游离钙的相应变化2+ ([Ca2+]i) 在暴露于不同浓度的硝苯地平（NIF；0.1–100 nM）后，对分离的大鼠肠系膜淋巴管中的LVs进行了评估（图6）。参数包括 Ca2+ 峰电位幅度，基线 Ca2+，以及钙峰值2+，随着向灌注 chamber 中逐步添加 NIF，表现出浓度依赖性降低图7A）。同时，收缩参数（如收缩幅度和计算流量）也表现出逐步下降的趋势（图7B）。使用NIF后，EDD直径略有增加图7B）。Ca2+ 峰电位频率和收缩频率呈现出“全或无”的反应。然而，这种效应在某一左心室（LV）于10 nM时即已出现，而所有左心室在100 nM时均已停止收缩。因此，合并数据生成的曲线呈现出类似梯度浓度反应的图形。该效应与先前在其他制备方法（如钢丝法和压力肌动图）中使用NIF作用于左心室的研究报道一致。13,14）。曼哈顿图展示了节律性指标（包括节律间隔、收缩时间和舒张时间）的各个LV响应情况（图7C）。这种数据呈现方式可帮助研究人员区分出此类全或无的反应或收缩节律的变异性，从而为潜在机制提供进一步的见解。最终，收缩幅度和频率的降低导致计算出的孤立淋巴管内流量减少，后者可作为淋巴管功能的替代性指标 体内 功能。总体而言，左心室收缩力的下降与[Ca2+]i我们的研究结果提供了直接证据，表明在100 nM浓度范围内，NIF有效抑制了收缩及[Ca2+]i 通过拮抗 Ca 抑制 LVs 中的振荡v1.x通道存在于淋巴肌细胞（LMCs）中。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66535/66535fig01v2.jpg" /> 
图1：离体血管灌流腔装置示意图。 血管灌流实验采用配备温度调节器的离体血管腔装置。通过PSS储液器利用重力控制灌流压力。压力由连接在流入端（P1）和流出端（P2）套管上的压力传感器进行监测。缩写：PSS = 生理盐溶液。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66535/66535fig01largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66535/66535fig02.jpg" /> 
图2：打结步骤概览。（A）在解剖显微镜下使用一根三股丝线单丝制备双环结构&#160;，（B）抓住自由端并将其穿过两个环，（C）从两端拉紧结以保持一个小开口，以及（D）从两侧剪除多余的丝线，蓝色框内显示一个可直接使用的完整双单结。比例尺 = 1.5 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66535/66535fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66535/66535fig03.jpg" /> 
图3数据采集实验流程示意图 一只健康大鼠用5%异氟烷麻醉后断头取躯干血。行正中切口以暴露并分离肠系膜。将分离的肠系膜铺展于冰冻的PSS溶液中，并&#160;将左心室（LV）从脂肪组织中分离出来，用于在离体血管灌流系统中插管。将灌流槽置于倒置显微镜载物台上，使用20倍物镜。血管依次以340 nm和380 nm波长的光激发，并通过CCD相机在510 nm处采集发射荧光光谱。连接显微镜的计算机生成收缩和Ca2+ 使用荧光捕获和边缘检测成像软件追踪。比例尺 = 1 mm。缩写：PSS = 生理盐溶液；LV = 淋巴管；CCD = 电荷耦合器件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66535/66535fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66535/66535fig04.jpg" /> 
图4：典型淋巴管（LV）收缩轨迹图。（A）在生理盐溶液（PSS）中，使用Ca2+成像指示剂Fura 2 AM负载的灌注式LV直径变化的记录示例；（B）放大轨迹图，以显示与血管收缩性相关的所有参数：EDD、ESD、AMP和频率。这些数值用于计算节律性和流量。缩写：PSS = 生理盐溶液；LV = 淋巴管；EDD = 舒张末期直径；ESD = 收缩末期直径；AMP = 幅度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66535/66535fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66535/66535fig05.jpg" /> 
图5：左心室Ca2+成像的代表性曲线。 （A）在PSS中灌流并负载Fura-2的左心室中绝对&#160;[Ca2+]i 变化的记录示例；（B）放大后的曲线，用于显示与[Ca2+]i 相关的所有参数（峰值、幅度和基线）（未进行背景校正）。缩写：PSS = 生理盐溶液。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66535/66535fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66535/66535fig06.jpg" /> 
图6：左心室收缩力与钙2+ 快速成像 代表性曲线对应于（A）直径，（B) 340/380 比值，以及 (C) 绝对 [Ca2+]i PSS 基线、硝苯地平（一种 Cav1.x (Ca2+通道拮抗剂，浓度反应，包括 R分钟 和 R最大值缩写：PSS = 生理盐溶液；LV = 淋巴管；NIF = 尼卡地平；R分钟 = 最小Fura-2荧光信号；R最大 = Fura-2 荧光信号的最大值 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66535/66535fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66535/66535fig07.jpg" /> 
图7钙2+ 由硝苯地平阻断的左心室振荡及相应收缩力 (A钙2+ （n = 3）和（B) 收缩性（n = 3）参数在加入维拉帕米（一种电压依赖性Cav1.x (Ca2+）通道拮抗剂。C) 代表性曼哈顿图显示平均时间间隔（&#916;t) 收缩间期、收缩期和舒张期时间。数据以均值表示 &#177; 扫描电子显微镜。缩写：PSS = 生理盐溶液；LV = 淋巴管；NIF = 尼卡地平；EDD = 舒张末期内径；AMP = 振幅 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66535/66535fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本方案描述了一种同时测量细胞质游离钙离子浓度［Ca²⁺］的方法2+]i 以及实时测量收缩性淋巴管的管径，随后计算绝对钙浓度2+ 浓度以及收缩力/节律性参数。该方案可用于研究 Ca2+ 在多种实验条件下收缩动力学的变化。

离体加压淋巴管中绝对胞质游离 Ca2+ 浓度与相应收缩力的实时评估

淋巴管系统，如今常被称为“第三循环”，存在于许多重要器官系统中。其主要机械……

我们研究淋巴管收缩的机制以及淋巴流动，以更深入地理解癌症相关淋巴水肿的潜在病理生理学，以及淋巴系统与高血压之间的关联。我们的目标是鉴定淋巴血管系统中的治疗靶点，从而为淋巴系统疾病开发新的治疗方法。近年来，在淋巴管平滑肌细胞和内皮细胞中发现的多种离子通道，因其参与调控细胞内钙离子动态变化，已被证明对推动该领域的发展具有重要作用。分离血管和活体显微镜技术对于研究淋巴管功能至关重要。近年来，使用器官芯片和微加工血管来研究淋巴生物学多个方面的趋势日益上升。由于组织尺寸极小，对淋巴血管系统的研究面临挑战，需要耗费大量时间、耐心，并推动新技术的开发。缺乏淋巴管肌细胞特异性标记物是整个科学界面临的另一大难题。本方案的优势在于能够在同一血管内同时测量淋巴管收缩活动和绝对钙离子浓度。这为钙信号传导、收缩机制的研究提供了更深入的见解，同时也使得不同处理组之间的基线比较成为可能，而其他技术可能仅依赖于钙离子的相对变化或使用已麻痹的血管进行测量。首先，取商用的硼硅酸盐玻璃微移液管。将其切割并抛光至约一到两厘米的长度，用于离体血管灌流室。将安装好的每根玻璃套管连接至独立的压力传感器，该传感器与独立的重力驱动压力调节器对齐，并通过聚乙烯管连接。用生理盐溶液反向灌注灌流室、玻璃微移液管、重力驱动压力调节器以及聚乙烯管，然后夹闭压力通路，确保套管未受压力作用。首先，取一根编织的丝线缝合线，将其分离成单根纤维。使用两把带有微钝尖端的杜蒙特5号镊子，用其中一把镊子在另一把镊子的尖端绕成双环，用形成环的镊子夹住缝合线的自由端，并小心地将其从两个环中拉出。使用瓦纳斯弹簧剪刀修剪两侧多余的缝合线。将安乐死的大鼠断头后，沿腹壁正中线做一纵向切口。然后将肠系膜游离出来，在幽门括约肌下方约距离盲肠上方两到三厘米处剪断连接，并剪断与直肠的连接。随后用200毫升冰冷的生理盐溶液冲洗完整剥离的肠系膜。随后，在体视显微镜下使用Dumont 5号不锈钢精细镊子和Vannas弹簧剪，将组织转移并固定于含冰冻生理盐溶液的硅胶衬里培养皿中，剥离肠系膜二级淋巴管周围的脂肪和结缔组织。接着将分离出的淋巴管转移至血管灌流腔室，准备在玻璃套管上进行插管。预先在每个玻璃套管上滑入一个打好结的线圈，以备后续将血管固定于套管时使用。取少量脂肪组织，确定淋巴管的走向，并将远端套入P1端。将结向导管方向滑动并扎紧，以固定淋巴管。随后在灌流室中将淋巴管加压至4至5毫米汞柱。在浴槽室中放置一个通有7%二氧化碳和93%氧气的鼓泡石，以维持生理pH值，将浴槽室连接至温度调节器，并设定为37摄氏度。首先，分离并插管已处死大鼠的肠系膜淋巴管。在灌流室中对淋巴管加压，使其平衡并产生稳定的自发性收缩。然后在避光条件下，将淋巴管与Fura-2-乙酰甲氧基酯（Fura-2-acetoxymethyl ester）和普鲁尼克酸（pluronic acid）共同孵育30分钟。孵育结束后，使用负压真空装置排空整个浴槽液体，并用温度匹配的无试剂生理盐溶液冲洗三次。随后，将淋巴管在避光条件下继续孵育额外15分钟，以去除多余的染料并完成去酯化反应。接着，将样品室转移至配备LED光源、20倍荧光物镜、细胞定位适配器和相机的倒置荧光显微镜下，进行每秒15帧的荧光信号采集。将显微镜连接至配备成像软件的计算机，以记录荧光信号并进行边缘检测。启动LED光源和荧光系统接口。然后运行Ion wizard软件。在文件选项卡下，选择“新建”选项。然后转到采集选项卡，选择实验。加载所需的实验模板，然后点击确定。单击屏幕底部的开始按钮以启动实验。接下来，调整屏幕上的曲线，按降序显示血管直径、340 信号、380 信号和比值。如需修改 Y 轴刻度以获得更好的曲线可视化效果，请进入“Traces”选项。确保取消勾选自动限制，并选择编辑用户限制。选择要调整的参数。输入坐标轴的最小值和最大值，然后选择确定以确认。使用边缘检测软件，调节光照条件，使淋巴管壁呈现为深色线条。选择一个无脂肪和碎片的感兴趣区域（ROI），并确保该区域在后续操作中保持固定。设置阈值，以确保在整个收缩周期中均能检测到血管壁的边缘。使用LED照明器激活光电倍增管后，交替采用340和380纳米波长，以50毫秒曝光时间激发Fura-2，以15赫兹的频率在整个成像视野中采集510纳米处的发射光谱。为测量信噪比，首先将淋巴管置于视野中央，获取340和380荧光信号。随后将视野移至浴槽边缘无血管处，以采集背景信号，接着用温度匹配的无试剂生理盐溶液更换浴槽溶液。为去除过量的Fura 2染料，记录约30分钟的Fura 2荧光基线信号及自发性收缩。然后记录硝苯地平的累积浓度反应，并对每种药物浓度获取背景测量值。每次实验结束时，用温度匹配的无钙生理盐溶液冲洗淋巴管，以获得无钙离子条件下Fura 2荧光信号的最小值和淋巴管的最大直径；随后将浴槽溶液更换为含10毫摩尔钙离子并加入离子霉素的温度匹配生理盐溶液，以获得钙离子饱和条件下Fura 2荧光信号的最大值和淋巴管的最小直径。钙峰振幅、基础钙水平和峰值钙等参数随着向灌流室中逐步添加硝苯地平而呈浓度依赖性降低。同时，收缩参数如收缩频率、幅度以及计算流速也均表现出逐步下降的趋势。曼哈顿图显示了各淋巴管在节律性指标上的个体反应，包括收缩间隔、收缩时间和舒张时间。

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Immunology and Infection

免疫学与感染

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离体加压淋巴管中绝对胞质游离 Ca²⁺ 浓度与相应收缩力的实时评估

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