Name: 基于神经胶质转录组谱的阿尔茨海默病性别特异性生物标志物鉴定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 22 s
Description: 了解如何利用生物信息学方法分析GEO数据库中的单核转录组数据，以识别阿尔茨海默病神经胶质细胞中的性别特异性差异表达基因和潜在治疗靶点。

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作者感谢 Jessica S Sadick、Michael R O'Dea、Philip Hasel 等人提供了 GSE167490 数据集。作者感谢 Faten A Sayed、Lay Kodama、Li Fan 等人提供了 GSE183068 数据集。作者感谢刘书晴在数据分析方面的帮助，以及杨雯提供数据分析平台。本研究受到国家自然科学基金（82174511）、成都中医药大学杏林学者计划、学科人才科研提升项目（QJJJ2022001）、辽宁省兴辽人才计划（XLYC 1807083）、四川省中医药管理局基金（2023MS578）、国家级大学生创新创业训练计划项目（202310633003X）以及成都中医药大学大学生科研实践创新课题（ky-2023100）的资助。刘汉杰和杨慧参与了研究设计、数据收集与解释，以及论文的撰写和修改。刘书晴和李思雨参与了研究设计、数据收集及论文撰写。杨雯和 Anwar Ayesha 负责数据收集与解释。谭鑫负责图表的制作。蒋岑、刘毅和谢露霜提出了研究构想，并对稿件进行了审阅和修改。所有作者均对文章作出了贡献，并认可所提交的版本。

分析的第2至第9步使用R软件实现（参见补充图1和补充文件1），其余步骤则在在线平台上执行。本方案中所用数据库的详细信息（含网址）见材料表。
1. 数据采集
<ol>
	<li>访问美国国家生物技术信息中心（NCBI）提供的公开 Gene Expression Omnibus (GEO) 数据库。</li>
	<li>在搜索框中查找名为 阿尔茨海默病 的 GEO 数据。</li>
	<li>在右侧选择 主要生物体 为 Homo sapiens。 
	注：搜索结果为关于 Homo sapiens 阿尔茨海默病的数据。</li>
	<li>筛选检索结果后，下载 GSE167490 和 GSE183068 数据文件，每个单细胞核样本均包含 features.tsv、barcode.tsv 和 matrix.mtx 文件。该数据集包含来自额叶皮层的 34 个阿尔茨海默病样本，其中男性样本和女性样本各 17 个（补充表 1）。</li>
</ol>
2. 样本合并
<ol>
	<li>在计算机上相应地配置数据路径和样本名称。导入34个已下载的样本，并使用函数 names 为样本分配性别特异性的名称。</li>
	<li>使用函数 list 和 Read10X 以批量处理方式为所有样本生成 Seurat 对象，参数设置为 min.cells = 3 和 min.features = 200。</li>
	<li>使用 RenameCells 函数将样本 ID 作为前缀添加到细胞条形码中，以便在合并过程中保留细胞条形码。这确保了每个细胞在合并后仍保持其唯一身份，并可追溯至其原始样本来源。</li>
</ol>
3. 质量控制（QC）
<ol>
	<li>使用 PercentageFeatureSet 函数计算每个细胞的线粒体基因比例、红细胞基因比例和核糖体基因比例。</li>
	<li>使用 [[ ]] 操作符将这些计算得到的比例存储到元数据中，以便将该信息直接附加到每个细胞的元数据中。</li>
	<li>利用 subset 函数进行细胞过滤，设定参数为 nFeature_RNA &#62; 200，nFeature_RNA &#60; 10000，nCount_RNA &#60; 60000，percent.mt &#60; 10，percent.rb &#60; 5，以及 percent.HB &#60; 75。</li>
	<li>从分析中排除 GSM5106107。</li>
</ol>
4. 批次效应检测
<ol>
	<li>进行数据处理。
	<ol>
		<li>使用 NormalizeData 函数对数据进行归一化。</li>
		<li>使用 FindVariableFeatures 函数识别数据集中前 2000 个高变特征。</li>
		<li>使用 RunPCA 对数据进行主成分分析（PCA）17，保留 50 个主成分。</li>
		<li>使用 ElbowPlot 函数生成肘部图，以确定后续分析的最佳维度数。考虑前 50 个维度。</li>
		<li>使用 ScaleData 对数据进行缩放，以确保所有特征处于可比较的尺度上。</li>
		<li>基于 30 个维度，使用 FindNeighbors 识别最近邻。</li>
		<li>使用 RunUMAP 应用 UMAP 算法，将数据的维度降低至 30 维。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 DimPlot 函数对处理后的数据进行可视化，其中 reduction 参数设置为 umap，group.by 参数设置为 orig.ident。 
	注意：此步骤可生成在降维后的 UMAP 空间中按原始细胞身份分组的数据可视化图。通过检查 UMAP 图发现存在批次效应。细胞根据其批次或实验来源呈现出明显的聚类或分离，表明实验批次影响了基因表达谱。</li>
</ol>
5. 数据整合
<ol>
	<li>使用 SCTransform 函数对数据进行归一化和标准化。</li>
	<li>应用 harmony 算法18 整合其余的 33 个单细胞核数据。使用 SCT 检测进行整合，并将 harmony 算法的最大迭代次数设置为 20。</li>
	<li>使用 FindClusters 函数，并将分辨率参数设为 0.07，以识别数据中的不同聚类。</li>
	<li>使用 RunUMAP 函数，并指定降维维度数（dims = 30），进一步降低数据维度，并在低维空间中可视化聚类结果。</li>
</ol>
6. 细胞类型注释
<ol>
	<li>通过广泛查阅现有文献，收集细胞的标志基因（补充表 2）。</li>
	<li>在确定细胞簇异质性后，根据特异性表达的标志基因对每个细胞簇的类型进行分类。</li>
	<li>使用 ggplot2 软件包进行 UMAP 可视化，展示多种细胞类型，其中少突胶质细胞用颜色代码 #DB7093 标注，兴奋性神经元用 #FF69B4，星形胶质细胞用 #1874CD，小胶质细胞用 #63B8FF，少突胶质前体细胞用 #DB7093，抑制性神经元用 #FFC0CB，内皮细胞用 #FF69B4。</li>
	<li>按性别分层计算各类细胞类型的占比。</li>
</ol>
7. 胶质细胞数据提取
<ol>
	<li>使用 subset 函数从整合的批量数据中提取星形胶质细胞数据。</li>
	<li>使用 subset 函数从整合的批量数据中提取小胶质细胞数据。</li>
	<li>使用 subset 函数从整合的批量数据中提取少突胶质细胞数据。</li>
</ol>
8. 胶质细胞性别特异性差异表达基因（DEGs）的获取
<ol>
	<li>使用 FindMarkers 函数（ident.1 = male，ident.2 = female，group.by = group.sum，assay = RNA）识别星形胶质细胞的性别特异性差异表达基因（DEGs），设定阈值：p-值 &#60; 0.05 且 |avg_log2FC| &#62; 30。将上调的差异表达基因标记为 Up，下调的差异表达基因标记为 Down，其余标记为 Stable。
	<ol>
		<li>使用 ggplot 函数对差异表达基因进行可视化，横轴表示两种条件下百分比的差异（pct.1 - pct.2），纵轴表示 avg_log2FC。上调基因以 PaleVioletRed 颜色突出显示，下调基因以 Pink 颜色突出显示，稳定表达基因以 DodgerBlue3 颜色突出显示。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 FindMarkers 函数（ident.1 = male，ident.2 = female，group.by = group.sum，assay = RNA）识别小胶质细胞的性别特异性差异表达基因（DEGs），设定阈值：p-值 &#60; 0.05 且 |avg_log2FC| &#62; 1。将上调的差异表达基因标记为 Up，下调的差异表达基因标记为 Down，其余标记为 Stable。
	<ol>
		<li>使用 ggplot 函数对差异表达基因进行可视化，横轴表示两种条件下百分比的差异（pct.1 - pct.2），纵轴表示 avg_log2FC。上调基因以 OrangeRed 颜色突出显示，下调基因以 LightSalmon 颜色突出显示，稳定表达基因以 SteelBlue1 颜色突出显示。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 FindMarkers 函数（ident.1 = male，ident.2 = female，group.by = group.sum，assay = RNA）识别少突胶质细胞的性别特异性差异表达基因（DEGs），设定阈值：p-值 &#60; 0.05 且 |avg_log2FC| &#62; 10。将上调的差异表达基因标记为 Up，下调的差异表达基因标记为 Down，其余标记为 Stable。
	<ol>
		<li>使用 ggplot 函数对差异表达基因进行可视化，横轴表示两种条件下百分比的差异（pct.1 - pct.2），纵轴表示 avg_log2FC。上调基因以 DeepPink 颜色突出显示，下调基因以 HotPink 颜色突出显示，稳定表达基因以 DeepSkyBlue3 颜色突出显示。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 性别特异性差异表达基因的功能富集分析
<ol>
	<li>使用 enrichGO 函数对每种胶质细胞类型的性别特异性差异表达基因（DEGs）进行基因本体（GO）富集分析。设置以下参数：OrgDb = org.Hs.eg.db，keyType = SYMBOL，ont = ALL，pAdjustMethod = BH，pvalueCutoff = 0.01，以及 qvalueCutoff = 0.05。</li>
	<li>使用 bitr 函数将基因符号转换为对应的基因 ID。利用 enrichKEGG 函数对每种胶质细胞类型的性别特异性差异表达基因（DEGs）进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。调整设置如下：organism = hsa，keyType = kegg，pAdjustMethod = BH，pvalueCutoff = 0.01，以及 qvalueCutoff = 0.05。</li>
</ol>
10. 小胶质细胞差异表达基因在 GO 和 KEGG 通路中的频率统计、各类小胶质细胞性别特异性差异表达基因的维恩图，以及蛋白质相互作用网络构建
<ol>
	<li>使用频率直方图计算胶质细胞性别特异性差异表达基因（DEGs）在GO和KEGG通路中的出现频率。</li>
	<li>访问STRING数据库以构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。</li>
	<li>选择 Multiple proteins。在搜索框中输入 List Of Names。将 &#34;Organisms&#34; 设置为 Homo sapiens。</li>
	<li>查看搜索得到的蛋白质列表，点击 Continue 继续操作。</li>
	<li>通过选择 download 选项导出PPI网络，建议以高分辨率的PNG格式保存。</li>
	<li>利用维恩图（Venn diagrams）可视化展示前几位性别特异性基因的共表达分布情况。</li>
	<li>根据维恩图分析结果，确定共有的基因作为本研究中的关键基因。</li>
</ol>
11. 多因子调控网络构建
<ol>
	<li>访问 NetworkAnalyst。</li>
	<li>点击 Gene List Input，并将生物体指定为 H. sapiens (human)。将 ID 类型设置为 Official Gene Symbol。在搜索框中输入基因名称，然后点击 Upload 和 Proceed。</li>
	<li>选择 Gene-miRNA Interactions ，并选择 miRTarBase v8.0。点击 OK 确认选择。</li>
	<li>进入 TF-gene Interactions ，选择 ENCODE 数据库。点击 OK 确认选择。</li>
	<li>接下来，进入 TF-miRNA Coregulatory Network，点击 OK 继续。</li>
	<li>最后，选择 Proceed 以生成整合了基因-miRNA 相互作用和转录因子-基因相互作用的多因素调控网络。</li>
</ol>
12. 基因与靶点中药分析
<ol>
	<li>访问 Coremine Medical 在线数据库。</li>
	<li>输入特定基因名称，并在 Explore 部分的搜索框中选择后缀为 gene/protein, human 的对应基因。</li>
	<li>浏览 Drugs 部分，识别与所搜索药物相关的中药。 
	注意：具有统计学意义的药物以蓝色标记。</li>
	<li>根据其&#34;significance&#34;值确定排名前五的中药作为治疗用中药。</li>
</ol>
13. 中药成分靶向关键基因的研究概述
<ol>
	<li>访问基于整合药理学的中医药研究平台（TCMIP）及中医药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）。在搜索栏中输入药材名称，以获取其对应的有效成分。</li>
	<li>在 PubMed 数据库中检索截至 4 月 10 日的文献资料th，2023年。所使用的检索词包括 分子名称 在TCMSP和 化学成分 在TCMIP中以搜索词进行检索，并限定为英文发表的文章。</li>
	<li>总结并分析作用于阿尔茨海默病（AD）的草药及其相应成分。</li>
</ol>
14. 验证中药治疗功能在阿尔茨海默病性别特异性中的靶向作用
<ol>
	<li>将草药导入TCMIP，并导航至相应的描述页面。</li>
	<li>使用导出数据功能，选择CSV格式，下载GO - 生物过程、GO - 细胞组分、GO - 分子功能以及Reactome通路的富集术语。</li>
	<li>使用柱状图可视化每种草药的已下载富集术语。</li>
</ol>

Sex-Specific Glial Biomarkers in Alzheimer&#39;s Disease: A Transcriptome Analysis

<ol><li>Alzheimers Dement. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease+facts+and+figures%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Dement%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease facts and figures.</a> Alzheimers Dement. 19 (4), 1598-1695 (2023).</li>
<li>Xie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroacupuncture+improves+M2+microglia+polarization+and+glia+anti-inflammation+of+hippocampus+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Electroacupuncture improves M2 microglia polarization and glia anti-inflammation of hippocampus in Alzheimer's disease.</a> Front Neurosci. 15, 689629(2021).</li>
<li>Xie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+factors+and+amyloid+beta-induced+microglial+polarization+promote+inflammatory+crosstalk+with+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">Inflammatory factors and amyloid beta-induced microglial polarization promote inflammatory crosstalk with astrocytes.</a> Aging (Albany NY). 12 (22), 22538-22549 (2020).</li>
<li>Hampel, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid-beta+pathway+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The amyloid-beta pathway in Alzheimer's disease.</a> Mol Psychiatry. 26 (10), 5481-5503 (2021).</li>
<li>Baik, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+breakdown+in+metabolic+reprogramming+causes+microglia+dysfunction+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">A breakdown in metabolic reprogramming causes microglia dysfunction in Alzheimer's disease.</a> Cell Metab. 30 (3), 493-507 (2019).</li>
<li>Fisher, D. W., Bennett, D. A., Dong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+dimorphism+in+predisposition+to+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Sexual dimorphism in predisposition to Alzheimer's disease.</a> Neurobiol Aging. 70, 308-324 (2018).</li>
<li>Pan, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+feedback+regulation+of+microglial+glucose+metabolism+by+histone+h4+lysine+12+lactylation+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Positive feedback regulation of microglial glucose metabolism by histone h4 lysine 12 lactylation in Alzheimer's disease.</a> Cell Metab. 34 (4), 634-648 (2022).</li>
<li>Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microglia in Alzheimer's disease.</a> J Cell Biol. 217 (2), 459-472 (2018).</li>
<li>Brandebura, A. N., Paumier, A., Onur, T. S., Allen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+contribution+to+dysfunction%2C+risk+and+progression+in+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte contribution to dysfunction, risk and progression in neurodegenerative disorders.</a> Nat Rev Neurosci. 24 (1), 23-39 (2023).</li>
<li>Peng, L., Bestard-Lorigados, I., Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synapse+as+a+treatment+avenue+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The synapse as a treatment avenue for Alzheimer's disease.</a> Mol Psychiatry. 27 (7), 2940-2949 (2022).</li>
<li>Tubi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White+matter+hyperintensities+and+their+relationship+to+cognition%3A+Effects+of+segmentation+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">White matter hyperintensities and their relationship to cognition: Effects of segmentation algorithm.</a> Neuroimage. 206, 116327(2020).</li>
<li>Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+single-nucleus+over+single-cell+RNA+sequencing+of+adult+kidney%3A+Rare+cell+types+and+novel+cell+states+revealed+in+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis.</a> J Am Soc Nephrol. 30 (1), 23-32 (2019).</li>
<li>Soreq, L., Bird, H., Mohamed, W., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+analysis+of+human+Alzheimer%27s+disease+brain+samples+reveals+neuronal+and+glial+specific+cells+differential+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing analysis of human Alzheimer's disease brain samples reveals neuronal and glial specific cells differential expression.</a> PLoS One. 18 (2), e0277630(2023).</li>
<li>Sadick, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+and+oligodendrocytes+undergo+subtype-specific+transcriptional+changes+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Astrocytes and oligodendrocytes undergo subtype-specific transcriptional changes in Alzheimer's disease.</a> Neuron. 110 (11), 1788-1805 (2022).</li>
<li>Chen, Y., Colonna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+Alzheimer%27s+disease+at+single-cell+level.+Are+there+common+patterns+in+humans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Microglia in Alzheimer's disease at single-cell level. Are there common patterns in humans and mice.</a> J Exp Med. 218 (9), e20202717(2021).</li>
<li>Brase, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+RNA-sequencing+of+autosomal+dominant+Alzheimer+disease+and+risk+variant+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus RNA-sequencing of autosomal dominant Alzheimer disease and risk variant carriers.</a> Nat Commun. 14 (1), 2314(2023).</li>
<li>Ringner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+principal+component+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">What is principal component analysis.</a> Nat Biotechnol. 26 (3), 303-304 (2008).</li>
<li>Korsunsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sensitive+and+accurate+integration+of+single-cell+data+with+harmony%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">sensitive and accurate integration of single-cell data with harmony.</a> Nat Methods. 16 (12), 1289-1296 (2019).</li>
<li>Vegeto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+sex+and+sex+hormones+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">The role of sex and sex hormones in neurodegenerative diseases.</a> Endocr Rev. 41 (2), 273-319 (2020).</li>
<li>Hafemeister, C., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+and+variance+stabilization+of+single-cell+RNA-seq+data+using+regularized+negative+binomial+regression%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression.</a> Genome Biol. 20 (1), 296(2019).</li>
</ol>

本手稿不存在利益冲突，所有作者均已批准该投稿发表。

阿尔茨海默病（AD）的流行病学、病理学及临床表现中已发现性别特异性19。本研究通过分析AD患者中具有性别特异性的胶质基因及相关通路，进一步证实了“激素-突触-神经元轴”潜在的病理机制。NLGN4Y 是三种胶质细胞中唯一共有的基因，被选为AD性别特异性的生物标志物。调控NLGN4Y的转录因子（TF）和miRNA与性别差异及神经系统发育密切相关。此外，靶向中药昆布和麻黄被认为可能影响“激素-突触-神经元轴”，并通过调节性别特异性，成为AD治疗的潜在候选药物。
与其他整合算法相比，Harmony算法在整合稀有细胞数据、优化大样本的内存使用和计算速度，以及适应具有多样化细胞来源和技术平台的复杂实验设计方面具有显著优势18。质控和数据整合步骤是提高分析准确性和可靠性的关键环节，使研究人员能够更深入地理解阿尔茨海默病及其他神经退行性疾病的生物学机制。严谨执行这些步骤对于获得单细胞核RNA测序实验结果的整体质量和有效性至关重要。
本方案中的一项改进是使用 SCTransform 函数对数据进行归一化和标准化20。此步骤确保了数据在后续分析中具有可比性和一致性。为减轻批次效应，额外进行了数据整合步骤，有助于校正批次效应并提高结果的准确性。当其中一个样本（GSM5106107）的表现与其他样本相比出现异常时，进行了故障排查，并将其从分析中剔除。
本研究的一个局限性在于所采用的样本量相对较小，这可能会限制研究结果对更广泛人群的代表性。此外，使用来自多个实验室和研究团队的数据引入了内在的异质性，可能限制了结果的可重复性和普适性。尽管通过基因-转录因子-miRNA共调控网络鉴定了NLGN4Y的关键调控因子，但仍需进一步的实验验证以明确这些调控因子的功能作用及其潜在机制。虽然富集分析提示麻黄和昆布可能是性别特异性阿尔茨海默病治疗的潜在候选药物，但仅依赖生物信息学预测不足以确立其有效性和安全性。验证这些有前景药物的治疗效果，还需开展额外的实验和临床研究。
本研究中阐述的方法在多个研究领域展现出显著潜力，特别是在阿尔茨海默病（AD）中胶质细胞性别特异性差异表达基因（DEGs）的识别方面。此类研究有望阐明男性与女性个体之间细微的致病差异，从而推动性别特异性治疗策略的制定。此外，该方法还可应用于其他神经退行性疾病，有助于识别性别特异性的差异表达基因，并加深对这些疾病潜在机制的理解。
综上所述，本研究提出了一种全面且稳健的分析阿尔茨海默病（AD）患者单细胞核RNA测序数据的实验方案，有望为开发个体化治疗干预措施铺平道路。此外，本研究中采用的方法可推广至其他神经退行性疾病，有助于揭示性别特异性的基因表达模式，并加深对这些复杂疾病的理解。

阿尔茨海默病（AD）是一种发病率较高的全球性疾病，占痴呆病例的60%–80%1。尽管其发病率高，但AD的发病机制尚未明确，迄今为止尚无有效的治疗方法2。AD的主要病理特征为神经元萎缩以及病理性物质的积聚，主要包括微管相关蛋白Tau和β-淀粉样蛋白（Aβ）3,4。AD的发病机制与自噬异常、氧化应激、线粒体功能障碍、炎症反应及能量代谢紊乱相关5。流行病学调查显示，三分之二的AD患者为女性6。AD在病因学、临床表现、预防和治疗方面均存在性别差异。因此，揭示导致AD性别差异的生物学机制，并结合中医药（TCM）进行干预，有望为深入理解AD的发病机制提供更全面的理论框架，并进一步指导精准治疗策略的制定。
神经胶质细胞，尤其是小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞，可能参与阿尔茨海默病（AD）的发病机制。在 AD 中，小胶质细胞被激活并发生遗传学改变，从而参与炎症反应、吞噬作用以及 Aβ 的清除7,8；星形胶质细胞发生遗传学改变，影响突触活动、离子稳态以及能量和脂质代谢9；少突胶质细胞则表现出性别特异性的遗传学改变，参与神经元丢失、神经原纤维缠结以及白质病变10,11。
本研究采用单核RNA测序（snRNA-seq）作为一项更优越的技术。与单细胞RNA测序（scRNA-seq）相比，snRNA-seq在样本丰富度、细胞类型完整性和数据可靠性方面具有优势12,13。snRNA-seq已被广泛应用于聚焦阿尔茨海默病（AD）并探索胶质细胞作用的研究中14,15,16。在这些研究领域的广泛应用凸显了snRNA-seq在揭示AD中胶质细胞转录特征方面的有效性。通过利用snRNA-seq的优势，研究人员已能够揭示胶质细胞在AD病理过程中的关键作用，并识别潜在的治疗靶点。为探索AD中性别特异性的神经胶质转录特征及针对AD性别差异的潜在中药（TCMs），本研究分析了来自NCBI GEO公共数据库中AD患者额叶皮层的snRNA-seq数据。进一步分析了性别特异性的差异表达基因（DEGs）、基因本体（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络以及基因-TF-miRNA网络，以揭示关键生物标志物和潜在发病机制。最后，通过检索Coremine Medical、TCMIP和TCMSP数据库，提出了潜在的中药，并以表格形式展示了其活性成分。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;数据库&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coremine Medical 数据库</td><td>由挪威、中国科学院、中国医学科学院、美国国家医学图书馆及其他机构联合开发</td><td></td><td>当您在 CoreMine Medical 中探索概念时，您将访问一个结构化的数据库，该数据库会根据统计相关性将重要概念与您的主题相关联并进行排序。例如，如果您输入 &quot;阿尔茨海默病，&quot; 除了检索讨论该疾病的文献和资源外，您还将能够查看网络和列表，以展示您的查询概念与其他生物医学概念之间的关联。这不仅为您提供了与检索主题相关概念的概览，还作为浏览这些概念相关信息的界面。&lt;br/&gt; 链接：https://coremine.com/medical/</td></tr><tr><td>基因表达综合数据库（GEO）</td><td>美国国家生物技术信息中心（NCBI）</td><td></td><td>GEO 是一个公共功能基因组学数据存储库，支持符合 MIAME 标准的数据提交。该数据库接收基于芯片和测序的数据。同时提供多种工具，帮助用户查询和下载实验数据以及经过审编的基因表达谱。&lt;br/&gt; 网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/</td></tr><tr><td>基于整合药理学的中药研究平台（TCMIP，版本：2.0）</td><td>无</td><td></td><td>基于整合药理学的中医药网络计算研究平台（TCMIP v2.0）简介，http://www.tcmip.cn/）该平台是以《中药百科全书》（ETCM）在线数据库为基础的智能数据挖掘平台，集成了中医药大数据管理与药理学计算服务。其目标在于揭示中医药理论的科学内涵与中医药原创思维的科学价值，总结并传承名医经验，控制中药质量，阐释中药作用原理，开展中药新药研发，特别是现代药物组合的发现与优化，提供坚实的数据基础与分析工具。在TCMIP v1.0基础上进行了全面升级，包含五大数据库与七大功能模块。通过系统集成与模块整合，实现对多层级关联的综合分析 &quot;病证方剂&quot; 交互网络可快速构建。作为智能化数据挖掘平台，TCMIP v2.0 将为揭示中医理论的科学内涵和中医原创思维的科学价值、名老中医经验的总结与传承、中药质量控制、中药药理作用机制阐释、中药新药研发，特别是现代中药复方发现与优化，提供坚实的数据基础与分析平台。&lt;br/&gt; 网址：http://www.tcmip.cn/TCMIP&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NetworkAnalyst</td><td>无</td><td></td><td>Networkanalyze 是一个用于基因表达分析和荟萃分析的在线可视化分析平台。该平台可进行基因表达的比较、定量、差异和富集分析，蛋白质-蛋白质相互作用分析，多数据集整合分析，并能够绘制高价值图像，如 PCA 图、蛋白质-蛋白质相互作用网络图、热图、火山图、韦恩图等。&lt;br/&gt; 网址：https://www.networkanalyst.ca/NetworkAnalyst/</td></tr><tr><td>PubMed 数据库</td><td>美国国家生物技术信息中心（NCBI）</td><td></td><td>PubMed 数据库是由美国国家医学图书馆（NLM）维护的生物医学文献数据库，旨在向全球的科学家、医生、研究人员和学生提供最新的医学研究成果。该数据库收录了来自世界各地的生物医学文献，包括期刊文章、论文、书籍等。截至目前，PubMed 数据库已收录超过 3000 万篇文章，并每周持续更新。&lt;br/&gt; 链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/</td></tr><tr><td>R 软件</td><td>Ross Ihaka 和 Robert Gentleman</td><td></td><td>R 是一种用于统计计算和图形的语言及环境。它是一个 GNU 项目，类似于由贝尔实验室（原 AT&T）开发的 S 语言和环境。&amp;amp;T（现为 Lucent Technologies）的 John Chambers 及其同事开发。R 可以被视为 S 的一种不同实现。存在&lt;br/&gt; 一些重要的差异，但为 S 编写的许多代码在 R 中无需修改即可运行。&lt;br/&gt; 网址：https://www.r-project.org/</td></tr><tr><td>传统中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）</td><td>浙江九维健康有限公司</td><td></td><td>TCMSP 不仅是一个数据仓库，还是一个分析平台，供用户全面研究中药（TCM）：包括活性成分的鉴定、药物靶点的筛选、化合物-靶点-疾病网络的构建，以及涉及类药性（DL）、口服生物利用度（OB）、血脑屏障（BBB）、肠道上皮渗透性（Caco-2）、ALogP、负性表面积分数（FASA-）和分子中负电荷原子数量的详细药物药代动力学信息 &amp;nbsp;氢键&amp;nbsp;供体/受体 &amp;nbsp;(黄酮/黄酮醇含量)。迄今为止，TCMSP 已引起广泛关注，多个研究团队在约一年内利用我们的 TCMSP 数据库发表了十余篇论文。&lt;br/&gt; 网址：https://tcmsp-e.com</td></tr></tbody></table>

基于胶质细胞转录组谱的阿尔茨海默病性别特异性生物标志物鉴定

Biomarker Identification for Gender Specificity of Alzheimer's Disease Based on the Glial Transcriptome Profiles

近年来，阿尔茨海默病（AD）中已发现多种性别特异性生物标志物；然而，关于脑内胶质细胞的研究却鲜有报道。本研究分析了来自GEO数据库中33名AD个体额叶皮层的220,095个单细胞核转录组数据。在胶质细胞中鉴定了性别特异性的差异表达基因（DEGs），包括星形胶质细胞中的243个、小胶质细胞中的1,154个以及少突胶质细胞中的572个。基因本体（GO）功能注释分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析显示，这些基因功能主要集中于突触、神经及激素相关通路。蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI）分析鉴定出星形胶质细胞中的关键基因为MT3、CALM2、DLG2、KCND2、PAKACB、CAMK2D和NLGN4Y；小胶质细胞中的关键基因为TREM2、FOS、APOE、APP和NLGN4Y；少突胶质细胞中的关键基因为GRIN2A、ITPR2、GNAS和NLGN4Y。其中，NLGN4Y是唯一在三类胶质细胞中均存在的共享基因，被确定为AD性别特异性的生物标志物。基因-转录因子（TF）-miRNA共调控网络分析揭示了NLGN4Y及其靶向中药（TCMs）的关键调控因子。研究鉴定出昆布（Ecklonia kurome Okam）和麻黄（Herba Ephedrae）两种中药，并展示了其活性成分对AD的作用。最后，对昆布和麻黄的富集分析表明，它们可能作为针对AD性别特异性的潜在治疗候选药物。

本研究分析了33名阿尔茨海默病（AD）患者的单细胞核转录组，揭示了胶质细胞中与性别相关的差异表达基因（DEGs）。功能富集分析强调了突触、神经及激素相关通路的作用。研究鉴定了关键基因NLGN4Y及其调控因子，并提出了针对性别特异性AD的潜在治疗靶点。

近年来，阿尔茨海默病（AD）中已发现多种性别特异性生物标志物；然而，关于脑内胶质细胞的研究却鲜有报道。本研究……

本研究旨在鉴定胶质细胞中与性别相关的基因，探索其相关通路，并评估中药对阿尔茨海默病的潜在治疗作用。本方案通过生物信息学分析，对来自GEO数据库的大量单细胞核转录组数据进行解析。本方案具有多项优势，包括单细胞分辨率、利用CTAP进行生物标志物发现，以及对不同性别间差异表达的比较分析。我们的实验室将专注于神经科学领域，重点研究利用针灸增强神经系统疾病治疗效果的参数。首先，下载用于样本合并的阿尔茨海默病数据文件，并配置数据路径及样本名称。导入下载的样本，并在函数名称下为它们分配性别特异性的名称。使用 Read10X 中的函数列表，以批量处理方式为所有样本生成 Seurat 对象，并将最小细胞数设为 3，最小基因数设为 200。利用 RenameCells 函数，将样本 ID 作为前缀添加到细胞条形码中，以便在合并过程中保留样本信息。进行质控时，使用 PercentageFeatureSet 函数计算每个细胞的线粒体、红细胞及核糖体基因的比例。使用双方括号运算符将这些计算得到的比值存储在元数据中，以便将该信息直接附加到每个细胞的元数据上。利用 subset 函数，根据 RNA、线粒体、核糖体和红细胞的适当参数进行细胞过滤。使用 NormalizeData 函数对数据进行标准化。使用 FindVariableFeatures 识别数据集中最显著的 2000 个可变特征。利用 RunPCA 对数据进行主成分分析，保留 50 个主成分。通过 ElbowPlot 函数生成肘部图，以确定后续分析的最佳维度数。在考虑前 50 个维度的情况下，选择对数据进行缩放，以使所有特征处于可比较的尺度上。使用 FindNeighbors 函数，基于 30 个维度确定最近邻，并运行 UMAP 算法将数据的维度降低至 30 个维度。选择 DimPlot 函数，将 reduction 参数设置为 UMAP，以可视化处理后的数据及其分组。将参数集设置为原始身份。使用 SCTransform 函数对数据进行归一化和标准化，并应用 harmony 算法整合剩余的单细胞核数据。选择 SCT 检测法用于整合，并将 harmony 算法的最大迭代次数设置为 20。然后运行 FindClusters 函数，并将分辨率参数设置为 0.07，以识别数据中的不同簇，同时使用 RunUMAP 函数进一步降低数据的维度，并在低维空间中可视化这些簇。对于细胞类型注释，通过明确表达的标记基因来鉴定细胞簇的异质性，并对每个簇的细胞类型进行分类。利用 ggplot2 软件包通过 UMAP 可视化展示各种细胞类型，其中不同细胞类型以不同的颜色编码突出显示。最后，计算按性别分层的每种细胞类型的比例。通过该方法，分析了17名男性和17名女性阿尔茨海默病患者数据中按性别划分的各类细胞比例。将已知胶质细胞类型标记基因的平均表达水平投射到UMAP图上，以鉴定细胞群体。

biomarker-identification-for-gender-specificity-alzheimer-s-disease

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

基于神经胶质转录组谱的阿尔茨海默病性别特异性生物标志物鉴定

我们介绍一种制备澄清的人类大脑皮层匀浆物的技术，通过SDS-PAGE进行蛋白质分离，抗原修复，并使用针对Aβ肽的抗体进行免疫印迹。采用该方案，我们能够持续在患有阿尔茨海默病病理的人类皮层组织中检测到单体及多聚体形式的Aβ。...

利用抗原表位修复法通过SDS-PAGE/免疫印迹检测人脑皮层组织匀浆中的Aβ多聚体

一种使用尿素/硫脲/SDS缓冲液从人和小鼠脑组织中提取蛋白质的常用方法，可实现通过二维差异凝胶电泳（2D-DIGE）对蛋白质进行鉴定，并随后通过微型二维电泳免疫印迹法（mini 2DE...

共识脑源性蛋白质提取方案：用于人和小鼠脑蛋白质组研究的双向差异凝胶电泳与微型双向电泳免疫印迹法

我们描述了一种高通量、多重靶向的脑脊液（CSF）蛋白质组学检测方法，具有临床转化潜力。该检测可定量神经退行性变的潜在标志物和风险因素，例如载脂蛋白E的变异体（E2、E3和E4），并测量其等位基因表达水平。...

一种高通量、多重靶向蛋白质组学脑脊液检测方法，用于定量神经退行性生物标志物及载脂蛋白E亚型状态

我们开发了一种定量三维方法 计算机模拟 脑部建模（q3DISM） 淀粉样蛋白-β（Aβ） 阿尔茨海默病啮齿类动物模型中单核吞噬细胞的吞噬作用。该方法可广泛用于几乎任何吞噬事件的定量分析 体内.

阿尔茨海默病啮齿类动物模型中脑内淀粉样蛋白-β吞噬作用的定量三维in silico建模（q3DISM）

在此，我们介绍一种用于精确测量张力性和时相性细胞外谷氨酸变化的空间和时间分辨方法的实验装置搭建、软件操作及数据分析流程 体内 使用酶联微电极阵列（MEA）。...

利用基于酶的生物传感器测量阿尔茨海默病小鼠模型中的紧张性和时相性谷氨酸

本方案描述了一种通过脑组织捐献项目及对脑组织进行适当表征来追踪个体脑衰老轨迹的方法。脑捐献者参与了一项长期纵向研究，包括系列多维度评估。本方案包含脑组织处理的详细描述以及准确的诊断方法学。...

Abbiategrasso脑库衰老大脑采集、处理与表征操作规程

我们提供了一种从成年小鼠大脑半球不同解剖区域分离小胶质细胞的方案，随后进行半自动化的文库制备，以实现全长转录组的深度单细胞RNA测序。该方法将有助于阐明小胶质细胞在健康与疾病状态下的功能异质性。...

从单个成年小鼠脑半球分离区域特异性小胶质细胞用于深度单细胞RNA测序

我们提出了一种利用三维染色质相互作用来鉴定全基因组关联研究（GWAS）所识别的非编码变异功能意义的实验方案。...

利用染色质构象的计算分析将阿尔茨海默病相关变异映射至其靶基因

DeepOmicsAE：利用蛋白质组学、代谢组学和临床数据的深度学习分析揭示阿尔茨海默病中的信号模块

本文描述了一种重建人源γ-分泌酶的酵母系统。该系统可用于鉴定和研究影响酶活性的突变，并可用于筛选γ-分泌酶抑制剂（GSIs）。利用家族性阿尔茨海默病突变体的功能丧失特性，还可用于筛选γ-分泌酶调节剂（GSMs）。...

Saccharomyces cerevisiae 阿尔茨海默病模型用于筛选影响 γ-分泌酶介导的淀粉样蛋白 β 生成的基因、突变及化学物质

了解如何利用生物信息学方法分析GEO数据库中的单核转录组数据，以识别阿尔茨海默病神经胶质细胞中的性别特异性差异表达基因和潜在治疗靶点。

基于胶质细胞转录组谱的阿尔茨海默病性别特异性生物标志物鉴定

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