Name: 光学光热红外荧光原位杂交 （OPTIR-FISH） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 7 s
Description: 学习使用光学光热红外荧光原位杂交技术进行单细胞代谢分析。该方法结合振动成像与荧光原位杂交，可在识别细胞身份的同时分析其代谢活动，为神经科学和细胞生物学研究提供重要工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由美国国立卫生研究院资助，项目编号为R35GM136223、R01AI141439，授予J.X.C.。

本研究中细菌样本的使用遵循波士顿大学机构审查委员会（IRB）和美国国立卫生研究院的指导方针。
注意：本方案所遵循的一般工作流程详见图2。
1. 细菌培养与同位素标记（图 2A）
注意：此处给出的示例适用于标记纯细菌培养物。若将本方案应用于多微生物群落，必须根据具体群落及目标生物体的生理特性调整培养基和标记时间。
<ol>
	<li>从单个菌落接种目标菌株，并在营养丰富的培养基（如胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）或Luria-Bertani肉汤（LB））中预培养3小时，使其进入对数生长期（log期）。本方案以大肠杆菌（E. coli）BW25113为例。 
	注意：不同菌株达到对数生长期所需时间各异，应根据具体菌株调整培养时间。</li>
	<li>测定600 nm处的光密度以估算细菌浓度。</li>
	<li>准备添加同位素标记底物的最低培养基。对于E. coli BW25113，可在M9最低培养基中添加终浓度为0.2%（w/v）的13C-葡萄糖。 
	注意：13C-葡萄糖（D-葡萄糖 U−13C6，99%）为全标记形式，即所有碳原子均被13C取代。最低培养基的选择取决于细菌菌株，同位素底物的选择则取决于所研究的特定代谢过程。总体目标是使同位素标记底物成为主要营养来源，相对于未标记底物占主导地位。</li>
	<li>将细菌稀释至含同位素标记底物的最低培养基中，终浓度为5 × 105 CFU/mL。 
	注意：通常采用高稀释比例（如1:100），使来自富集培养基的未标记营养成分可忽略不计。或者，为确保完全去除富集培养基，可通过在4 °C下以14,000 × g离心10分钟，用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次，重悬于PBS中，再进行第二次离心，最后重悬于最低培养基中。</li>
	<li>在摇床培养箱中，于最佳生长条件下培养细菌样品。一般设置摇床转速为220 rpm，温度为37 °C，并将培养管倾斜放置、瓶盖松开，以进行有氧培养。对于E. coli，通常在37 °C有氧培养24小时即可实现13C的充分标记。 
	注意：培养时间取决于所研究的代谢过程。较长的培养时间通常可提高同位素标记程度。在相同条件下使用未标记底物测定生长曲线，有助于确定合适的取样时间点。</li>
	<li>在目标时间点，于4 °C下以14,000 × g离心10分钟收集细菌细胞。</li>
	<li>弃去上清液，加入等体积含4%多聚甲醛（PFA）的PBS重悬细胞。在室温（RT）下固定10分钟，或在4 °C下固定2小时。如需长期保存，用PBS洗涤细胞两次，将细胞重悬于1 mL含50%（v/v）PBS和96%乙醇的混合液中，于-20 °C保存备用。</li>
</ol>
2. 荧光原位杂交（FISH）（图2B）
<ol>
	<li>杂交 E. coli 带有 Gam42a 的细胞10 用Cy5荧光染料标记的寡核苷酸探针（Gam42a-Cy5）以及 B. theta Bac303 细胞11 使用标准FISH方案，以氰基3（Cy3）荧光染料标记的寡核苷酸探针（Bac303-Cy3）进行检测。 
	注意：rRNA-FISH 鉴定的基本原理：rRNA 分子是荧光原位杂交（FISH）的理想靶标，因其在微生物细胞中广泛分布且天然丰度较高。rRNA 序列同时包含保守区和可变区，因此可通过寡核苷酸探针序列的保守程度确定目标类群的系统发育深度。通过设计的探针与靶序列特异性结合，标记的荧光染料可显示单个细胞的荧光信号。</li>
	<li>参考先前已发表的文献12,13,14 荧光实验的详细方案 原位 杂交。以下步骤简要描述了微生物细胞的标准操作流程。
	<ol>
		<li>脱水：
		<ol>
			<li>将固定的细胞（100 µL）在14,000 x g下离心 g 离心10分钟以沉淀，重悬于100 µL 96%分析纯乙醇中，并在室温下孵育1分钟。</li>
			<li>随后，再次以 14,000 x g 5分钟后，去除乙醇，将细胞沉淀在空气中晾干。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>杂交：将细胞在溶液（100 µL）中于46 °C杂交3小时。 
		注意：杂交缓冲液包含 900 mM NaCl、20 mM Tris-(羟甲基)-氨基甲烷 HCl、1 mM 乙二胺四乙酸、0.01% 十二烷基硫酸钠、100 ng 相应的荧光标记寡核苷酸，以及为达到严格杂交条件所需的甲酰胺浓度。</li>
		<li>离心：杂交完成后立即把样品转移至预热至46 °C的离心机转子中，在14,000 x g 在最高允许温度（通常为 40 °C）下孵育 15 分钟。</li>
		<li>洗涤与保存：
		<ol>
			<li>在适宜严谨性的缓冲液中于 48 °C 洗涤样品 15 分钟。随后，在 14,000 x g 在转子预热至46 °C的离心机中，于最高允许温度下离心15分钟。</li>
			<li>最后，用500 µL预冷的PBS洗涤细胞，将细胞重悬于20 µL 1×PBS中，于4 °C保存备用。 
			注意：探针的特异性结合由适当的杂交严谨性来保证。高严谨性可通过提高杂交温度、降低盐浓度或添加变性剂甲酰胺来实现。甲酰胺会干扰稳定核酸双链的氢键。本实验中，在杂交过程中保持温度和盐浓度不变，仅调节甲酰胺浓度。针对新设计的探针，其最佳甲酰胺浓度需通过甲酰胺解离曲线实验确定。10所需探针的甲酰胺浓度可在 probeBase 中找到15 或通过文献检索。或者，可从预测的甲酰胺浓度获得 在-计算机模拟 使用数学FISH进行分析16在洗涤步骤中，稍高的温度会带来稍强的严苛条件，从而提高结合的特异性。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 样品制备（图2C）
<ol>
	<li>载玻片清洗与包被：
	<ol>
		<li>使用标准化的氟化钙（CaF2）载玻片（直径10 mm，厚度350 µm，以适配仪器样品台）。将CaF2载玻片浸入70%乙醇中15分钟，随后用去离子水冲洗两次。</li>
		<li>将清洗后的载玻片转移至0.1%多聚-L-赖氨酸溶液中，4 °C下孵育过夜。用去离子水冲洗一次后，空气中自然干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在避光条件下室温解冻已制备的细胞样品。</li>
	<li>为避免PBS在样品干燥过程中产生过多盐结晶，请执行步骤3.3.1–3.3.2。
	<ol>
		<li>用去离子水（DI）洗涤细胞两次。在14,000 × g下离心10分钟，弃去上清液。</li>
		<li>重新加入原始体积的去离子水，轻轻涡旋混匀。重复离心操作，并再次加入去离子水洗涤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>（可选）对于混合样品，从每个样品中取等体积溶液转移至同一离心管中并混合均匀。</li>
	<li>在14,000 × g下离心10分钟，浓缩细菌细胞样品，弃去上清液。</li>
	<li>轻轻涡旋残留溶液约30秒，取1–2 µL溶液滴加至已制备的CaF2载玻片上。避光条件下空气中干燥30分钟。 
	注意：干燥后载玻片上应出现一个微小的圆形斑点。由于&#34;咖啡环&#34;效应，斑点边缘处的细菌细胞密度较高。此离心步骤旨在获得适合高效单细胞细菌成像的适当密度。理想浓度应在显微镜下呈现均匀且密集的单个细菌细胞层。若离心后肉眼可见明显沉淀，则弃去上清液，使涡旋后的溶液几乎透明。可通过对照样品进行快速测试以估算需去除的上清液体积。可在显微镜玻片上点样一系列含有不同残留上清液体积的液滴，在明场显微镜下观察以确定最佳稀释体积。若离心后无可见沉淀，则尽量去除大部分上清液，以最大程度浓缩样品。技巧在于将离心管的铰链侧朝外放置于固定角度转子中，使沉淀始终位于管壁同一侧。此外，在去除上清液时应逐步换用更小规格的移液器（P1000、P200、P10），以提高精度并保持沉淀完整。</li>
	<li>将载玻片安装至配套样品台中，并使用少量聚酯胶带固定载玻片，防止测量过程中移动。</li>
</ol>
4. OPTIR-FISH 成像
注意：荧光成像和OPTIR成像将在OPTIR系统上进行。
<ol>
	<li>系统几何结构：
	<ol>
		<li>使用中红外泵浦光与可见光探测光的反向传播，以及可见光的背向（同侧）检测方案。</li>
		<li>使用干式物镜（50倍，0.8数值孔径）来聚焦可见光，并收集背向反射和散射的可见光；使用卡塞格林物镜（40倍，0.78数值孔径）来聚焦中红外光。</li>
		<li>确保系统还配备具有多个荧光滤光片组的宽场落射荧光模块。针对本方案中使用的荧光染料，选择绿色荧光蛋白（GFP）滤光片组用于Cy3检测，Alexa Fluor 647滤光片组用于Cy5检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备测量：
	<ol>
		<li>启动系统并打开仪器控制软件。初始化完成后，切换 对流 和 荧光 将滑块拨至开启位置。</li>
		<li>将物镜设置为50倍，然后执行 自动背景扣除 获取红外功率谱。使用该功率谱对采集的样品光谱进行归一化处理，或对不同波数下的OPTIR图像进行归一化。这将消除中红外激光功率差异对数据分析和定量结果的影响。 
		注意：获取用于归一化的红外功率光谱对于后续定量分析至关重要，因为测得的信号强度与红外功率呈线性关系。在执行 自动背景扣除软件将自动为用户对OPTIR光谱和OPTIR图像进行归一化处理，以校正红外光源功率谱。用N₂吹扫系统2 可减少水蒸气的干扰，并提高实验间的可重复性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为了上样，使用 卸载 按钮以移出样品台。使用低倍物镜（如10倍）定位样品区域，并导航至样品密度最佳的区域。通过控制软件调节物镜高度，对样品进行聚焦。将物镜切换至50倍。</li>
	<li>图像采集 
	注意：所使用的样品为：i） E. coli (13C-葡萄糖孵育）；ii） 大肠杆菌 (12C-葡萄糖孵育）；iii） B. theta (12C-葡萄糖孵育）；iv）混合物 大肠杆菌 (13C-葡萄糖孵育）和 B. theta (12C-葡萄糖孵育）
	<ol>
		<li>明场图像（图 2D：通过观察明场图像将样品调至焦点。</li>
		<li>荧光图像（图2E）：通过点击滤镜名称按钮来更换滤镜组（GFP Cy3 和 Alexa Fluor 647 使用软件中的荧光模块依次检测与设计的FISH探针相关的荧光染料（Cy5），并获取荧光图像。在荧光染料发生漂白前，调整光照强度和曝光时间以获得足够的信号对比度。 
		注意：由于OPTIR测量中使用的探针可能导致荧光染料发生光漂白，因此务必在获取OPTIR图像之前先采集荧光图像。关于荧光标记物对OPTIR检测可能产生影响的问题，可参考先前已发表的研究，该研究证明使用Cy5荧光染料进行荧光原位杂交（FISH）不会影响后续基于OPTIR图像的定量分析，原因是与目标细菌蛋白相比，Cy5分子尺寸小且丰度低。9.</li>
		<li>OPTIR 图像（图2F):
		<ol>
			<li>确定正常峰值及同位素诱导的红移峰值位置。在蛋白质合成过程中 13C-葡萄糖中，正常的酰胺I峰出现在约1656 cm-1处，而红移峰出现在约1612 cm-1处-1 (图3A). 
			注意：正常峰的位置取决于所关注的生化组分和/或代谢产物。发生位移的峰位置还取决于用于标记的同位素种类。这两个波数也可通过测量未标记和完全标记细胞的完整光谱（见步骤4.5）进行实验确定。</li>
			<li>将红外泵浦波长调节至1656 cm⁻¹-1 使用软件调节探针功率和探测器增益，以避免直流信号（8 V）饱和。微调底部卡塞格林物镜的高度，以最大化交流信号。 
			注意：样品处的典型红外（IR）功率约为 5 mW，探测光在样品处的功率约为 3–15 mW，具体数值取决于样品。可通过控制软件调节红外光和探测光的功率，以优化功率水平，在确保高图像对比度的同时避免损伤细胞。</li>
			<li>将OPTIR图像设置为包含200 × 200像素，扫描速率为100 µm/s。在X和Y方向上将步长设为150 nm，使图像尺寸约为30 × 30 μm2.</li>
			<li>获取图像。</li>
			<li>将红外泵浦波长调节至1612 cm⁻¹-1 并在该波数下从相同的视野中获取图像。</li>
			<li>每个样本至少拍摄三个视野用于统计分析。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>（可选）光谱测量：图像采集后，若发现感兴趣的空间特征，可进行光谱测量。
	<ol>
		<li>选择位置：在软件的光谱模块中，选择单个点或指定一组点进行分析。</li>
		<li>设置光谱扫描参数。根据需求选择波数覆盖范围、扫描速度和数据输出间隔。 
		注意：如果扫描速度和数据输出间距与背景采集步骤（步骤 4.2）中使用的参数不同，则需要根据当前光谱扫描参数重新获取新的背景，以实现正确的归一化。</li>
		<li>设置累加平均次数并开始光谱测量。增加累加平均次数可提高光谱的信噪比，但需要更长的采集时间。 
		注意：若在共平均过程中观察到显著波动，可能表明由激光加热引起的样品不稳定。通常可通过降低红外激发功率和/或降低可见光探测功率来缓解。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 单细胞水平的数据处理与分析
<ol>
	<li>量化同位素底物的代谢合成（图2G） 
	注意：以下对同位素底物代谢掺入的量化基于对应目标大分子正常峰与位移峰的双波数OPTIR图像。与完整的高光谱数据堆栈相比，双波数成像可显著减少每个视野所需时间，提高通量，同时完整保留对代谢量化至关重要的同位素效应。
	<ol>
		<li>将位移峰OPTIR图像从正常峰OPTIR图像中减去，可生成来自同位素底物的合成活性可视化图谱。以示例说明（图3C），对于在13C-葡萄糖中培养的E. coli，(1656 cm-1 - 1612 cm-1) 图像中的正像素表示13C被有效掺入蛋白质，因此表明蛋白质合成水平较高。 
		注意：减法运算可通过ImageJ图像计算器功能完成。或者，也可使用任意偏好的编程语言轻松实现批量处理。</li>
		<li>单细胞代谢活性的量化
		<ol>
			<li>从无标记和完全标记的参考样品中获取系数（以图2G中的h表示）。由于同位素诱导的红移峰会与正常峰部分重叠，无标记和标记（由同位素标记底物新合成）样品均会对正常峰和位移峰处的OPTIR信号产生贡献。利用无标记和完全标记参考样品在正常峰和位移峰处归一化的OPTIR信号强度，量化这些不同来源的贡献。 
			注意：对于参考样品，无标记参考样品在不含任何同位素标记底物的条件下培养（或孵育）。完全标记参考样品通常使用最高浓度的同位素标记底物并以最长培养时间进行培养。</li>
			<li>对于单细胞分析，基于明场图像获取单细胞掩膜。 
			注意：此处可应用多种图像处理技术生成该掩膜，包括不同类型的颗粒检测（如斑点分析）和细胞分割方法（如分水岭法）。</li>
			<li>测量来自各个细胞的OPTIR信号强度。将获得的单细胞掩膜应用于两幅OPTIR图像（正常峰和位移峰），对每个单细胞，计算其单细胞掩膜区域内像素值的平均值。该平均值将用于后续量化分析。</li>
			<li>对每个细胞，基于步骤5.1.2.1获得的系数和步骤5.1.2.3获得的信号，计算无标记和标记生物组分的相对贡献。 
			注意：定义同位素替代比为标记生物组分的相对贡献占标记与无标记生物组分总和的比例（图2G）。该比值应在0至1范围内。同位素替代比与13C-葡萄糖和12C-葡萄糖的比例呈线性正比关系（在总葡萄糖量固定的情况下）9。已有研究证明对E. coli细胞可实现5% 13C-葡萄糖的高检测灵敏度。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从多通道荧光图像中鉴定细菌种类（图2H）
	<ol>
		<li>合并多色荧光通道，使用ImageJ创建用于区分不同细菌种类的可视化图像（图像 &#62; 颜色 &#62; 合并通道）。</li>
		<li>对于单细胞分析，针对每个荧光通道，为各个细胞生成一组感兴趣区域（ROIs）。 
		注意：此处可应用多种图像处理技术生成掩膜，包括不同的自动阈值方法和细胞分割方法。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>关联FISH鉴定结果与OPTIR代谢活性（图2I）
	<ol>
		<li>通过关联感兴趣区域（ROIs）的位置，将FISH荧光图像中获得的单细胞水平细菌身份信息直接与OPTIR图像中的代谢活性进行关联。</li>
		<li>进行统计分析以比较不同物种的代谢活性。 
		注意：掩膜分别由荧光图像和OPTIR图像独立生成，因为所有细胞的代谢活性均可通过OPTIR图像进行分析，而未知细胞在任何荧光通道中均不会显现。这确保了所有细胞均可被纳入代谢分析。若存在大量未识别细胞，则可能需要考虑使用针对不同目标分类群rRNA的不同FISH探针。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Comprehensive Protocol for Cell Identification and Metabolic Analysis Using OPTIR-FISH

<ol><li>Evers, T. M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+metabolic+heterogeneity+by+single-cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Deciphering metabolic heterogeneity by single-cell analysis.</a> Anal Chem. 91 (21), 13314-13323 (2019).</li>
<li>Overmann, J., Abt, B., Sikorski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Present+and+future+of+culturing+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Present and future of culturing bacteria.</a> Annu Rev Microbiol. 71, 711-730 (2017).</li>
<li>Epstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phenomenon+of+microbial+uncultivability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The phenomenon of microbial uncultivability.</a> Curr Opin Microbiol. 16 (5), 636-642 (2013).</li>
<li>Su, C., Lei, L., Duan, Y., Zhang, K. -Q., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture-independent+methods+for+studying+environmental+microorganisms%3A+methods%2C+application%2C+and+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Culture-independent methods for studying environmental microorganisms: methods, application, and perspective.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 93 (3), 993-1003 (2012).</li>
<li>Musat, N., Foster, R., Vagner, T., Adam, B., Kuypers, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+metabolic+activities+in+single+cells%2C+with+emphasis+on+nanoSIMS%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Detecting metabolic activities in single cells, with emphasis on nanoSIMS.</a> FEMS Microbiol Rev. 36 (2), 486-511 (2012).</li>
<li>Jiang, H., Kilburn, M. R., Decelle, J., Musat, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoSIMS+chemical+imaging+combined+with+correlative+microscopy+for+biological+sample+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">NanoSIMS chemical imaging combined with correlative microscopy for biological sample analysis.</a> Curr Opin Biotechnol. 41, 130-135 (2016).</li>
<li>Porta Siegel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+and+integration+with+other+imaging+modalities+for+greater+molecular+understanding+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging and integration with other imaging modalities for greater molecular understanding of biological tissues.</a> Mol Imaging Biol. 20 (6), 888-901 (2018).</li>
<li>Lagunov, O., Drenchev, N., Chakarova, K., Panayotov, D., Hadjiivanov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotopic+labelling+in+vibrational+spectroscopy%3A+a+technique+to+decipher+the+structure+of+surface+species%5BTitle%5D)+AND+%22Top+Catal%22%5BJournal%5D)">Isotopic labelling in vibrational spectroscopy: a technique to decipher the structure of surface species.</a> Top Catal. 60, 1486-1495 (2017).</li>
<li>Bai, Y., Guo, Z., Pereira, F. C., Wagner, M., Cheng, J. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mid-infrared+photothermal-fluorescence+in+situ+hybridization+for+functional+analysis+and+genetic+identification+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mid-infrared photothermal-fluorescence in situ hybridization for functional analysis and genetic identification of single cells.</a> Anal Chem. 95 (4), 2398-2405 (2023).</li>
<li>Manz, W., Amann, R., Ludwig, W., Wagner, M., Schleifer, K. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+oligodeoxynucleotide+probes+for+the+major+subclasses+of+proteobacteria%3A+problems+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22System+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic oligodeoxynucleotide probes for the major subclasses of proteobacteria: problems and solutions.</a> System Appl Microbiol. 15 (4), 593-600 (1992).</li>
<li>Manz, W., Amann, R., Ludwig, W., Vancanneyt, M., Schleifer, K. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+suite+of+16S+rRNA-specific+oligonucleotide+probes+designed+to+investigate+bacteria+of+the+phylum+cytophaga-flavobacter-bacteroides+in+the+natural+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Application of a suite of 16S rRNA-specific oligonucleotide probes designed to investigate bacteria of the phylum cytophaga-flavobacter-bacteroides in the natural environment.</a> Microbiology. 142, 1097-1106 (1996).</li>
<li>Daims, H., Stoecker, K., Wagner, M. Fluorescence In Situ Hybridization for the Detection of Prokaryotes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDaims%2C+H+%22Molecular+Microbial+Ecology%22">Molecular Microbial Ecology</a>. , Taylor & Francis. London. (2004).</li>
<li>Bridger, J. M., Volpi, E. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBridger%2C+JM+%22Fluorescence+In+Situ+Hybridization+%28FISH%29%3A+Protocols+and+Applications%22">Fluorescence In Situ Hybridization (FISH): Protocols and Applications</a>. , Springer, Humana. Totowa, NJ. (2010).</li>
<li>Wang, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quick+and+simple+FISH+protocol+with+hybridization-sensitive+fluorescent+linear+oligodeoxynucleotide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A quick and simple FISH protocol with hybridization-sensitive fluorescent linear oligodeoxynucleotide probes.</a> RNA. 18 (1), 166-175 (2012).</li>
<li>Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((probeBase-an+online+resource+for+rRNA-targeted+oligonucleotide+probes+and+primers%3A+new+features+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">probeBase-an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016.</a> Nucleic Acids Res. 44, D586-D589 (2016).</li>
<li>Yilmaz, L. S., Parnerkar, S., Noguera, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mathFISH%2C+a+web+tool+that+uses+thermodynamics-based+mathematical+models+for+in+silico+evaluation+of+oligonucleotide+probes+for+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">mathFISH, a web tool that uses thermodynamics-based mathematical models for in silico evaluation of oligonucleotide probes for fluorescence in situ hybridization.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (3), 1118-1122 (2011).</li>
<li>Lima, C., Muhamadali, H., Xu, Y., Kansiz, M., Goodacre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+isotopically+labeled+bacteria+at+the+single-cell+level+using+high-resolution+optical+infrared+photothermal+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Imaging isotopically labeled bacteria at the single-cell level using high-resolution optical infrared photothermal spectroscopy.</a> Anal Chem. 93 (6), 3082-3088 (2021).</li>
<li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanosecond-resolution+photothermal+dynamic+imaging+via+MHZ+digitization+and+match+filtering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Nanosecond-resolution photothermal dynamic imaging via MHZ digitization and match filtering.</a> Nat Commun. 12 (1), 7097(2021).</li>
<li>Bai, Y., Yin, J., Cheng, J. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bond-selective+imaging+by+optically+sensing+the+mid-infrared+photothermal+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Bond-selective imaging by optically sensing the mid-infrared photothermal effect.</a> Sci Adv. 7 (20), (2021).</li>
<li>Xia, Q., Yin, J., Guo, Z., Cheng, J. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mid-infrared+photothermal+microscopy%3A+principle%2C+instrumentation%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chemi+B%22%5BJournal%5D)">Mid-infrared photothermal microscopy: principle, instrumentation, and applications.</a> J Phys Chemi B. 126 (43), 8597-8613 (2022).</li>
<li>Du, J., Wang, H., Wei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+vibrational+imaging+to+chemical+biology+with+molecular+probes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Bringing vibrational imaging to chemical biology with molecular probes.</a> ACS Chem Biol. 17 (7), 1621-1637 (2022).</li>
<li>Miao, Y., Shi, L., Hu, F., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probe+design+for+super-multiplexed+vibrational+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Biol%22%5BJournal%5D)">Probe design for super-multiplexed vibrational imaging.</a> Phys Biol. 16 (4), 041003(2019).</li>
<li>Shi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mid-infrared+metabolic+imaging+with+vibrational+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Mid-infrared metabolic imaging with vibrational probes.</a> Nat Methods. 17 (8), 844-851 (2020).</li>
<li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mapping+of+lipid+metabolites+using+an+infrared+probe+in+human-derived+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Single-cell mapping of lipid metabolites using an infrared probe in human-derived model systems.</a> Nat Commun. 15 (1), 350(2024).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+tracing+of+deuterium+for+imaging+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism.</a> Nat Biomed Eng. 3 (5), 402-413 (2019).</li>
<li>Ge, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRS-FISH%3A+A+high-throughput+platform+linking+microbiome+metabolism+to+identity+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SRS-FISH: A high-throughput platform linking microbiome metabolism to identity at the single-cell level.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (26), e2203519119(2022).</li>
<li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+chemical+imaging+by+widefield+photothermal+sensing+of+infrared+absorption%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Ultrafast chemical imaging by widefield photothermal sensing of infrared absorption.</a> Sci Adv. 5 (7), 7127(2019).</li>
<li>Zhang, J., Zhao, J., Lin, H., Tan, Y., Cheng, J. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+chemical+imaging+by+dense-net+learning+of+femtosecond+stimulated+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">High-speed chemical imaging by dense-net learning of femtosecond stimulated Raman scattering.</a> J Phys Chem Lett. 11 (20), 8573-8578 (2020).</li>
<li>Lin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsecond+fingerprint+stimulated+Raman+spectroscopic+imaging+by+ultrafast+tuning+and+spatial-spectral+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Microsecond fingerprint stimulated Raman spectroscopic imaging by ultrafast tuning and spatial-spectral learning.</a> Nat Commun. 12 (1), 3052(2021).</li>
<li>Fu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+of+non-fluorescent+molecules+by+photothermal+relaxation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Photon%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging of non-fluorescent molecules by photothermal relaxation localization microscopy.</a> Nat Photon. 17, 330-337 (2023).</li>
<li>Tamamitsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mid-infrared+widefield+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%22%5BJournal%5D)">Mid-infrared widefield nanoscopy.</a> arXiv. , (2023).</li>
</ol>

Y.B. 是 Photothermal Spectroscopy Corp. 的兼职顾问。

本文介绍了一种应用OPTIR-FISH平台在单细胞水平上同时鉴定微生物种类并定量其代谢活性的详细实验方案。关键步骤包括使用稳定同位素标记培养以研究特定的代谢活动，以及通过荧光原位杂交技术鉴定目标微生物种类。可在同一台显微镜上依次进行多通道荧光成像和在选定波数下的OPTIR成像。我们展示了如何对这些图像进行定量分析，以揭示复杂群落中不同物种的代谢活性水平。该方案特别适用于在天然环境中研究复杂群落内多种物种的代谢活动。
此处以细菌为例，但该方案也可适用于其他生物体，如真菌和哺乳动物细胞。一个关键点是在不含正常对应物的培养基中添加目标代谢过程的振动探针。例如，若研究来自脂肪酸的脂质代谢，应将叠氮标记的脂肪酸添加到由去脂胎牛血清（FBS）组成的常规培养基中，因为脂肪酸原本来源于FBS。此外，孵育时间还需与不同真菌或哺乳动物细胞的生长速率相匹配。这既能保证细胞的正常生长，又能最大限度地提高振动探针对目标大分子的标记效率。
本文所述方案还可用于研究除葡萄糖合成蛋白质以外的其他代谢过程。所有主要的生物大分子，包括蛋白质、脂质、核酸和碳水化合物，均可通过OPTIR成像19,20。此外，存在多种标记策略可供选择，包括同位素标记（如13C、15N、18O和2H）以及在小分子上添加振动标签（如C≡C和C≡N）21。由于标记物尺寸小且具有高生物相容性，该方法在代谢研究中相较于荧光类似物更具优势。若需使用不同的振动探针研究其他代谢过程，可对本方案进行修改，包括细胞培养和代谢标记步骤，以及根据不同的探针和代谢产物选择相应的波数，相关参数可参考对应文献21,22,23。部分应用实例包括：利用叠氮棕榈酸在人源二维（2D）和三维（3D）培养系统中绘制新合成脂质的分布图24，在巨噬细胞中利用叠氮高丙氨酸成像新合成蛋白质23，使用氘代葡萄糖在PC3细胞中成像葡萄糖代谢25，以及分析重水来源的氘掺入情况，作为人体肠道微生物组活性的标志物26。
该实验方案的一个潜在局限性在于复杂群落中13C的检测限。我们已证明，对于本研究中使用的纯培养物，13C在总碳中的检测限为5%9。我们还证实，尽管不同未标记肠道微生物物种的细胞化学组成可能导致光谱差异，但通过将完全13C标记的E. coli细胞与未标记的人类复杂肠道微生物组样本混合，仍可基于代谢谱可靠地区分E. coli9。然而，复杂的微生物群落受其所含微生物物种独特生理特性的影响，可能表现出不一致的13C同化速率。在此类情况下，值得进一步测试OPTIR-FISH技术在复杂群落背景下对13C标记与12C标记细胞进行代谢区分的能力。该平台的性能仍有进一步提升空间。例如，结合宽场OPTIR装置，可显著提高成像速度27。基于机器学习的先进去噪方法也可整合到该平台中，以进一步提升成像速度28,29。为了更清晰地可视化微生物细胞内代谢物的精细分布，可采用近年来发展的超分辨率成像技术30,31。
该实验方案的关键步骤包括优化目标微生物FISH标记的效率，可通过合理设计寡核苷酸探针、优化甲酰胺浓度以及严格控制杂交环境来实现。为实现高通量分析，制备具有适当单细胞密度的样品在实践中至关重要。此外，优化系统以获得足够信号用于定量也十分关键，此步骤在仪器控制软件的自动背景校正过程中自动完成。如果样品制备过程中出现偏差，例如使用了非标准的载玻片（而非标准的CaF2载玻片），则可在软件中进行手动优化。在手动优化步骤中，通过扫描一系列中红外位置来优化中红外光与可见光之间的重叠。主要挑战包括选择最适合的振动基底及其对应的OPTIR波数，以定量感兴趣的代谢活性。
综上所述，本研究展示了如何通过OPTIR-FISH平台在单细胞水平上同时实现代谢活性检测与微生物鉴定。我们相信，这一详细的操作方案将为推广这一新型振动成像平台提供有益指导。该平台与广泛使用的荧光工具具有高度兼容性，可在生命科学和医学的多个领域中应用，并为新发现带来机遇。

细胞代谢是细胞生物学的基础支柱之一，调控着决定细胞健康、功能及其与环境相互作用的诸多过程。在单细胞水平上，尤其是在原生环境中分析代谢活动，可提供宝贵的见解，揭示生物系统中复杂且异质性的生物学行为。1这一点在微生物研究中尤为关键，因为许多微生物具有独特的生长需求或环境依赖性，这对传统的培养方法构成了挑战。2例如，某些物种可能需要特定的营养成分或共生关系，而这些条件在实验室环境中难以复制，因此无法通过标准技术进行培养。3此外，某些物种的培养需要较长时间，这为微生物学研究带来了重大挑战，往往超出了研究和分析的实际时间范围。为了克服这些限制，可采用聚合酶链式反应和荧光技术等替代方法 原位 杂交（FISH）技术能够在无需培养的情况下实现微生物物种的鉴定4，能够实现对微生物生态系统的更精确和更全面的观察。然而，这些分析技术缺乏阐明细胞代谢的能力。这一局限凸显了微生物学领域持续存在的挑战：即在单细胞水平上同时区分细胞身份并阐明其代谢活动。成像质谱技术（IMS）与稳定同位素联用等方法的进展，已成为进行单细胞代谢分析的有力工具。5在这些实验中，细胞与含有同位素的底物共同孵育，例如 13C 或 15新合成的生物分子携带这些同位素，从而在质荷比（m/z）谱图中可被区分。然而，质谱成像（IMS）存在仪器成本高、样品制备复杂、通量相对较低以及需要专业知识解析质荷比谱图等局限性。当与分子标记物特异性的荧光成像相结合时，在揭示细胞代谢方面已取得进展，并提高了特异性6然而，在整合这两种成像模式方面仍存在挑战。质谱成像与荧光成像在分辨率上的差异，以及操作设置的不同，使得两者的图像对齐与结果关联变得困难。7.
将振动光谱成像与稳定同位素标记相结合，为单细胞代谢研究提供了一种新颖的解决方案。较重同位素的掺入会减缓化学键的振动，从而导致振动光谱中出现红移峰8值得注意的是，振动成像的空间分辨率可与荧光成像相媲美，且代谢定量与细胞鉴定可在同一系统中完成，从而简化了图像配准与关联分析。我们近期的工作已展示了先进的振动成像平台——光学光热红外（OPTIR）与荧光成像的结合 原位 杂交（FISH）技术用于探究细菌群落中的葡萄糖代谢9 (图1OPTIR 是一种振动光谱显微系统，通过检测可见光的变化来利用中红外吸收的光热效应，从而提供与光学显微镜相当的亚微米级分辨率，同时获得源自中红外吸收的振动光谱信息。FISH 是一种常用于在单细胞水平上鉴定微生物种类的技术。可设计寡核苷酸序列以靶向不同分类群的特异性 16S 序列，并连接不同的荧光染料。设计的寡核苷酸探针与目标 rRNA 发生特异性杂交后，可在单个细胞内产生目标物种的强荧光信号，通过多通道荧光成像可实现对群体中多种物种的识别。由于 OPTIR 和荧光成像均基于光学检测，因此将 OPTIR 与 FISH 荧光技术结合易于实现。两种模式在单细胞分析中具有相同的光学分辨率，且可方便切换，无需额外校准或共定位。
本方案详细介绍了如何利用OPTIR-FISH平台进行高级单细胞结构-功能分析。我们以在含13C-葡萄糖培养基中培养的细菌样品为测试体系，定量分析了由13C-葡萄糖合成的de novo蛋白质。为了展示该平台的细胞识别能力，我们使用了细菌混合物，并针对各物种采用靶向rRNA的FISH探针进行标记。该方法可实现对特定细菌菌株（如Escherichia coli（E. coli）和Bacteroides thetaiotaomicron（B. theta））及其代谢活动的精确单细胞识别。本方案为研究人员提供了一种强大的工具，可在单细胞水平上同时进行代谢谱分析和物种鉴定，有望推动我们对细胞间相互作用、生理特性及其在复杂环境中所起作用的理解。

<table><tbody><tr><td>96% 乙醇</td><td>ThermoScientific</td><td>T032021000</td><td></td></tr><tr><td>氟化钙</td><td>Crystran</td><td>CAFP10-0.35</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖 (U-13C6, 99%)</td><td>Cambridge Isotopic Laboratories</td><td>CLM-1396-1</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>ThermoScientific</td><td>17899</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3522-250G</td><td></td></tr><tr><td>M9 最小盐溶液 5×</td><td>SIGMA</td><td>M6030-1KG</td><td></td></tr><tr><td>OPTIR 仪器</td><td>Photothermal Spectroscopy Corp.</td><td>mIRage LS</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛溶液（溶于 PBS）</td><td>ThermoScientific</td><td>J19943-K2</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸溶液 0.1% (w/v)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920-500ML</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-25G</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771-25G</td><td></td></tr><tr><td>三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，99+%</td><td>ThermoScientific</td><td>A11379.18</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆肉汤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22092-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

光学光热红外-荧光原位杂交（optir-fish）

Optical Photothermal Infrared-Fluorescence In Situ Hybridization (OPTIR-FISH)

理解复杂群落中单个细胞的代谢活动对于揭示其在人类疾病中的作用至关重要。本文介绍了一种综合实验方案，利用OPTIR-FISH平台结合rRNA标记的FISH探针与同位素标记底物，实现细胞鉴定与代谢分析的同步进行。荧光成像通过rRNA标记的FISH探针的特异性结合实现细胞鉴定，而OPTIR成像则通过同位素诱导的OPTIR光谱红移，提供单细胞水平的代谢活性信息。该方法适用于与同位素标记底物共同培养的细菌 13C-葡萄糖作为实验平台，本方案概述了微生物培养结合同位素标记与荧光检测的方法 原位 杂交（FISH）、样品制备、OPTIR-FISH成像系统的优化以及数据采集。我们还展示了如何以高通量方式在单细胞水平上进行图像分析并解读光谱数据。该方案具有标准化和详细的特点，将极大促进来自单细胞代谢研究领域不同背景和学科的研究人员对其进行采用。

通过OPTIR-FISH实现单细胞微生物代谢分析并结合遗传学鉴定的通用工作流程如图2所示。图3展示了体现OPTIR单细胞代谢成像能力的代表性结果。本示例使用了在12C-或13C-葡萄糖中孵育24小时的大肠杆菌（E. coli）细胞。13C掺入蛋白质已被证明会导致蛋白质酰胺I带和II带发生显著的红移现象（图3A）17,18。因此，选取了代表12C-蛋白质（1656 cm-1，正常酰胺I带）和13C-蛋白质（1612 cm-1，位移后的酰胺I带）的这两个关键波数，并采集了在这些波数下的OPTIR图像。同时展示了相应的明场图像以显示细胞形态（图3B、E）。杆状细菌在明场和OPTIR图像中均可在单细胞水平上被清晰分辨，证实了OPTIR技术具有高空间分辨率（图3B–G）。对于在12C-葡萄糖中孵育的细胞（图3B–D），在1656 cm-1处观察到更高的信号强度；而在13C-葡萄糖中孵育的细胞则在1612 cm-1处表现出更强的信号（图3E–G）。这种峰位移动表明较重的碳同位素已掺入蛋白质分子中17。进一步拓展评估了OPTIR-FISH在多物种样本中区分细菌分类群及其代谢活性的能力。我们人工混合了两种在人类肠道微生物组中常见的细菌：大肠杆菌（E. coli）和多形拟杆菌（B. thetaiotaomicron，简称B. theta）。将经13C-葡萄糖孵育的E. coli细胞与靶向Gammaproteobacteria 23S rRNA的Gam42a-Cy5探针进行杂交10；将经12C-葡萄糖孵育的B. theta细胞与靶向多数拟杆菌科（Bacteroidaceae）物种16S rRNA的Bac303-Cy3探针进行杂交11。由于两者均为杆状，仅凭明场图像很难区分这两种细菌（图4A）。因此，杂交探针的多色荧光成像是为每个被分析的细菌细胞分配分类学身份的关键（图4B）。通过将1612 cm-1处采集的OPTIR图像从1656 cm-1处的图像中减去后，我们注意到该双物种样本中部分细胞表现出正的差值信号（图4C），表明其掺入了13C同位素。根据培养条件，我们将差值为正的细胞归为E. coli，差值为负的细胞归为B. theta。这一分类结果由荧光成像结果得到验证：产生正差值信号的细胞呈现Cy5对比度，特异性对应于E. coli；而产生负差值信号的细胞则呈现B. theta-特异性的Cy3对比度。随后计算了同位素替换比率，在本例中即由13C-葡萄糖新合成的13C-蛋白质含量（图4D）。如预期所示，两种细菌之间的同位素替换比率存在显著差异（成对t检验，p = 9.74 × 10-33）。该数据集凸显了将OPTIR-FISH平台应用于研究复杂环境中多种共存样本代谢活动的可行性。
<img alt="微生物群落分析；荧光原位杂交；OPTIR成像；同位素标记。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66562/66562fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：OPTIR-FISH平台示意图，用于同时进行物种鉴定与代谢分析。 微生物群落中的不同成员可通过微生物核糖体RNA探针的特异性结合，利用荧光in situ杂交进行识别，并通过荧光成像检测所连接的荧光染料。代谢活性可通过同位素标记底物培养后，利用OPTIR成像进行分析。OPTIR成像可检测由红外吸收引起的散射变化，且OPTIR技术本身与广泛使用的荧光工具兼容。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66562/66562fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="同位素标记与FISH示意图；利用OPTIR进行微生物培养分析、光谱峰、替换率" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66562/66562fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2单细胞代谢活性分析结合OPTIR-FISH遗传鉴定的一般工作流程。 (A细菌细胞用同位素标记的底物进行培养。B荧光 原位 杂交（FISH）随后进行。C) 在红外透明载玻片上进行样品制备。D明场图像用于确定细胞密度最佳的区域。E,H多色荧光成像可检测不同FISH荧光染料的信号，揭示由FISH探针所确定的单个细胞的遗传身份，或显示其遗传身份未知。F,G随后在正常峰位和偏移峰位进行的多光谱OPTIR成像揭示了同位素掺入微生物生物量的情况。参考未标记和完全标记样品的OPTIR光谱（系数 h），规则（cr）和同位素（ci）生物组分得以定量。利用“同位素置换比”对来自代谢同位素标记底物的蛋白质合成进行了定量。I通过OPTIR-FISH，可对复杂群落中微生物物种的代谢活性进行高通量分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66562/66562fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用 ^12C/^13C-葡萄糖的 OPTIR 光谱法检测大肠杆菌示意图，显示酰胺 I/II 谱带位移" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66562/66562fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3代表性OPTIR光谱与成像结果。 (AOPTIR 光谱用于 E. coli 培养的细胞 12C-葡萄糖（青色）和 13C-葡萄糖（橙色）覆盖酰胺I和酰胺II区域。可见明显的红移酰胺I峰（1656 cm⁻¹）-1 至 1612 cm-1) 被观察到 13C-葡萄糖培养的细胞。代表性明场和OPTIR图像 E. coli 正常酰胺I带和偏移酰胺I带下的细胞B-D) 12C-葡萄糖和（E-G) 13C-葡萄糖培养条件。比例尺： 10 µm此图经 Bai 等人许可修改。9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66562/66562fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="明场、FISH、E. coli 和 B. theta 的 OPTIR；同位素定量图；显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66562/66562fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：来自细菌混合物的代表性图像及定量结果。E. coli 细胞用 13C-葡萄糖孵育，随后与寡核苷酸探针 Gam42a-Cy5 杂交。B. theta 细胞用 12C-葡萄糖孵育，随后与寡核苷酸探针 Bac303-Cy3 杂交。（A）明场图像显示细胞混合物的形态。（B）双色荧光图像显示 E. coli（红色）和 B. theta（绿色）的分布。（C）OPTIR 差值结果（1612 cm-1 - 1656 cm-1）显示细菌细胞的蛋白质代谢情况。（D）同位素替换比的定量结果，代表由 13C-葡萄糖新合成的 13C-蛋白质。（成对 t 检验：p = 9.74 × 10-33）。比例尺：10 µm。该图经 Bai 等人9 许可修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66562/66562fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

此处，我们介绍一种利用光学光热红外-荧光技术的实验方案 原位 杂交技术（OPTIR-FISH），也称为中红外光热-FISH（MIP-FISH），可用于鉴定单个细胞并研究其代谢活动。该方法具有广泛适用性，可用于多种应用，包括以单细胞分辨率绘制细胞代谢图谱。

光学光热红外-荧光原位杂交（OPTIR-FISH）

了解复杂群落中单个细胞的代谢活性，对于揭示其在人类疾病中的作用至关重要。这里，我们……

本研究的目标是开发并应用OPTIR-FISH技术，以在单细胞水平上识别单个细胞并分析其代谢活动。我们旨在理解单个细胞在复杂环境中如何相互作用，并阐明其生理特征与功能角色。在单细胞水平上，特别是在原位环境中分析代谢活动，可为揭示生物系统中异质性的复杂行为提供宝贵见解。然而，在单细胞水平上同时实现细胞身份鉴定和代谢解析这一任务仍然具有挑战性。我们先进的振动成像平台——光热红外成像技术，可实现对单细胞代谢的研究；同时，该技术与成熟的荧光原位杂交技术天然高度兼容，可用于微生物物种的鉴定。因此，直接整合可同时在相同的成像分辨率下实现代谢活动检测与物种鉴定。首先，取经甲醛固定的细菌细胞，以14,000 G离心10分钟，然后弃去上清液。将沉淀物重悬于100 µL 96%分析纯乙醇中，并在室温下孵育1分钟。以离心力离心五分钟。然后去除乙醇，并将细胞沉淀在空气中干燥。现在将细胞在含有荧光标记寡核苷酸的溶液中于46摄氏度下杂交三小时。杂交完成后，立即将样品在已预热至46摄氏度的离心机转子中，于最高允许温度下离心15分钟。随后在适当严格性的缓冲液中，于48摄氏度孵育15分钟以洗涤样品。再次离心样品后，用500微升预冷的PBS洗涤细胞。用20微升PBS重悬，于4摄氏度保存备用。首先，取标准化的氟化钙载玻片，浸入70%乙醇中15分钟，再用去离子水冲洗两次。将洁净的载玻片转移至0.1%多聚-L-赖氨酸溶液中，在4摄氏度下孵育过夜。随后用去离子水冲洗载玻片，并使其自然干燥。接着，在室温下避光解冻制备好的细胞样本。为避免样品干燥过程中 PBS 产生过多盐结晶，将解冻后的细胞用去离子水洗涤两次。在 14,000 G 离心 10 分钟后弃去上清液。向细胞中重新加入与原体积相等的去离子水，并轻轻涡旋混匀。洗涤后，以 14,000 G 离心 10 分钟，以浓缩细菌细胞样品并去除上清液。轻轻涡旋剩余溶液约 30 秒，取一到两微升该溶液滴加至制备好的氟化钙载片上。

optical-photothermal-infrared-fluorescence-situ-hybridization-optir

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

光学光热红外荧光原位杂交 （OPTIR-FISH）

整体原位杂交是发育生物学中最常用的技术之一。本文中，我们介绍一种高分辨率的双荧光原位杂交实验方案，用于分析单个基因的精确表达模式，并确定两个基因表达区域的重叠情况。我们同时包含碘化丙啶核复染步骤，以突出显示组织结构。...

斑马鱼全胚胎高分辨率双荧光标记 原位 杂交

本方案涉及一种非放射性方法 原位...

双荧光 原位 新鲜脑切片中的杂交反应

荧光法检测病毒RNA 原位 杂交（FISH）

此处我们描述一种整体荧光标记方法 原位 杂交（FISH）方案，用于确定果蝇胚胎发育期间表达的RNA的表达与定位特性， 黑腹果蝇.

完整组织 RNA 荧光 原位 杂交检测 Drosophila 胚胎

我们在此描述一种简单的荧光方法 原位 一种用于定位昆虫和植物组织中病毒与细菌的荧光原位杂交（FISH）方法。该方案可扩展用于整体标本及显微切片中 mRNA...

荧光原位杂交（FISH）用于植物和昆虫组织中病毒及内共生细菌的定位

所描述的RNA 原位 杂交方案可实现对完整组织中RNA的检测 果蝇...

高分辨率荧光 原位 杂交 果蝇 使用酪酰胺信号放大法的胚胎与组织检测

本文提供了一种详细的实验方法，用于制备X染色体臂探针，并通过荧光原位杂交（FISH）技术检测处于前中期和中期 I...

使用荧光原位杂交技术可视化果蝇卵母细胞中染色体臂的黏连缺陷 原位 利用荧光原位杂交（FISH）监测早前期I和中期I染色体臂黏连状态 果蝇 卵母细胞

基因编辑技术使研究人员能够相对容易地构建斑马鱼突变体，以研究基因功能。本文提供了一种在斑马鱼中并行进行胚胎基因分型和原位杂交信号定量分析的方法指南。这种无偏倚的方法可提高基于原位杂交的表型分析的准确性。...

斑马鱼原位杂交染色的基因分型与定量分析

扩增辅助迭代荧光原位杂交（EASI-FISH）是一种强大的技术，结合了扩增显微镜与荧光原位杂交（FISH），用于在厚组织中检测多个基因的表达。本方案概述了该方法的最新进展及其在完整Drosophila中枢神经系统标记中的应用。...

完整组织中基因表达的多重检测 果蝇 利用扩增辅助迭代荧光技术研究大脑 原位 杂交

光学分辨率光声显微成像（OR-PAM）是一种能够成像光学吸收对比度的新兴技术 体内 以细胞级分辨率和高灵敏度进行成像。本文提供了光声显微镜（OR-PAM）实验操作的可视化指南，包括系统配置、系统校准、典型实验流程 体内...

三维光学分辨率光声显微成像

学习使用光学光热红外荧光原位杂交技术进行单细胞代谢分析。该方法结合振动成像与荧光原位杂交，可在识别细胞身份的同时分析其代谢活动，为神经科学和细胞生物学研究提供重要工具。

光学光热红外-荧光原位杂交（OPTIR-FISH）

探索更多视频