光学光热红外-荧光原位杂交（OPTIR-FISH）
2024年2月23日
此处，我们介绍一种利用光学光热红外-荧光技术的实验方案 原位 杂交技术（OPTIR-FISH），也称为中红外光热-FISH（MIP-FISH），可用于鉴定单个细胞并研究其代谢活动。该方法具有广泛适用性，可用于多种应用，包括以单细胞分辨率绘制细胞代谢图谱。
本研究的目标是开发并应用OPTIR-FISH技术，以在单细胞水平上识别单个细胞并分析其代谢活动。我们旨在理解单个细胞在复杂环境中如何相互作用，并阐明其生理特征与功能角色。在单细胞水平上，特别是在原位环境中分析代谢活动，可为揭示生物系统中异质性的复杂行为提供宝贵见解。
然而，在单细胞水平上同时实现细胞身份鉴定和代谢解析这一任务仍然具有挑战性。我们先进的振动成像平台——光热红外成像技术，可实现对单细胞代谢的研究；同时，该技术与成熟的荧光原位杂交技术天然高度兼容，可用于微生物物种的鉴定。
因此，直接整合可同时在相同的成像分辨率下实现代谢活动检测与物种鉴定。首先，取经甲醛固定的细菌细胞，以14,000 G离心10分钟，然后弃去上清液。将沉淀物重悬于100 µL 96%分析纯乙醇中，并在室温下孵育1分钟。
以离心力离心五分钟。然后去除乙醇，并将细胞沉淀在空气中干燥。现在将细胞在含有荧光标记寡核苷酸的溶液中于46摄氏度下杂交三小时。
杂交完成后，立即将样品在已预热至46摄氏度的离心机转子中，于最高允许温度下离心15分钟。随后在适当严格性的缓冲液中，于48摄氏度孵育15分钟以洗涤样品。再次离心样品后，用500微升预冷的PBS洗涤细胞。
用20微升PBS重悬，于4摄氏度保存备用。首先，取标准化的氟化钙载玻片，浸入70%乙醇中15分钟，再用去离子水冲洗两次。
将洁净的载玻片转移至0.1%多聚-L-赖氨酸溶液中，在4摄氏度下孵育过夜。随后用去离子水冲洗载玻片，并使其自然干燥。接着，在室温下避光解冻制备好的细胞样本。
为避免样品干燥过程中 PBS 产生过多盐结晶，将解冻后的细胞用去离子水洗涤两次。在 14,000 G 离心 10 分钟后弃去上清液。向细胞中重新加入与原体积相等的去离子水，并轻轻涡旋混匀。
洗涤后，以 14,000 G 离心 10 分钟，以浓缩细菌细胞样品并去除上清液。轻轻涡旋剩余溶液约 30 秒，取一到两微升该溶液滴加至制备好的氟化钙载片上。
概述
本文介绍了一种利用光学光热红外-荧光原位杂交技术（OPTIR-FISH）来鉴定单个细胞并分析其单细胞水平代谢活动的实验方案。该方法旨在揭示复杂环境中细胞间的相互作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 代谢分析
背景
- 了解单个细胞的代谢对于揭示复杂的生物活动至关重要。
- 现有方法在分析代谢的同时难以区分细胞身份。
- OPTIR-FISH 将振动成像与荧光原位杂交相结合。
- 该方法适用于微生物物种的鉴定。
研究目的
- 建立一种用于鉴定单个细胞的方法。
- 在单细胞水平上分析代谢活动。
- 理解细胞在天然环境中的相互作用。
使用方法
- 光学光热红外成像。
- 荧光原位杂交。
- 单细胞分辨率技术。
- 细胞代谢分析。
主要结果
- 利用OPTIR-FISH成功鉴定单个细胞。
- 深入了解复杂环境中的细胞代谢。
- 已证实与现有鉴定方法具有兼容性。
- 在生物研究中具有广泛的应用潜力。
结论
- OPTIR-FISH 是研究单细胞代谢的一种有前景的工具。
- 它有助于加深对细胞相互作用和生理功能的理解。
- 该方法可能推动生物研究领域的重大进展。
常见问题
行业高管相关性
OPTIR-FISH 能够在复杂的微生物群落中同时实现单个细胞的鉴定和代谢谱分析，解决了生物制药发现领域单细胞分析的一个关键空白。这种双模态方法提高了对细胞异质性和代谢功能理解的预测可信度，支持早期靶点验证和机制层面的风险降低。在单细胞分辨率下将细胞身份与代谢活性相结合，有助于指导项目组合决策，并加速转化研究进程。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够在已鉴定的细胞类型中直接探究代谢通路，用于功能靶点的验证。
- 通过在单细胞水平上将表型与代谢活性关联，支持机制层面的风险评估。
- 通过解析疾病相关系统中的细胞异质性，提高靶点选择的可预测性信心。
筛选与检测方法开发
- 为下游化合物筛选和代谢检测制备经过验证的单细胞体系。
- 标准化定量代谢读数，以实现可重复的检测方法开发。
- 实现在实验干扰条件下对代谢变化的高通量分析。
转化与临床前研究
- 在复杂的微生物或细胞环境中，将代谢表型与转化生物标志物相对应。
- 通过原位追踪代谢响应，实现从发现到临床前验证的连续性研究。
- 通过阐明细胞亚群的功能相关性，支持基于风险评估的推进策略。
流程与工作流整合
OPTIR-FISH 融入从早期假设验证到先导物发现及临床前验证的整个发现流程，能够在研发工作流程中实现可靠的单细胞分析。
- 发现生物学： 将细胞身份与代谢功能关联，支持基于假设的通路分析。
- 筛选： 提供定量、可重复的代谢输出结果，适用于检测准备和化合物评估。
- 分析： 提供高内涵的光谱和荧光数据，用于不同条件间的比较分析。
- 转化研究： 在所研究系统支持下，将单细胞代谢谱与疾病相关生物标志物关联。
- 企业级复用： 提供标准化、可扩展的平台，可在多种生物模型中重复使用。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证中的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：标准化单细胞代谢分析，实现可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过早期明确细胞功能，优化“推进/终止”决策并提升资金使用效率。
- 项目组合影响：支持基于风险调整的发现项目优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备荧光原位杂交和振动成像技术方面的专业知识。
- 需要具备光学光热红外显微镜和荧光显微镜设备的使用权限。
- 需要跨团队对样品制备和数据分析流程进行标准化。
- 根据rRNA探针设计和同位素标记情况，可能需要针对不同的微生物或细胞系统进行方法调整。
- 成像通量和光谱分辨率受限于成像仪器性能和样品复杂性。
