小分子化合物的靶蛋白预测与验证

我们的研究聚焦于蛋白质靶点以及小分子化合物的预测与验证。本实验采用分子对接结合类似热迁移实验（TSA）的方法，用于预测和验证小分子与蛋白质靶点之间的相互作用。TSA实验步骤较为复杂，操作过程中任何步骤的误差都可能对结果产生重大影响。

本实验方案将预测与验证相结合，有效减少了时间和经济成本。此外，实验所需的仪器和材料易于获取。最后，待检测的TSA样品易于制备和测试，从而确保了样品的可重复性。

首先，下载去氢木香内酯（xanthatin）和KEAP1的晶体结构。处理结构后，进入“任务”（Tasks）并选择“配体对接”（Ligand Docking）选项。从文件中选择“受体网格来源”（Receptor Grid As），然后点击“浏览”（Browse）。

然后单击桌面。打开分子对接文件夹，双击 glide-grid 2FLU 文件。选择 glide-grid 2FLU。

zip 文件，然后单击“打开”。接着单击“使用来自文件的配体”，再单击“浏览”并选择桌面。

选择分子对接文件夹并打开 ligprep_1 文件。然后，选择 ligprep_1-out.maegz 文件，然后单击打开。

进入访问设置并选择精度为 XP 选项。将作业名称修改为 glide.XP_2FLU，然后点击运行。

要查看对接结果，请点击“文件”并选择“导入结构”选项。导航至桌面并打开分子对接文件夹，然后选择 glide-doc_XP_2FLU 文件。

选择 glide-doc_XP1_pv.maegz 文件，然后单击打开。接着在工作区中双击圆点以选择配体。

选择 sitemap_1_protein。点击表格并滑动至最右侧以查看对接得分。要可视化二维结果，请选择 sitemap_1_protein，操作方式如前所述。

单击配体相互作用。选择“视图”并勾选“LID图例”框，然后单击“文件”。

选择“保存截图”，宽度输入 6,000。取消勾选透明背景选项，然后点击“确定”。将文件保存到桌面，命名为 2D-xanthatin-2FLU。

分子对接分析预测了蛇床子素与KEAP1蛋白之间的相互作用。首先，将未处理的264.7细胞接种至100毫米培养皿中，加入6毫升DM-EM培养基，在37摄氏度、95%湿度和5%二氧化碳条件下培养。待细胞融合度达到80%时，吸除旧培养基。

随后用 2 毫升预热至室温的 PBS 洗涤细胞两次。接着，向每个含细胞的培养皿中加入 2 毫升 PBS 并混匀。将细胞收集至两个 1.5 毫升微量离心管中，于室温下以 377 × g 离心 3 分钟。

弃去上清液后，将细胞重悬于 2 毫升 PBS 中。将微量离心管置于液氮中冷冻至出现白色固体，立即在 37 摄氏度水浴中解冻。在 4 摄氏度条件下，以 12,000 G 离心 10 分钟。

接下来，取两支微量离心管，一支加入100微摩尔的黄杞醇，另一支加入等体积的二甲基亚砜。向每支离心管中加入450微升离心后的上清液，并在37摄氏度下孵育30分钟。然后从每支微量离心管中转移60微升上清液至14个PCR管中。

将试管在不同温度下同时加热三分钟，每个温度放置两支PCR管。然后将试管放入离心机中。接着从每支试管中吸取48微升上清液，加入新的1.5毫升微量离心管中。

向每个离心管中加入 12 微升 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液。将涡旋混匀后的样品置于 100 摄氏度的水浴中加热 5 分钟。首先，制备 SDS-PAGE 凝胶。

离心已解冻的蛋白标记物和制备好的细胞热迁移实验样品。取2.5 µL标记物加入第一孔，其余各孔每孔加入20 µL样品。随后以80伏电压电泳运行凝胶。

接下来，向烧杯中加入850毫升超纯水、100毫升无水乙醇和50毫升快速转移缓冲液，充分搅拌。根据凝胶的大小裁剪聚偏二氟乙烯（PVDF）膜并做好标记。然后将其浸入甲醇中30秒以活化。

将转膜夹、海绵垫和三层转膜滤纸放入盛有转膜缓冲液的托盘中。电泳完成后，倒出电泳装置中的电泳液，取出玻璃板。用塑料刀小心取出凝胶，并进行切割，以清晰观察蛋白 Marker 和目标蛋白。

在转膜液中洗涤凝胶后，将其平铺在滤纸上。将活化的PVDF膜浸入转移缓冲液中，用镊子夹住标记面，将膜覆盖在凝胶的背面。

然后将组装好的转膜装置放入转膜槽中。向转膜夹中加入剩余的转膜液。调节电流和时间，按下运行键以在室温下开始转膜。

现在向孵育盒中加入6毫升含5% BSA的TBST溶液。转膜完成后，夹住标记一侧将PVDF膜从装置中取出，并放入孵育盒中。从孵育盒中移除BSA溶液后，加入6毫升一抗溶液。

将孵育盒放入装有冰袋的泡沫盒中，4℃摇床孵育过夜。次日，收集一抗溶液至离心管中，用6毫升TBST溶液洗涤膜。随后，向孵育盒中加入6毫升二抗溶液。

孵育结束后，收集二抗，并用 TBST 按前述方法洗涤膜五次。等体积混合化学发光试剂 A 和 B。打开凝胶成像系统，点击“Samples”，检查校准状态，并等待校准完成。

然后点击标记物并检查校准情况。现在用镊子夹起试纸条的标记物一侧，完全浸入化学发光试剂溶液中。夹住标记物的一侧，将试纸条正面朝下放入成像仪中，并关闭成像仪的盖子。

将曝光时间设置为1秒，然后点击“Capture”（采集）。点击“Save”（保存）。为图像命名，并将其保存为TIFF文件。

细胞热迁移实验表明，在48至57摄氏度的温度范围内，与二甲基亚砜组相比，黄杞素显著改变了KEAP1蛋白的热稳定性。