Name: 小分子化合物的蛋白质靶点预测与验证 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: 学习分子对接与细胞热迁移实验相结合的方法，用于预测和验证小分子化合物与蛋白质靶点的相互作用。该方案有效降低时间成本并提高实验可重复性。

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本工作得到国家自然科学基金（82004031）和四川省科技计划项目（2022NSFSC1303）的支持。我们非常感谢成都中医药大学中医药创新研究院孙佳怡在Western blot实验方面的协助。

1. 下载去氢骆驼蓬碱和Keap1的结构
<ol>
	<li>打开 PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），输入 xanthatin（小分子），然后按&#160;搜索 并点击 首个结果. 点击 下载 并单击 保存 在二维结构下将化合物以 .sdf 格式保存。</li>
	<li>下载该蛋白质的晶体结构。
	<ol>
		<li>打开 UniProt 数据库（https://www.uniprot.org/），输入 Keap1，然后点击&#160;搜索. 点击 人类 在左侧栏目中的常用生物类别下，然后点击 首个条目名称为 Q14145 在右侧栏中。</li>
		<li>点击 结构 在左侧列的功能下，找到 PDB ID 为 2FLU 的结构，然后点击 RCSB-PDB. 点击 下载文件 并选择 PDB 格式 下载Keap1蛋白的晶体结构。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 分子对接
<ol>
	<li>在桌面上创建一个名为 molecular docking 的新文件夹，并将下载的 xanthatin（小分子）和 Keap1（蛋白质）结构保存到该文件夹中。 
	注意：文件夹名称和路径必须为英文。</li>
	<li>打开 Maestro 软件，点击 文件，选择 更改工作目录，点击 桌面，双击以选择新创建的分子对接文件夹，然后单击 选择选项.</li>
	<li>小分子处理
	<ol>
		<li>点击 文件 并导入结构选项，点击 桌面，双击分子对接文件夹，然后点击 xanthatin 结构文件，然后单击 开放 导入小分子文件。</li>
		<li>点击 任务 在软件的右上角，选择 LigPrep 选项。使用工作区中的结构；其余参数为默认参数，然后单击 运行 进行小分子处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质结构处理
	<ol>
		<li>点击 文件与导入结构 选项，点击 桌面，然后双击 分子对接 文件夹。单击 Keap1蛋白结构 文件，然后单击 打开 导入蛋白质结构文件。</li>
		<li>点击 任务 软件右上角并选择 蛋白制备向导 选项。勾选该复选框 在删除距离杂合基团 5 Å 以外的水分子之前 并输入 pH 值为 7.4±0.0。点击 预处理，点击 优化，然后单击 优化 &#62; 去除水 &#62; 最小化.</li>
		<li>上一个任务完成后，点击下一个任务。点击 任务 并选择 网站地图 选项，使用所有参数的默认设置，然后单击 运行.</li>
		<li>点击 文件与导入结构 选项，点击 桌面，双击分子对接文件夹，打开名为 sitemap_1 的文件夹。点击第一个文件，名为 Sitemap_1_out.maegz，然后单击 开放.</li>
		<li>双击该点以在工作区中选择 sitemap_1_protein，然后单击 站点地图_1_站点_1 选择它。点击 任务 并选择 受体网格生成 选项 
		注意：网站地图预测的蛋白质位点将根据评分进行排序，评分最高的位点排在首位。</li>
		<li>选择 进入 受体下的选项，其余参数保持不变。点击 小白色球体 在蛋白质结构中生成默认大小的对接框，并将作业名称更改为 glide-grid_2FLU。单击 运行.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分子对接
	<ol>
		<li>点击 任务 并选择 配体对接 选项。选择 受体网格 从文件中点击 浏览点击 桌面，双击分子对接文件夹，双击 glide-grid_2FLU 文件，点击 Glide-grid_2FLU.zip 文件，然后点击 打开.</li>
		<li>点击 使用文件中的配体 &#62; 浏览 &#62; 桌面. 双击分子对接文件夹，双击 ligprep_1 文件，点击 Ligprep_1-out.maegz 文件，然后点击 开放.</li>
		<li>点击 设置 并选择 精确度为 XP（超精确） 选项，将作业名称更改为 glide-dock_XP_2FLU，然后单击 运行.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>查看对接结果
	<ol>
		<li>点击 文件与导入结构 选项，点击 桌面，然后双击 分子对接 文件夹。双击 glide-dock_XP_2FLU 文件，点击 glide-dock_XP_1_pv.maegz 文件，然后单击 打开.</li>
		<li>双击工作区中的点以选择配体，然后单击选择 sitemap_1_protein。单击 表格，滑动至最右侧，查看对接评分下的分数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二维结果的可视化
	<ol>
		<li>双击工作区中的点以选择配体，然后单击以同时选择 sitemap_1_protein。单击 配体相互作用 &#62; 查看 并检查 LID 图例 盒子</li>
		<li>点击 文件，选择 保存截图，宽度输入6000，取消勾选该框 透明背景，然后单击 好的. 点击 桌面将文件命名为 2D-xanthatin-2FLU，并保存图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>三维结果的可视化
	<ol>
		<li>双击工作区中的点以选择配体，然后单击以同时选择 sitemap_1_protein。</li>
		<li>点击 L 在快速选择中选择小分子，然后单击 风格. 点击 第二行 通过调整小分子键的大小，并点击彩色原子来更改小分子的颜色。</li>
		<li>在图中选择小分子，单击鼠标右键，选择 扩大选择范围，选择 4 Å。点击 应用标签 以特定样式显示标签。</li>
		<li>单击样式的第二行以更改氨基酸键的大小，然后单击 颜色原子 更改氨基酸颜色。</li>
		<li>点击 下一步 &#62; 倒置，按住控制键并点击“样式”下第一个眼睛位置，以仅显示带有标签的氨基酸。</li>
		<li>点击 风格 &#62; 带状物 以带状形式显示蛋白质并点击 编辑功能区 在功能区下方更改功能区颜色。</li>
		<li>点击 相互作用 切换 在屏幕右下角，单击鼠标右键，取消勾选“contacts/clashes”。</li>
		<li>在任务中搜索“measure”，然后选择 距离，点击屏幕上由黄色虚线（氢键）连接的两个原子，以测量氢键的长度。</li>
		<li>按住鼠标滚轮旋转蛋白质，调整蛋白质至屏幕中央，并确保每个氨基酸标签均清晰可见。</li>
		<li>点击 工作区 &#62; 将图像另存为 在桌面上单击，将图像默认保存为600 dpi，文件命名为3D-xanthatin-2FLU，文件类型选择为TIFF格式，然后保存图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 细胞培养与CETSA样本制备
<ol>
	<li>细胞培养
	<ol>
		<li>将 5 × 106 个 RAW264.7 细胞/mL 接种至 100 mm 培养皿中，加入 6 mL 含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 抗生素-抗真菌溶液的 DMEM 培养基，在 37 °C、95% 湿度和 5% CO2 条件下培养。准备三个培养皿，待细胞融合度达到 80% 时进行实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CETSA 样本制备
	<ol>
		<li>吸除旧培养基，向每个培养皿中加入 2 mL 预热至室温的磷酸盐缓冲液（PBS），洗涤两次。</li>
		<li>向每皿细胞中加入 2 mL PBS，混匀细胞后收集至两个 1.5 mL 微量离心管中，在室温下以 377 × g 离心 3 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，用含 1% 广谱蛋白酶抑制剂混合物的 2 mL PBS 重悬细胞，分装至若干微量离心管中，每管含 1 mL 细胞悬液。</li>
		<li>将微量离心管置于液氮中速冻至呈白色固体，立即在 37 °C 水浴中解冻，重复此冻融过程 3 次。随后在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟。</li>
		<li>取两个微量离心管，分别加入 100 µM 的 xanthatin 和等体积的 DMSO，再向每管中加入 450 µL 离心后的上清液，于 37 °C 孵育 30 分钟。</li>
		<li>将上述两管上清液分别加入 14 个 PCR 管中，每管 60 µL，对 DMSO 组和 xanthatin 组分别在不同温度（45 °C、48 °C、51 °C、54 °C、57 °C、60 °C 和 63 °C）下同时加热 3 分钟，每个温度设置两个 PCR 管。</li>
		<li>对于未加热组，分别从上述两个微量离心管中取上清液，加入 14 个 PCR 管中（DMSO 组 7 个，xanthatin 组 7 个），每管 60 µL，此组样本不进行加热处理。</li>
		<li>将加热组的 PCR 管在室温下冷却。所有样本（加热与未加热组）均在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟，从每管中取 48 µL 上清液转移至新的 1.5 mL 微量离心管中。每管加入 12 µL SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液，涡旋充分混匀后，在 100 °C 水浴中加热 5 分钟。 
		注：制备好的 CETSA 样本需保存于 -80 °C，并在 1 周内进行 Western 印迹检测。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 蛋白质印迹
<ol>
	<li>SDS-PAGE 胶的制备
	<ol>
		<li>用超纯水冲洗一块长玻璃板和一块短玻璃板，将玻璃板放入夹紧槽中，再置于透明板上。加入超纯水，密封性检查10分钟。</li>
		<li>取8 mL下层胶溶液和8 mL下层胶缓冲液加入锥形瓶中，轻轻摇动混匀。向胶溶液中加入160 µL促凝剂，充分混匀。 
		注意：夹紧槽中下层胶液的体积不得超过绿色标线。</li>
		<li>倒出玻璃板间的超纯水，用滤纸吸干。加入已配制好的下层胶溶液，再加入2 mL异丙醇，静置20分钟使其凝固。</li>
		<li>取2 mL上层胶溶液和2 mL上层胶缓冲液加入锥形瓶中，轻轻摇动混匀。</li>
		<li>移除胶层表面的异丙醇，并用滤纸吸去残留的异丙醇。</li>
		<li>向上层胶混合液中加入40 µL促凝剂，充分混匀后，注入长、短玻璃板之间，插入1.5 mm 15孔梳子，静置20分钟。 
		注意：梳子应垂直插入上层胶中，梳子与溶液之间不得产生气泡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电泳
	<ol>
		<li>向烧杯中加入1 L超纯水，加入一袋SDS-PAGE电泳缓冲液粉末，用玻璃棒充分搅拌溶解，将已制备的凝胶装入电泳装置中。将装置放入电泳槽，拔出梳子。</li>
		<li>室温下解冻marker和CETSA样品，涡旋混匀后离心。按照预定顺序，向第一孔加入2.5 µL marker，其余各孔分别加入20 µL CETSA样品。 
		注意：CETSA样品按照步骤3.2.6中描述的温度处理顺序，从45 °C至63 °C依次加入；DMSO组先加，随后为xanthatin组（图1）。</li>
		<li>将剩余的电泳液加入电泳装置中，盖上盖子，连接电极，正极对正极，负极对负极。</li>
		<li>打开电源开关，将电压调节至80 V，开始电泳。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转膜
	<ol>
		<li>向烧杯中加入850 mL超纯水、100 mL无水乙醇和50 mL快速转膜缓冲液，充分搅拌。准备好泡沫板、塑料刀、镊子、托盘和转膜装置。</li>
		<li>根据凝胶大小裁剪PVDF膜，做好标记后浸入甲醇中30秒以活化膜。</li>
		<li>将转膜液倒入托盘中，放置并打开转膜夹，依次放置海绵垫和三层转膜滤纸。</li>
		<li>停止电泳，打开电泳槽盖子。取出电泳装置，倒出电泳液，拆下玻璃板。将玻璃板放在泡沫板上，用塑料刀轻轻撬开，切下凝胶，以便清晰观察蛋白marker和目标蛋白。</li>
		<li>用镊子夹住marker一侧，将凝胶在含转膜液的托盘中漂洗，平铺于滤纸上。将活化后的PVDF膜浸入转膜液中，用镊子夹住标记面，将膜标记面朝下覆盖在凝胶上。 
		注意：PVDF膜的标记面为正面，放置过程中应注意避免产生气泡。</li>
		<li>在PVDF膜上依次放置两层转膜滤纸和一层海绵垫，盖上转膜夹并夹紧，放入转膜槽中。 
		注意：转膜夹的黑色面应对准转膜槽的黑色面。</li>
		<li>将剩余的转膜液加入转膜夹中，盖上盖子，正极对正极，负极对负极。</li>
		<li>调节电流至400 mA，时间设为30分钟，按下“Run”键，开始室温转膜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>封闭
	<ol>
		<li>向玻璃瓶中加入2 L超纯水，加入一袋TBS粉末，再加入2 mL Tween，配制成TBST溶液。称取BSA粉末，用TBST配制5% BSA溶液，并向孵育盒中加入6 mL BSA溶液。</li>
		<li>停止转膜，打开转膜夹。用镊子夹住PVDF膜的marker侧，将其放入孵育盒中。将孵育盒置于摇床上，室温封闭1.5小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>一抗孵育
	<ol>
		<li>用5% BSA溶液按1:1000比例稀释一抗（详见材料表），回收孵育盒中的BSA溶液，向孵育盒中加入6 mL一抗溶液。将孵育盒放入含冰袋的泡沫盒中，置于摇床上过夜孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二抗孵育
	<ol>
		<li>次日回收孵育盒中的一抗，加入6 mL TBST溶液，置于摇床上洗涤5分钟。</li>
		<li>倒去洗涤后的TBST溶液，更换新鲜TBST溶液进行洗涤，重复5次；同时用5% BSA溶液按1:5000比例稀释二抗。</li>
		<li>倒去TBST溶液，向孵育盒中加入6 mL二抗溶液。将孵育盒置于摇床上，室温孵育1.5小时。</li>
		<li>回收二抗（详见材料表），加入6 mL TBST溶液，置于摇床上洗涤5分钟。倒去洗涤液，更换新鲜TBST溶液，重复洗涤5次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>显影
	<ol>
		<li>最后一次洗涤结束后保留TBST溶液。取等体积的化学发光试剂A和B，混匀并避光保存。</li>
		<li>打开凝胶成像系统，点击样品，进行校准，等待校准完成，然后点击marker，再次校准。</li>
		<li>用镊子夹住条带的marker侧，完全浸入化学发光试剂中。夹住marker一侧，将条带正面朝下放入成像仪，关闭盖子，点击曝光，设置曝光时间为1秒。 
		注意：显影液必须完全覆盖条带，且显影过程应在暗环境中进行。</li>
		<li>点击保存，命名图像并保存为.tif文件。分析Western blot条带的光密度。DMSO组各温度点的灰度值与45 °C的灰度值进行比较，xanthatin组各温度点的灰度值与xanthatin在45 °C的灰度值进行比较。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Validating Xanthatin-Keap1 Interaction with Docking and CETSA

<ol><li>Soleymani, F., Paquet, E., Viktor, H., Michalowski, W., Spinello, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interaction+prediction+with+deep+learning%3A+A+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Computat+Struct+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interaction prediction with deep learning: A comprehensive review.</a> Computat Struct Biotechnol J. 20, 5316-5341 (2022).</li>
<li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+protein-ligand+interactions%3A+mechanisms%2C+models%2C+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods.</a> Int J Mol Sci. 17 (2), 144(2016).</li>
<li>Wu, Q., Peng, Z., Zhang, Y., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COACH-D%3A+improved+protein-ligand+binding+sites+prediction+with+refined+ligand-binding+poses+through+molecular+docking%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">COACH-D: improved protein-ligand binding sites prediction with refined ligand-binding poses through molecular docking.</a> Nucleic Acids Res. 46, W438-W442 (2018).</li>
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<li>Dhakal, A., Mckay, C., Tanner, J. J., Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+intelligence+in+the+prediction+of+protein-ligand+interactions%3A+recent+advances+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Artificial intelligence in the prediction of protein-ligand interactions: recent advances and future directions.</a> Brief Bioinform. 23 (1), 476(2022).</li>
<li>Hatty, C. R., Banati, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-ligand+and+membrane-ligand+interactions+in+pharmacology%3A+the+case+of+the+translocator+protein+%28TSPO%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">Protein-ligand and membrane-ligand interactions in pharmacology: the case of the translocator protein (TSPO).</a> Pharmacol Res. 100, 58-63 (2015).</li>
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<li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside+intensifies+mitochondrial+function+of+CoCl2-damaged+HT22+cells+by+stimulating+PI3K-AKT-MAPK+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway.</a> Phytomedicine. 109, 154568(2022).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside%2C+a+phenyl+ethanol+glycoside+from+Rhodiolacrenulata%2C+orchestrates+hypoxic+mitochondrial+dynamics+homeostasis+by+stimulating+Sirt1%2Fp53%2FDrp1+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiolacrenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling.</a> J Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

疾病靶点的鉴定以及药物的发现与开发密切相关27。通过精准靶向特定靶点，可开发出更有效治疗特定疾病的候选药物，同时最大限度地减少药物相关的副作用28,29。最常见的靶点是蛋白质靶点30。然而，由于细胞内蛋白质具有高度多样性，特异性蛋白质靶点的鉴定面临巨大挑战30,31。本文中，我们采用了一种结合分子对接与CETSA的方法来鉴定并验证蛋白质靶点。结果揭示了瞻子素（xanthatin）与Keap1蛋白之间存在直接相互作用。计算机技术与生物学实验的结合也可用于研究其他药物与蛋白质靶点之间的直接相互作用。这种结合预测与验证的方法，有效降低了时间和经济成本。此外，实验仪器和材料易于获取，操作流程不复杂。最后，CETSA样本可通过Western blot方法方便地制备和检测，从而确保样本的可重复性。
根据我们的经验，在实验过程中有几个关键方面需要特别注意。首先，在进行分子对接之前选择蛋白质结构时，必须选用通过X射线分析解析出的蛋白质晶体结构。其次，细胞密度以及冻融时间是CETSA实验中的关键因素。应选择处于对数生长期的细胞进行CETSA实验，因为此阶段细胞生长状态稳定，对实验结果的影响最小。在对细胞进行反复冻融时，需严格控制时间：使用液氮冷冻至形成白色固体，随即在室温下迅速解冻，再进行下一轮冷冻。最后，CETSA样品制备完成后必须尽快进行Western blot实验，以防止蛋白质降解。
分子对接和细胞热转变分析（CETSA）均为药物研发领域中成熟且至关重要的技术。分子对接有助于预测化合物与其靶标之间的分子水平相互作用，为潜在结合模式提供重要信息10,11。相比之下，CETSA 主要用于评估药物对蛋白质热稳定性的影响，是验证药物-蛋白质相互作用的有效工具17。尽管 CETSA 是一种相对简便的验证方法，但若采用 Western blot 检测药物-蛋白质复合物的热漂移，则通量较低，不应作为唯一依赖的技术。此外，CETSA 操作步骤较为复杂，任何操作环节的失误均可能对结果产生显著影响。同时，CETSA 方法无法确定化合物与蛋白质靶标之间的具体结合位点和结合模式，也无法判断结合为共价还是非共价相互作用17,18,23。除热漂移分析外，其他基于能量的检测方法，如 pH 依赖性蛋白质沉淀（pHDPP），也可用于研究配体-蛋白质相互作用32。此外，热蛋白质组分析是一种基于能量的方法，通过将蛋白质组学与 CETSA 相结合，可实现对蛋白质-药物相互作用的高通量、大规模分析33。
此外，局域表面等离子体共振（LSPR）可提供进一步的定性和定量分析34,35。它不仅能够确定药物与其靶标之间相互作用的存在，还能测量这些分子间相互作用的亲和力参数和动力学参数，从而提供更全面的理解。
除了热迁移实验外，pH依赖性蛋白质沉淀（pHDPP）也可用于研究配体-蛋白质相互作用32。分子对接是一种基于物理力学的模拟方法，用于预测小分子与生物大分子之间的相互作用。该方法通过优化小分子的构象和取向，以实现其与生物大分子之间的最佳互补性，从而达到结合的目的。靶点预测则利用人工智能技术来预测小分子与生物大分子之间的结合位点。这两种方法在应用方式和预测准确性方面存在关键差异。应用方式：分子对接主要用于药物设计与优化，为新药发现提供理论依据；而靶点预测借助更先进的人工智能技术，更多应用于高通量筛选和先导化合物的快速发现，以提高药物发现的效率。预测准确性：由于分子对接基于物理模拟，其预测准确性较高，但计算成本也相对较高；而靶点预测的计算成本较低，其预测准确性则依赖于训练数据的丰富程度和模型的选择。

蛋白质是生物体内极为重要的大分子，在细胞内具有多种独特功能，如参与膜结构组成、细胞骨架形成、酶活性、物质运输、细胞信号传导，以及在细胞内和细胞外机制中的作用1,2,3。蛋白质主要通过与多种分子的特异性相互作用来发挥其生物学功能，这些分子包括其他蛋白质、核酸、小分子配体以及金属离子1,4。配体是指在生物体内能够特异性结合蛋白质的小分子化合物。蛋白质与配体的相互作用发生在蛋白质上的特定位置，称为结合位点，也称为结合口袋5。在药物化学研究中，重点在于识别与疾病明确相关的关键蛋白质，这些蛋白质可作为药物的作用靶点6。因此，深入理解蛋白质与配体之间的结合位点对于推动药物发现、药物设计及相关研究具有极其重要的意义7,8。
分子对接是一种广泛使用的计算工具，用于研究蛋白质与配体的结合，它利用蛋白质和配体的三维结构来探索它们在形成稳定复合物时的主要结合模式和亲和力9,10,11。分子对接技术的应用起源于20世纪70年代。基于锁钥匹配原理，并结合分子对接软件的算法，可通过分析对接结果确定化合物与分子靶标之间的相互作用。该方法能够预测化合物和靶分子的活性结合位点，从而有助于识别配体-受体相互作用的最佳结合构象（此处称为结合模型），这对于理解这些分子相互作用的机制至关重要12,13,14,15。尽管分子对接可提供有价值的基于计算机的配体-受体相互作用预测结果，但需注意这些仅为初步发现，因此必须通过进一步的实验验证来确认这些相互作用。
细胞热迁移实验（CETSA）最初由 Pär Nordlund 的研究团队于2013年提出，是一种用于验证药物-靶标蛋白相互作用的方法。该技术通过检测药物结合所诱导的靶标蛋白热稳定性的变化，为确认分子间相互作用提供了一种实用的手段16,17,18。该方法基于配体结合可引起靶标蛋白发生热迁移这一基本原理，适用于多种生物样本，包括细胞裂解液、完整活细胞以及组织样本19,20。CETSA 能够通过检测配体结合引起的蛋白质热力学稳定性变化，在完整细胞中直接证实小分子与靶标的结合，并将观察到的表型反应与靶向化合物联系起来21,22。在源自 CETSA 的多种技术方法中，蛋白质印迹-CETSA（WB-CETSA）被视为一种经典方法。在采用 CETSA 方法完成样本制备后，通过蛋白质印迹分析检测靶标蛋白热稳定性的变化，从而精确定量细胞体系中药物与蛋白之间的相互作用17,23。
叉苔素是从苍耳属（Xanthium L.）植物中分离得到的一种具有生物活性的化合物，具有抗炎等特性，已在传统中医中用于治疗鼻窦炎和关节炎等疾病24,25。Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）是基于Cullin3的Cullin-RING E3泛素连接酶多亚基蛋白复合物的组成部分，也是细胞内氧化还原稳态的重要调控因子，通过调节细胞内氧化还原状态影响炎症反应的强度和持续时间26。在本研究中，我们首先采用分子对接技术探究叉苔素（小分子）与Keap1蛋白之间的相互作用，旨在预测其结合模式；随后，利用CETSA方法评估叉苔素对Keap1蛋白热稳定性的影响，以验证该相互作用。

<table><tbody><tr><td>0.45 &amp;mu;m 聚偏氟乙烯膜</td><td>Millipore</td><td>PR05509</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Chron chemicals</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>BioFroxx</td><td>4240GR100</td><td></td></tr><tr><td>广谱蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>AR1193</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>PYG0040</td><td></td></tr><tr><td>增强型化学发光试剂</td><td>Beyotime Biotechnology Co., Ltd</td><td>P0018S</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH 抗体</td><td>ProteinTech Group Co., Ltd</td><td>10494-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>凝胶成像仪</td><td>E-BLOT</td><td>Touch Imager Pro</td><td></td></tr><tr><td>梯度PCR仪</td><td>Biometra TADVANCED</td><td>Biometra Tadvanced 96SG</td><td></td></tr><tr><td>高速冷冻离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-30R</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的affiniPure山羊抗体</td><td>ProteinTech Group Co., Ltd</td><td>SA00001-2</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇&amp;nbsp;</td><td>Chron chemicals</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>Keap1 抗体</td><td>Zen BioScience Co., Ltd</td><td>R26935</td><td></td></tr><tr><td>金属浴</td><td>Analytik Jena</td><td>TSC</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Chron chemicals</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Ncmblot 快速转膜缓冲液（20&amp;times;）</td><td>NCM Biotech Co., Ltd</td><td>WB4600</td><td></td></tr><tr><td>Omni-Easy OneStep PAGE 胶快速制备试剂盒</td><td>Epizyme Biotech Co., Ltd</td><td>PG212</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>PYG0021</td><td></td></tr><tr><td>预染彩色蛋白质Marker</td><td>Biosharp&amp;nbsp;</td><td>BL741A</td><td></td></tr><tr><td>蛋白印迹电泳系统</td><td>Bio-Rad</td><td>MiniPROTEAN&amp;Ograve;Tetra Cell</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 细胞</td><td>Beyotime Biotechnology Co., Ltd</td><td>C7505</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 细胞专用培养基</td><td>Procell Life Science&amp;Technology Co., Ltd</td><td>CM-0597</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>AR1112-10</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE 电泳缓冲液粉末</td><td>Servicebio</td><td>G2018</td><td></td></tr><tr><td>Tris 缓冲盐水粉末</td><td>Servicebio</td><td>G0001</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BioFroxx</td><td>1247ML100</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Memmert</td><td>WNE10</td><td></td></tr><tr><td>纯水仪</td><td>Millipore</td><td>Milli- IQ 7005</td><td></td></tr><tr><td>黄杨碱</td><td>ChemConst Biotechnology Co., Ltd</td><td>CONST210706</td><td></td></tr></tbody></table>

小分子化合物的靶蛋白预测与验证

Protein Target Prediction and Validation of Small Molecule Compound

蛋白质对人体生理功能至关重要，其靶点在科研和药物开发中具有关键作用。重要蛋白质靶点的鉴定与验证已成为药物研发的重要组成部分。分子对接是一种广泛使用的计算工具，用于研究蛋白质与配体的结合，特别是在药物与蛋白质靶点相互作用的背景下。为了实验验证结合情况并直接检测药物与其靶点的结合，可采用细胞热迁移分析法（CETSA）。本研究旨在整合分子对接与CETSA技术，以预测并验证药物与关键蛋白质靶点之间的相互作用。具体而言，我们通过分子对接分析预测了xanthatin与Keap1蛋白之间的相互作用及其结合模式，随后利用CETSA实验验证了该相互作用。实验结果表明，xanthatin能够与Keap1蛋白的特定氨基酸残基形成氢键，并降低Keap1蛋白的热稳定性，提示xanthatin可直接与Keap1蛋白发生相互作用。

分子对接分析预测了瞻那汀与 Keap1 蛋白之间的相互作用。图 2 展示了瞻那汀与 Keap1 蛋白的 Gly-367 和 Val-606 氨基酸残基之间形成氢键的情况，其中 Gly-367 的氢键长度为 2.17 Å，Val-606 的氢键长度为 2.13 Å。此外，计算得到的对接得分为 -5.69 kcal/mol，表明瞻那汀与 Keap1 蛋白之间具有良好的结合亲和力。
CETSA 方法显示，xanthatin 与 Keap1 蛋白结合改变了其热稳定性，证实了 xanthatin 与 Keap1 蛋白之间的相互作用21。图 3 表明，在 48 °C 至 57 °C 的温度范围内，与 DMSO 组相比，xanthatin 显著改变了 Keap1 蛋白的热稳定性。为确保样品上样量一致，首先，实验所用细胞接种密度保持一致；其次，将 DMSO 组和 xanthatin 组的细胞样品在细胞培养皿中充分混匀后，均分至两支微量离心管中，以保证细胞样品量一致；每管 PCR 管中加入的上清液体积为 60 µL；最后，Western blot 每个样品上样体积为 20 µL，从而确保加热后样品的上样量一致。在约 51 °C 时样品中蛋白质的降解主要归因于高温引起的蛋白质结构变化及化学反应速率的加快。上述结果表明，xanthatin 可直接与 Keap1 蛋白结合。
<img alt="用于蛋白质分析的带温度梯度的电泳装置；凝胶中可见颜色条带" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66564/66564fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：Western 印迹上样顺序。 温度从左到右依次为 45 °C、48 °C、51 °C、54 °C、57 °C、60 °C 和 63 °C。第一泳道加入的是蛋白分子量标记物；每个温度使用两个泳道，第一个泳道为 DMSO 组，第二个泳道为 xanthatin 组。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66564/66564fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="药物靶点分析中的分子相互作用图及三维蛋白-配体结合结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66564/66564fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：xanthatin 与 Keap1（PDB: 2FLU）蛋白的相互作用。（A） xanthatin 与 Keap1 结合的二维示意图。（B） xanthatin 与 Keap1 蛋白的三维可视化结构。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66564/66564fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Keap1 稳定性分析；显示不同温度下蛋白表达的 SDS-PAGE 凝胶及图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66564/66564fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：xanthatin 对 Keap1 蛋白热稳定性的影响。（A）采用细胞热转变分析法（CETSA）检测 xanthatin 对 Keap1 蛋白热稳定性的影响。（B）Keap1 的光密度值经 45 °C 条件下的数值归一化处理。数据以均值 ± 标准差表示。统计学分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。n = 3。*p &lt; 0.05，**p &lt; 0.01，***p &lt; 0.001，****p &lt; 0.0001。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66564/66564fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本实验采用分子对接结合细胞热迁移实验的方法，用于预测并验证小分子与蛋白质靶标之间的相互作用。

蛋白质是人体生理功能的基础，其作用靶点在科学研究和药物开发中至关重要。靶点的鉴定与验证……

我们的研究聚焦于蛋白质靶点以及小分子化合物的预测与验证。本实验采用分子对接结合类似热迁移实验（TSA）的方法，用于预测和验证小分子与蛋白质靶点之间的相互作用。TSA实验步骤较为复杂，操作过程中任何步骤的误差都可能对结果产生重大影响。本实验方案将预测与验证相结合，有效减少了时间和经济成本。此外，实验所需的仪器和材料易于获取。最后，待检测的TSA样品易于制备和测试，从而确保了样品的可重复性。首先，下载去氢木香内酯（xanthatin）和KEAP1的晶体结构。处理结构后，进入“任务”（Tasks）并选择“配体对接”（Ligand Docking）选项。从文件中选择“受体网格来源”（Receptor Grid As），然后点击“浏览”（Browse）。然后单击桌面。打开分子对接文件夹，双击 glide-grid 2FLU 文件。选择 glide-grid 2FLU。zip 文件，然后单击“打开”。接着单击“使用来自文件的配体”，再单击“浏览”并选择桌面。选择分子对接文件夹并打开 ligprep_1 文件。然后，选择 ligprep_1-out.maegz 文件，然后单击打开。进入访问设置并选择精度为 XP 选项。将作业名称修改为 glide.XP_2FLU，然后点击运行。要查看对接结果，请点击“文件”并选择“导入结构”选项。导航至桌面并打开分子对接文件夹，然后选择 glide-doc_XP_2FLU 文件。选择 glide-doc_XP1_pv.maegz 文件，然后单击打开。接着在工作区中双击圆点以选择配体。选择 sitemap_1_protein。点击表格并滑动至最右侧以查看对接得分。要可视化二维结果，请选择 sitemap_1_protein，操作方式如前所述。单击配体相互作用。选择“视图”并勾选“LID图例”框，然后单击“文件”。选择“保存截图”，宽度输入 6,000。取消勾选透明背景选项，然后点击“确定”。将文件保存到桌面，命名为 2D-xanthatin-2FLU。分子对接分析预测了蛇床子素与KEAP1蛋白之间的相互作用。首先，将未处理的264.7细胞接种至100毫米培养皿中，加入6毫升DM-EM培养基，在37摄氏度、95%湿度和5%二氧化碳条件下培养。待细胞融合度达到80%时，吸除旧培养基。随后用 2 毫升预热至室温的 PBS 洗涤细胞两次。接着，向每个含细胞的培养皿中加入 2 毫升 PBS 并混匀。将细胞收集至两个 1.5 毫升微量离心管中，于室温下以 377 × g 离心 3 分钟。弃去上清液后，将细胞重悬于 2 毫升 PBS 中。将微量离心管置于液氮中冷冻至出现白色固体，立即在 37 摄氏度水浴中解冻。在 4 摄氏度条件下，以 12,000 G 离心 10 分钟。接下来，取两支微量离心管，一支加入100微摩尔的黄杞醇，另一支加入等体积的二甲基亚砜。向每支离心管中加入450微升离心后的上清液，并在37摄氏度下孵育30分钟。然后从每支微量离心管中转移60微升上清液至14个PCR管中。将试管在不同温度下同时加热三分钟，每个温度放置两支PCR管。然后将试管放入离心机中。接着从每支试管中吸取48微升上清液，加入新的1.5毫升微量离心管中。向每个离心管中加入 12 微升 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液。将涡旋混匀后的样品置于 100 摄氏度的水浴中加热 5 分钟。首先，制备 SDS-PAGE 凝胶。离心已解冻的蛋白标记物和制备好的细胞热迁移实验样品。取2.5 µL标记物加入第一孔，其余各孔每孔加入20 µL样品。随后以80伏电压电泳运行凝胶。接下来，向烧杯中加入850毫升超纯水、100毫升无水乙醇和50毫升快速转移缓冲液，充分搅拌。根据凝胶的大小裁剪聚偏二氟乙烯（PVDF）膜并做好标记。然后将其浸入甲醇中30秒以活化。 将转膜夹、海绵垫和三层转膜滤纸放入盛有转膜缓冲液的托盘中。电泳完成后，倒出电泳装置中的电泳液，取出玻璃板。用塑料刀小心取出凝胶，并进行切割，以清晰观察蛋白 Marker 和目标蛋白。在转膜液中洗涤凝胶后，将其平铺在滤纸上。将活化的PVDF膜浸入转移缓冲液中，用镊子夹住标记面，将膜覆盖在凝胶的背面。然后将组装好的转膜装置放入转膜槽中。向转膜夹中加入剩余的转膜液。调节电流和时间，按下运行键以在室温下开始转膜。现在向孵育盒中加入6毫升含5% BSA的TBST溶液。转膜完成后，夹住标记一侧将PVDF膜从装置中取出，并放入孵育盒中。从孵育盒中移除BSA溶液后，加入6毫升一抗溶液。将孵育盒放入装有冰袋的泡沫盒中，4℃摇床孵育过夜。次日，收集一抗溶液至离心管中，用6毫升TBST溶液洗涤膜。随后，向孵育盒中加入6毫升二抗溶液。孵育结束后，收集二抗，并用 TBST 按前述方法洗涤膜五次。等体积混合化学发光试剂 A 和 B。打开凝胶成像系统，点击“Samples”，检查校准状态，并等待校准完成。然后点击标记物并检查校准情况。现在用镊子夹起试纸条的标记物一侧，完全浸入化学发光试剂溶液中。夹住标记物的一侧，将试纸条正面朝下放入成像仪中，并关闭成像仪的盖子。将曝光时间设置为1秒，然后点击“Capture”（采集）。点击“Save”（保存）。为图像命名，并将其保存为TIFF文件。细胞热迁移实验表明，在48至57摄氏度的温度范围内，与二甲基亚砜组相比，黄杞素显著改变了KEAP1蛋白的热稳定性。

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医学

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利用人类差异表达基因列表进行下游通路富集分析与靶点优先排序

本文介绍了一种通过整合多个配体的分子特征来构建共识药效团模型的实验方案。该方法适用于针对具有已知配体结合构象的任何生物靶标的药物发现研究，能够识别出用于虚拟筛选和合理药物设计的关键相互作用特征。...

基于丰富配体库靶点的药效团建模：以SARS-CoV-2 Mpro为例

本文展示了在产科患者中进行的弥散性有害抑制性控制、时间总和以及伤口痛觉过敏测试。这些测试用于评估疼痛处理过程中的抑制性和兴奋性机制，并在此用于评价妊娠期间及围产期不同时间点的内源性镇痛情况，以帮助揭示个体发生持续性疼痛的风险。...

一种用于预测术后疼痛（PPOP）的实验范式

我们描述了一种创伤后应激障碍（PTSD）的大鼠模型，该模型揭示了神经内分泌功能的持续性改变以及延迟出现的长期过度恐惧反应，这些特征与PTSD患者的表现一致。本文所述的动物模型和方法可用于关联脑核团中的生物标志物（具有机制性意义但无法在患者中检测）与外周白细胞中的生物标志物（可检测）。...

用于揭示创伤后应激障碍神经、血液学及行为相关性的动物模型中的生物标志物

学习分子对接与细胞热迁移实验相结合的方法，用于预测和验证小分子化合物与蛋白质靶点的相互作用。该方案有效降低时间成本并提高实验可重复性。

小分子化合物的靶蛋白预测与验证

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