活体小鼠肺移植的双光子显微成像

我们研究的目的是了解缺血再灌注损伤以及肺移植后炎症与免疫耐受反应背后的免疫机制。我们希望研究供体与受体细胞之间的动态相互作用。目前，我们在小鼠肺移植免疫学研究中应用了多种外科手术和成像技术。

这些技术包括原位左肺移植和再移植、左肺门阻断、非侵入性正电子发射断层扫描，以及双光子活体成像。我们的研究揭示了移植肺中独特的免疫应答。通过先进的成像技术，我们发现受体来源的单核细胞通过IL-1β促进中性粒细胞在肺同种异体移植物中的浸润。

我们还发现，FOXP3调节性T细胞在这些异体移植物内聚集，并可防止抗体介导的排斥反应。该技术易于建立，所需材料在显微镜实验室中常见，例如组织胶和盖玻片。此外，与其他技术相比，该方法可提供更大的视野范围。

我们的实验室致力于研究诱导和维持肺同种异体移植物耐受性的机制。活体成像技术将使我们能够观察在排斥反应和耐受过程中免疫细胞之间的相互作用。首先，将一只接受过肺移植手术并已麻醉的小鼠置于右侧卧位。

用0.75%碘和70%乙醇混合液擦拭胸部皮肤。通过第三肋间重新打开左侧开胸切口。现在去除左侧开胸部位上方的部分皮肤和软组织，并打开胸腔。

用止血钳夹闭肋骨10秒，以使任何微小血管血栓形成。接着，切除第三至第五肋骨的部分骨段，以创建成像窗口。使用电凝笔止住肋骨断端可能的出血。

现在将一小块折叠的纱布垫在右侧胸部下方。用棉签将肺移植物从胸腔中轻轻抬起，并将其下部放置在一条尺寸为1厘米×3厘米的生理盐水浸湿纱布条上。开始时，将一只已行气管插管并打开胸腔的小鼠置于成像室底板上，使其左侧开放的胸腔朝上。

用胶带固定小鼠的面部、前爪和尾巴。将胶水涂抹在连接于顶板的盖玻片底面。接着，缓慢放下顶板，使盖玻片接触肺组织，让胶水接触到肺表面。

将盖玻片紧贴肺组织。使肺充气一到两秒钟，以便胶水区域粘附于周围组织。在每个螺栓上放置一个拇指螺母，并固定顶板。

进行双光子成像时，将带有小鼠的整个成像腔室放置在显微镜载物台上。使用二向色滤光片分离来自GFP报告基因、量子点以及胶原产生的二次谐波信号（SHG）。接下来，将钛宝石飞秒脉冲激光器的激发波长设置为890纳米，并以尽可能低的功率进行激发。

在顶板的盖玻片上加入一毫升水。现在将水浸物镜浸入水中，并聚焦于肺表面。打开底板加热器，使温度保持在35至37摄氏度之间。

使用选定的采集软件获取图像序列。移植后24小时，肺部的中性粒细胞数量较移植后2小时更多。