Name: 评估大鼠膈肌运动单元连接结果测量作为膈运动神经元变性和代偿的定量生物标志物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-19T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: 了解大鼠膈肌运动单元连接评估方法，使用MuNI技术量化膈运动神经元数量与大小。该技术可非侵入性纵向评估神经肌肉功能，为研究呼吸运动系统代偿机制提供重要工具。

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本研究由密苏里州脊髓损伤/疾病研究计划（Missouri Spinal Cord Injury/Disease Research Program）的脊髓损伤/疾病研究项目资助（NLN 和 WDA）。

所有操作均经密苏里大学机构动物护理和使用委员会批准，并遵循其制定的指南进行。实验采用11至15周龄的成年雄性Sprague-Dawley大鼠。这些大鼠每两只同笼饲养，维持12小时光照与12小时黑暗的循环周期，并可随时获取标准商用颗粒饲料和经盐酸处理的饮水。
1. 动物准备与麻醉给药
<ol>
	<li>操作大鼠时应穿戴适当的个人防护装备。</li>
	<li>使用3-5%异氟烷进行吸入麻醉，确保充分诱导。当大鼠被充分麻醉后，将其置于仰卧位，并以1-3%吸入异氟烷维持麻醉状态。用镊子轻轻按压后肢足垫，检查是否存在回缩反应，以确认麻醉深度是否足够。 
	注意：根据大鼠的体型和体重，监测麻醉深度，并相应调整异氟烷浓度。</li>
	<li>使用恒温加热板维持体温在37 °C，以防止温度波动影响复合肌肉动作电位（CMAP）的波幅和潜伏期。</li>
	<li>在眼部涂抹兽用石油基眼膏，防止角膜干燥。通过观察呼吸频率以及用镊子按压足垫时是否有回缩反应，来监测麻醉深度。</li>
	<li>使用剪毛器去除胸部和颈部待检测区域下三分之一处的毛发。在整个实验过程中持续监测大鼠的呼吸情况。 
	注意：在完成复合肌肉动作电位（CMAP）和运动单位数目估计（MUNE）记录并停止麻醉后，不得在大鼠未完全恢复意识前离开看护。在大鼠完全恢复前，不得将其放回饲养笼中。</li>
</ol>
2. 电极放置与设置
<ol>
	<li>按照 图1 所示，放置一对 28 G 单极针电极，用于记录 CMAP、SMUP 和 MUNE。
	<ol>
		<li>将作用电极（E1）针电极置于最后一根肋骨下缘的锁骨中线皮下，参考电极（E2）针电极置于剑突与最后一节胸肋软骨交角处的皮下。 
		注意：针电极不应插入膈肌内，而应置于皮下区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在颈动脉鞘处刺激膈神经时，使用一对 28 G 单极针电极作为阴极和阳极进行神经刺激，并将其皮下放置于前斜角肌与中斜角肌之间的侧颈部，两电极相距约 1 cm。确保刺激针电极的位置位于第四颈椎（C4）水平以下。 
	注意：避免将刺激电极插入过深，以防损伤膈神经或其他结构。图1 展示了电极的放置位置。</li>
	<li>接地电极应使用一次性表面电极，贴于尾部。</li>
</ol>
3. 数据采集
<ol>
	<li>膈神经复合肌肉动作电位（CMAP）
	<ol>
		<li>采用持续时间为 0.1 ms、强度在 60 至 100 mA 范围内的单相阴性方波脉冲刺激膈神经，记录膈神经复合肌肉动作电位（CMAP）反应。</li>
		<li>逐步增加刺激强度，获取 CMAP 反应，直至反应幅度不再进一步增加。为确保超强刺激，将刺激强度提高至诱发最大反应所需强度的约 120%，并额外记录一次反应。若 CMAP 幅度不再增加，则将此反应视为最大 CMAP。 
		注意：为尽量减少 CMAP 记录期间并发的肌肉活动噪声，建议在呼气相进行刺激。</li>
		<li>测量并记录 CMAP 的峰-峰幅值（单位为毫伏，mV）（图 2）。 
		注意：CMAP 幅值可采用基线-峰或峰-峰方式进行评估。临床电诊断系统通常默认采用基线-峰评估，即从等电位基线至初始负向波峰进行计算。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>平均单个运动单位电位（SMUP）大小及运动单位数目估计（MUNE）计算
	<ol>
		<li>采用增量刺激法计算平均 SMUP 大小。
		<ol>
			<li>为诱发增量反应，以 0.1 ms 持续时间、1 Hz 频率施加亚最大刺激，逐步以 0.03 mA 增量递增刺激强度，直至获得最小的“全或无”反应。初始反应的刺激强度应在 2 mA 至 10 mA 范围内获取。</li>
			<li>若初始反应在 2 mA 至 10 mA 刺激强度范围内未出现，可调整刺激阴极的位置，将其在颈部更靠近或远离膈神经，以分别降低或提高所需刺激强度。</li>
			<li>若首次增量反应在 2 mA 至 10 mA 刺激强度范围内获得，则保存首次反应，并继续以 0.03 mA 为增量逐步提高刺激强度，获取额外 9 次增量反应，且每次增量均需满足步骤 3.2.2 中所述标准。 
			注意：每个 SMUP 通过将当前增量减去前一增量进行量化。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在测量增量反应过程中，确保每次增量均满足以下标准：
		<ol>
			<li>确保增量反应的初始负向波峰在时间上与最大 CMAP 反应的负向波峰对齐。 
			注意：由于呼吸周期引起的背景噪声所致的轻微波动是本实验固有的现象。然而，在实时观察中 SMUPs 的持续存在可确认其对应于特定 CMAP 的真实性。</li>
			<li>由于膈肌是参与呼吸的动态肌肉，每个呼吸周期可能引起基线漂移。因此，需通过三次重复记录的反应一致性，验证每次增量反应的稳定性及无波形离散现象。 
			注意：为将低幅值诱发的电位（尤其是首个 SMUP）与呼吸活动引起的背景噪声区分开，需保持警觉并观察 3–4 个呼吸周期。同时，应确保波峰与 CMAP 波峰对齐以保证准确性。</li>
			<li>确保每次增量均明显且大于前一次增量。因此，需在实时观察中通过叠加前次记录的增量，直观区分增量反应。 
			注意：可在每个刺激强度下进行多次重复，以确保增量的一致性并符合预设标准。</li>
			<li>在通过上述标准目视确认每次增量后，验证其增量幅值至少为 25 µV。若增量小于 25 µV，则弃用该测量值并重新评估反应。</li>
			<li>在记录 10 次增量反应后，验证每次增量反应的幅值不超过所有 10 次增量总幅值的三分之一（即最终反应的总幅值）。若不满足此标准，需重复测量 10 次增量反应。 
			注意：三分之一阈值基于以下假设：每次增量反应代表单个运动单位的激活。若任一次增量反应的幅值超过所有十次增量总幅值的三分之一，则提示该反应可能并非仅由单个运动单位激活所致，而可能受到额外运动单位募集或非特异性活动（如电噪声或伪迹）的影响22，26。</li>
			<li>为估算 SMUP 的平均幅值，取 10 次增量值的平均值。另一种测量平均 SMUP 幅值的方法是将最终增量反应的总幅值除以增量总数11。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过将最大 CMAP 幅值（峰-峰）除以平均 SMUP 幅值（峰-峰）来确定运动单位数目估计值（MUNE）。在某些电生理系统中，SMUP 以微伏（µV）记录，而 CMAP 通常以毫伏（mV）表示。计算 MUNE 前，如有需要，应将 CMAP 和 SMUP 测量值转换为相同单位。 
		注意：峰-峰 CMAP、平均 SMUP 及 MUNE 通常由临床肌电图系统自动计算： 
		<img alt="公式 1" src="/files/ftp_upload/66568/66568eq01v2.jpg" style="margin: auto;" /> 
		CMAP = 复合肌肉动作电位 
		SMUP = 单个运动单位电位 
		MUNE = 运动单位数目估计</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Quantifying Phrenic Motor Unit Function in Rodent Models of Neurodegeneration

<ol><li>Mantilla, C. B., Zhan, W. -Z., Sieck, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+labeling+of+phrenic+motoneurons+by+intrapleural+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection.</a> J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).</li>
<li>Nichols, N. L., Satriotomo, I., Harrigan, D. J., Mitchell, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+intermittent+hypoxia+induced+phrenic+long-term+facilitation+despite+increased+sod1+expression+in+a+rat+model+of+als%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Acute intermittent hypoxia induced phrenic long-term facilitation despite increased sod1 expression in a rat model of als.</a> Exp Neurol. 273, 138-150 (2015).</li>
<li>Nichols, N. L., Craig, T. A., Tanner, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phrenic+long-term+facilitation+following+intrapleural+ctb-sap-induced+respiratory+motor+neuron+death%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Phrenic long-term facilitation following intrapleural ctb-sap-induced respiratory motor neuron death.</a> Respir Physiol Neurobiol. 256, 43-49 (2018).</li>
<li>Kiernan, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).</li>
<li>Boërio, D., Kalmar, B., Greensmith, L., Bostock, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitability+properties+of+mouse+motor+axons+in+the+mutant+sod1g93a+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Excitability properties of mouse motor axons in the mutant sod1g93a model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Muscle Nerve. 41 (6), 774-784 (2010).</li>
<li>Shibuya, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+cortical+function+determines+prognosis+in+sporadic+als%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Motor cortical function determines prognosis in sporadic als.</a> Neurology. 87 (5), 513-520 (2016).</li>
<li>Lewelt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compound+muscle+action+potential+and+motor+function+in+children+with+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Compound muscle action potential and motor function in children with spinal muscular atrophy.</a> Muscle Nerve. 42 (5), 703-708 (2010).</li>
<li>Mcgovern, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smn+expression+is+required+in+motor+neurons+to+rescue+electrophysiological+deficits+in+the+smn%CE%B47+mouse+model+of+sma%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Smn expression is required in motor neurons to rescue electrophysiological deficits in the smnδ7 mouse model of sma.</a> Hum Mol Genet. 24 (19), 5524-5541 (2015).</li>
<li>Arnold, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+biomarkers+in+spinal+muscular+atrophy%3A+Preclinical+proof+of+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Clin+Transl+Neurol%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological biomarkers in spinal muscular atrophy: Preclinical proof of concept.</a> Ann Clin Transl Neurol. 1 (1), 34-44 (2014).</li>
<li>Harrigan, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+rat+forelimb+and+hindlimb+motor+unit+connectivity+as+objective+and+robust+biomarkers+of+spinal+motor+neuron+function%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Assessing rat forelimb and hindlimb motor unit connectivity as objective and robust biomarkers of spinal motor neuron function.</a> Sci Rep. 9 (1), 16699(2019).</li>
<li>Arnold, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+motor+unit+number+estimation+%28mune%29+measuring+compound+muscle+action+potential+%28cmap%29+in+mouse+hindlimb+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological motor unit number estimation (mune) measuring compound muscle action potential (cmap) in mouse hindlimb muscles.</a> J. Vis. Exp: JoVE. (103), e52899(2015).</li>
<li>Martin, M., Li, K., Wright, M. C., Lepore, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+morphological+assessment+of+diaphragm+innervation+by+phrenic+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Functional and morphological assessment of diaphragm innervation by phrenic motor neurons.</a> J. Vis. Exp: JoVE. (99), e52605(2015).</li>
<li>Mccomas, A., Fawcett, P. R. W., Campbell, M., Sica, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+estimation+of+the+number+of+motor+units+within+a+human+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological estimation of the number of motor units within a human muscle.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 34 (2), 121-131 (1971).</li>
<li>Felice, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+longitudinal+study+comparing+thenar+motor+unit+number+estimates+to+other+quantitative+tests+in+patients+with+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">A longitudinal study comparing thenar motor unit number estimates to other quantitative tests in patients with amyotrophic lateral sclerosis.</a> Muscle Nerve. 20 (2), 179-185 (1997).</li>
<li>Vucic, S., Rutkove, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurophysiological+biomarkers+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neurophysiological biomarkers in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Curr Opin Neurol. 31 (5), 640-647 (2018).</li>
<li>Carleton, S., Brown, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+motor+unit+populations+in+motor+neurone+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Changes in motor unit populations in motor neurone disease.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 42 (1), 42-51 (1979).</li>
<li>Yuen, E. C., Olney, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+study+of+fiber+density+and+motor+unit+number+estimate+in+patients+with+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Longitudinal study of fiber density and motor unit number estimate in patients with amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neurology. 49 (2), 573-578 (1997).</li>
<li>Gooch, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+unit+number+estimation%3A+A+technology+and+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Motor unit number estimation: A technology and literature review.</a> Muscle Nerve. 50 (6), 884-893 (2014).</li>
<li>Henderson, R. D., Ridall, P. G., Hutchinson, N. M., Pettitt, A. N., Mccombe, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bayesian+statistical+mune+method%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Bayesian statistical mune method.</a> Muscle Nerve. 36 (2), 206-213 (2007).</li>
<li>Shefner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipoint+incremental+motor+unit+number+estimation+as+an+outcome+measure+in+als%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Multipoint incremental motor unit number estimation as an outcome measure in als.</a> Neurology. 77 (3), 235-241 (2011).</li>
<li>Stein, R. B., Yang, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+estimating+the+number+of+motor+units+in+human+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Methods for estimating the number of motor units in human muscles.</a> Ann Neurol. 28 (4), 487-495 (1990).</li>
<li>Shefner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+unit+number+estimation+in+human+neurological+diseases+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Motor unit number estimation in human neurological diseases and animal models.</a> Clin Neurophysiol. 112 (6), 955-964 (2001).</li>
<li>Ahad, M., Rutkove, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+muscle+electrical+impedance+data+and+standard+neurophysiologic+parameters+after+experimental+neurogenic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Meas%22%5BJournal%5D)">Correlation between muscle electrical impedance data and standard neurophysiologic parameters after experimental neurogenic injury.</a> Physiol Meas. 31 (11), 1437(2010).</li>
<li>Kasselman, L. J., Shefner, J. M., Rutkove, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+unit+number+estimation+in+the+rat+tail+using+a+modified+multipoint+stimulation+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Motor unit number estimation in the rat tail using a modified multipoint stimulation technique.</a> Muscle Nerve. 40 (1), 115-121 (2009).</li>
<li>Ngo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+bayesian+motor+unit+number+estimation+and+histological+measurements+of+motor+neurons+in+wild-type+and+sod1g93a+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">The relationship between bayesian motor unit number estimation and histological measurements of motor neurons in wild-type and sod1g93a mice.</a> Clin Neurophysiol. 123 (10), 2080-2091 (2012).</li>
<li>Feasby, T., Brown, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+of+motor+unit+size+in+the+human+extensor+digitorum+brevis+and+thenar+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Variation of motor unit size in the human extensor digitorum brevis and thenar muscles.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 37 (8), 916-926 (1974).</li>
<li>Nichols, N. L., Vinit, S., Bauernschmidt, L., Mitchell, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+function+after+selective+respiratory+motor+neuron+death+from+intrapleural+ctb-saporin+injections%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Respiratory function after selective respiratory motor neuron death from intrapleural ctb-saporin injections.</a> Exp Neurol. 267, 18-29 (2015).</li>
<li>Nichols, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventilatory+control+in+als%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Ventilatory control in als.</a> Respir Physiol Neurobiol. 189 (2), 429-437 (2013).</li>
<li>Cifra, A., Nani, F., Nistri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+motoneurons+and+pathological+conditions%3A+Lessons+from+hypoglossal+motoneurons+challenged+by+excitotoxic+or+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Respiratory motoneurons and pathological conditions: Lessons from hypoglossal motoneurons challenged by excitotoxic or oxidative stress.</a> Respir Physiol Neurobiol. 179 (1), 89-96 (2011).</li>
<li>Kobayashi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fals+with+gly72ser+mutation+in+sod1+gene%3A+Report+of+a+family+including+the+first+autopsy+case%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Fals with gly72ser mutation in sod1 gene: Report of a family including the first autopsy case.</a> J Neurol Sci. 300 (1), 9-13 (2011).</li>
<li>Su, M., Wakabayashi, K., Tanno, Y., Inuzuka, T., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autopsy+case+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+with+concomitant+alzheimer%27s+and+incidental+lewy+body+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22No+to+shinkei%3D+Brain+and+nerve%22%5BJournal%5D)">An autopsy case of amyotrophic lateral sclerosis with concomitant alzheimer's and incidental lewy body diseases.</a> No to shinkei= Brain and nerve. 48 (10), 931-936 (1996).</li>
<li>Lladó, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degeneration+of+respiratory+motor+neurons+in+the+sod1+g93a+transgenic+rat+model+of+als%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Degeneration of respiratory motor neurons in the sod1 g93a transgenic rat model of als.</a> Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).</li>
<li>Borkowski, L. F., Smith, C. L., Keilholz, A. N., Nichols, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+receptor+utilization+is+necessary+for+phrenic+long-term+facilitation+over+the+course+of+motor+neuron+loss+following+ctb-sap+intrapleural+injections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Divergent receptor utilization is necessary for phrenic long-term facilitation over the course of motor neuron loss following ctb-sap intrapleural injections.</a> J Neurophysiol. 126 (3), 709-722 (2021).</li>
<li>Nicolopoulos-Stournaras, S., Iles, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+columns+in+the+lumbar+spinal+cord+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Motor neuron columns in the lumbar spinal cord of the rat.</a> J Comp Neurol. 217 (1), 75-85 (1983).</li>
<li>Tosolini, A. P., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+motor+end+plates+for+delivery+of+adenoviruses%3A+An+approach+to+maximize+uptake+and+transduction+of+spinal+cord+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Targeting motor end plates for delivery of adenoviruses: An approach to maximize uptake and transduction of spinal cord motor neurons.</a> Sci Rep. 6 (1), 33058(2016).</li>
<li>Mchanwell, S., Biscoe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+localization+of+motoneurons+supplying+the+hindlimb+muscles+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Phil.+Trans.+R%22%5BJournal%5D)">The localization of motoneurons supplying the hindlimb muscles of the mouse.</a> Phil. Trans. R. , 477-508 (1981).</li>
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<li>Courtine, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+experiments+in+nonhuman+primates+expedite+the+translation+of+treatments+for+spinal+cord+injury+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Can experiments in nonhuman primates expedite the translation of treatments for spinal cord injury in humans.</a> Nat Med. 13 (5), 561-566 (2007).</li>
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</ol>

WDA 已从 NMD Pharma 和 Avidity Biosciences 获得研究经费，并从 NMD Pharma、Avidity Biosciences、Dyne Therapeutics、Novartis、Design Therapeutics、Catalyst Pharmaceuticals 和 Novartis 获得咨询费。

在运动神经元（MN）变性疾病（如肌萎缩侧索硬化症，ALS）中，评估参与呼吸功能的运动单位（MUs）至关重要28。尽管ALS患者中存在呼吸运动神经元变性现象，但运动神经元死亡的具体起始时间及进展过程仍尚未完全阐明29,30,31。鉴于这一问题的重要性，研究人员已采用多种模型来模拟神经退行性疾病动物模型中的呼吸功能障碍，包括基于遗传因素的模型（如SOD12,32）和非遗传因素的模型（如胸膜内注射CTB-SAP3,27,33）。因此，识别可用于诊断、监测及评估潜在治疗效果的生物标志物，将有助于这些模型的研究。此外，生物标志物还可促进临床前研究成果向临床应用的转化。
为了定量评估啮齿类动物变性模型中支配的运动神经元（MNs）数量，已采用多种标记技术，包括逆行示踪剂和腺病毒25,34,35,36。既往研究利用免疫组织化学方法标记颈段脊髓前角的膈神经运动神经元2,3,33。尽管这些标记技术在运动神经元评估中具有价值，但在评估运动单位（MUs）功能方面存在局限性，且不适用于纵向研究37。客观的电生理评估对于实现跨物种转化至关重要，特别是考虑到人类与啮齿类动物在运动系统功能和解剖特征方面存在显著结构差异38,39。神经生物学差异的存在为将啮齿类模型的研究结果转化为临床应用带来了挑战。运动单位数目估计（MUNE）作为一种客观的电生理测量方法，可克服上述障碍，通过评估功能性运动单位连接性，作为运动神经元变性模型实验中的生物标志物3,40。
CMAP、SMUP 和 MUNE 常用于研究以及评估神经肌肉疾病患者的病情9,10,11。这些潜在的生物标志物具有微创性，能够对同一受试个体进行长期的功能评估。重要的是，尽管这些指标并不直接反映皮层运动神经元（MN）对运动单位（MU）的激活或募集情况，但它们确实提供了关于运动神经元完整性的临床相关估计，以及其功能对应物——运动单位的评估。运动神经元变性疾病的大鼠模型对于理解人类疾病的生理病理机制以及推进有效治疗的临床前研究至关重要。开发可在不同物种间转化的结果评估指标和生物标志物，有助于简化并加速将有前景的临床前研究成果转化为临床试验11。鉴于这些测量方法相对复杂，我们已将这些技术从大鼠肢体肌肉改良并优化应用于膈肌。本研究以可视化形式呈现该技术转化过程，以促进其在大鼠研究中的更广泛应用与实施。
根据我们的经验，临床电生理诊断系统非常适合本研究中所述的实验。这种适用性源于检查者与电生理诊断系统之间界面的人体工程学设计得到改善，便于操作控制。在我们的实验室团队中，我们使用一种双通道系统，配备两个非切换式放大器通道。这些通道配有24位模数转换器，每通道采样速率为48 kHz。硬件增益可在每格10 nV至100 mV范围内调节。我们采用的低频滤波器范围为0.2 Hz至5 kHz，高频滤波器设置范围为30 Hz至10 kHz。此外，我们使用了恒流刺激器，其刺激强度可在0至100 mA范围内调节，刺激持续时间可在0.02至1 ms之间调节。大多数临床系统均具备类似的特性，适用于记录复合肌肉动作电位（CMAP）、单运动单位电位（SMUP）以及运动单位计数估计（MUNE）反应。这些系统可相应调整，以确保准确记录所需数据。例如，CMAP幅度可采用基线到峰顶（base-to-peak）或峰顶到峰顶（peak-to-peak）的方式进行评估。临床电生理诊断系统通常默认采用基线到峰顶法，即从等电位基线测量至初始负向波峰。
从膈肌获取CMAP、SMUP和MUNE反应的过程涉及多个关键步骤。稳定且准确的电极放置，以及适当的电极深度，对于可靠测量波幅并减少记录过程中的背景噪声至关重要。刺激电极放置不当可能导致非预期后果。刺激电极放置位置过于靠后可能因臂丛兴奋而引起前肢肌肉过度收缩，而放置位置高于C4水平则可能使膈神经刺激更加困难。电极插入过深存在损伤颈动脉或激活迷走神经的风险，可能引发心脏传导问题。记录电极若置于最后一根肋骨之上或之下，可能分别记录到肋间肌或腹直肌的刺激反应。为避免记录到来自其他肌肉的信号，需注意膈肌CMAP潜伏期的负向波峰通常为1.5–3.5 ms，其特征性波形如图2所示。我们的观察表明，与盘状电极相比，针状电极在膈肌肌肉的CMAP、SMUP和MUNE记录中具有更高的稳定性。这种增强的一致性可归因于膈肌的圆顶状结构及其邻近存在其他肌肉（如肋间肌和腹直肌）。此外，针状电极在位置调整上的灵活性是另一优势因素。关于电刺激强度，我们采用60至100 mA的范围刺激膈神经，该范围高于其他运动系统报道的刺激强度。这种差异源于膈神经在颈部的位置较深，而坐骨神经和臂丛在后肢和前肢中的位置相对表浅。
获取平均单运动单位动作电位（SMUP）比记录复合肌肉动作电位（CMAP）面临更大的技术挑战。由于SMUP的反应幅度较小，处于微伏级别而非毫伏级别，背景噪声的影响更为显著。为降低背景噪声，可考虑通过调整接地电极、阴极和阳极的位置来优化电极放置。此外，应确保实验装置周围尽量减少附近电子设备的干扰。尽管细胞内电生理实验中常使用法拉第笼，但本实验设置中并不需要。视觉识别单个SMUP反应是一项需要反复练习才能掌握的技术，以实现结果的一致性和可重复性。由于膈肌是一种动态肌肉，基线可能随着每一次通气周期而发生偏移。密切关注SMUP的上升支，并确保其与前一个SMUP对齐，是克服这一挑战的关键因素。此外，确保SMUP在最大CMAP的潜伏期内开始出现，对于获得准确的记录至关重要。
膈肌记录的另一个挑战在于该肌肉的不对称性，其左右厚度各不相同，且右侧受到肝脏所施加压力的影响41。为解决这一问题，我们分别对左侧和右侧半膈肌进行了电生理测量，随后分别计算了复合肌肉动作电位（CMAP）、单运动单位电位（SMUP）和运动单位数目估计（MUNE）反应的平均值。
由于复合肌肉动作电位（CMAP）反映的是特定肌肉中肌纤维集体去极化的结果，因此任何影响膈神经运动神经元至膈肌肌纤维的病理变化都可能导致CMAP波幅减小。因此，通过计算双侧半膈肌的平均CMAP，可对呼吸系统神经肌肉功能的整体状态进行良好评估。代偿性改变（如侧支 sprouting）可能在运动神经元或运动轴突丢失的情况下仍维持CMAP波幅不变11。记录单个递增反应可估算单个运动单位的平均输出（SMUP波幅），从而更详细地揭示呼吸系统运动单位的功能状态。因此，运动单位数目估计（MUNE）技术对于评估膈神经运动神经元或轴突对膈肌的支配至关重要。在运动神经元疾病治疗的临床前实验中应用这些生物标志物，有望提高向临床试验转化的成功率。

膈运动神经元（MNs）起源于C3至C6肌节水平，构成从中枢神经系统（CNS）到膈肌的最终通路1。膈运动单位（MUs）由单个脊髓运动神经元及其所支配的膈肌纤维组成，是呼吸神经肌肉系统的最小功能单位。通气功能依赖于膈肌的充分收缩，而这种收缩是通过膈运动单位池的协调激活实现的2,3。许多神经系统疾病（包括肌萎缩侧索硬化症（ALS））会导致严重的通气功能障碍，最终成为致死原因4。
有多种电生理方法可用于在活体中评估和监测运动单位（MU）池的完整性。in vivo条件下，复合肌肉动作电位（CMAP）反映了在周围神经刺激后，特定肌肉或肌群中所有肌纤维去极化的总和，且对多种神经肌肉疾病具有敏感性，包括肌萎缩侧索硬化症（ALS）5,6和脊髓性肌萎缩症（SMA）7,8,9。CMAP评估的一个局限性在于，侧支芽生可能导致即使在运动单位丢失的情况下，CMAP的波幅和面积仍得以维持10。为克服这一局限性，已对CMAP技术进行了改进，以同时评估运动单位的数量和大小11。此外，一项利用电生理系统对膈肌CMAP进行功能评估的in vivo研究提示，所述的膈肌CMAP记录技术也可能适用于运动单位数量的估算12。
运动单位数量估计的增量法（incremental motor unit number estimation, MUNE）最初由 McComas 等人在 20 世纪 70 年代初提出，用于检测人体的小指展肌13。该增量 MUNE 方法是对传统复合肌肉动作电位（CMAP）记录技术的一种改进，通过逐步增强刺激强度，记录呈量子化、全或无特性的亚最大增量，以反映单个运动单位的反应。将这些增量求和并取平均值，用于计算单个运动单位电位（SMUP）的大小估计值，再用该估计值除以 CMAP 振幅，从而估算出所检测肌肉的运动单位（MU）数量11。MUNE 在检测和监测运动单位丢失方面具有高度敏感性，能够在 CMAP 振幅或面积等指标出现可观测变化之前，识别出运动单位功能障碍14,15。在肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者中，MUNE 已被证实具有极高的敏感性，可作为疾病起始、进展和预后的显著生物标志物16,17。
已开发出多种MUNE的改良方法，并广泛用于评估神经退行性疾病、神经损伤以及自然衰老过程等状况下的运动单位（MU）功能18,19,20,21。自首次描述以来，已有多种改良方法被应用于人类研究和动物模型中，这些方法利用电生理反应或递增性力量（机械）测量22。MUNE可对运动神经元与肌肉之间的功能连接性进行无创性功能评估。在纵向研究中应用MUNE，有助于理解疾病或诱导表型的进展过程，并可在临床和临床前环境中评估治疗干预措施的保护性或再生性效果。尽管MUNE在人体大部分运动单位池中的测量可重复性和临床相关性已得到证实，但目前的研究工作主要集中于肢体肌肉以及啮齿类动物的肌肉10,23,24,25。
因此，本研究的目的是描述一种获取复合肌肉动作电位（CMAP）、单个运动单位电位（SMUP）以及膈神经运动单位计数（MUNE）的方法 体内 可用于纵向评估临床前啮齿类动物研究中运动单位数量估计值（MUNE）、运动单位大小（以SMUP表示）和复合肌肉动作电位（CMAP）的检测方法。此外，我们展示了代表性数据，揭示了在胸膜内给予膈神经运动神经元变性剂——霍乱毒素B片段与皂苷素偶联物（CTB-SAP）后，膈肌运动单位数量的减少。

<table><tbody><tr><td>2 mL 玻璃注射器</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>SOMNO-2ML</td><td></td></tr><tr><td>50 mL，型号 705 RN 注射器</td><td>Hamilton Company</td><td>7637-01</td><td>用于进行胸膜腔内注射</td></tr><tr><td>5008 - Formulab 饲料</td><td>LabDiet</td><td>0001325</td><td></td></tr><tr><td>可高压灭菌的 26 G 针头（26S RN 9.52 mm 40&amp;deg;）</td><td>Hamilton Company</td><td>7804-04</td><td>用于进行胸膜腔内注射</td></tr><tr><td>霍乱毒素 B 亚基（CTB）</td><td>MilliporeSigma</td><td>C9903</td><td>用于胸膜腔内注射以标记存活的运动神经元</td></tr><tr><td>与皂苷毒素偶联的霍乱毒素 B 亚基（CTB-SAP）</td><td>Advanced Targeting Systems</td><td>IT-14</td><td>用于胸膜腔内注射以诱导运动神经元死亡</td></tr><tr><td>可拆卸电缆</td><td>Technomed</td><td>202845-0000</td><td>用于连接记录电极与电诊断仪器</td></tr><tr><td>一次性 2&quot; x 2&quot; 带导线圆盘电极</td><td>Cadwell</td><td>302290-000</td><td>接地电极</td></tr><tr><td>一次性单极针电极 28 G</td><td>Technomed</td><td>202270-000</td><td>阴极和阳极刺激电极 - 记录电极</td></tr><tr><td>肌电图针电极电缆（放大/刺激切换盒）</td><td>Cadwell</td><td>190266-200</td><td>用于将单极电极连接至电诊断刺激器</td></tr><tr><td>带铁底座的帮手鳄鱼夹</td><td>Radio Shack</td><td>64-079</td><td>用于固定记录电极位置&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>异氟烷（250 mL 瓶装）</td><td>Piramal Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>monoject 弯头冲洗注射器</td><td>Covidien</td><td>81412012</td><td>用于涂抹电极凝胶</td></tr><tr><td>PhysioSuite 生理监测系统，配备 RightTemp 恒温加热装置</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>PS-RT</td><td>包含红外加热垫、直肠探头和垫温探头</td></tr><tr><td>Pro 修剪器宠物美容套装</td><td>Oster</td><td>078577-010-003</td><td>用于脱毛的剪毛器</td></tr><tr><td>皂苷毒素（SAP）</td><td>Advanced Targeting Systems</td><td>PR-01</td><td>用于胸膜腔内注射（单独注射时作为对照试剂）</td></tr><tr><td>Sierra Summit 肌电图系统</td><td>Cadwell Industries, Inc., Kennewick, WA</td><td></td><td>便携式电诊断系统</td></tr><tr><td>SomnoSuite 低流量数字麻醉系统</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>SOMNO</td><td>包含防溢、防蒸气瓶顶适配器；Y 型适配管；活性炭吸附过滤器</td></tr><tr><td>Sprague-Dawley 大鼠</td><td>Envigo colony 208a, Indianapolis, IN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>兽用石油基眼用软膏&amp;nbsp;</td><td>Puralube</td><td>26870</td><td>麻醉期间使用以防止角膜损伤</td></tr></tbody></table>

评估大鼠膈肌运动单位连接性结局指标作为膈神经运动神经元变性与代偿的定量生物标志物

Assessing Rat Diaphragm Motor Unit Connectivity Outcome Measures as Quantitative Biomarkers of Phrenic Motor Neuron Degeneration and Compensation

呼吸肌功能丧失是运动神经元损伤和神经退行性变的结果（例如，分别对应颈段脊髓损伤和肌萎缩侧索硬化症）。膈神经运动神经元是中枢神经系统与肌肉之间的最终连接环节，其相应的运动单位（由单个运动神经元支配的一组肌纤维）代表了神经肌肉呼吸系统的最小功能单位。复合肌肉动作电位（CMAP）、单个运动单位电位（SMUP）和运动单位数量估计（MUNE）是已建立的电生理方法，可用于在动物模型中随时间纵向评估运动单位的完整性，但这些方法主要应用于肢体肌肉。因此，本研究的目的是描述一种可在临床前啮齿类动物研究中纵向应用的方法，用于量化膈神经MUNE、运动单位大小（以SMUP表示）和CMAP，并进一步在运动神经元丢失模型中验证这些方法的应用价值。对于运动神经元损伤及相关疾病中的神经元损伤、退变与再生，若能获得敏感、客观且具有转化意义的生物标志物，将显著促进并加速从实验研究发现向临床试验的转化。

本报告中所述的CMAP、SMUP和MUNE技术可利用微创电极放置方法记录膈肌的神经肌肉功能（图1）。可通过幅值和面积参数来表征超最大CMAP的大小，从而对肌群输出进行整体评估（图2）。然而，在当前方法中，我们依赖幅值来量化CMAP和SMUP的大小。CMAP、SMUP和MUNE可用于在多种大鼠神经肌肉疾病模型中测量神经肌肉功能。为展示运动神经元变性背景下运动单位的丢失情况，实验组大鼠接受双侧胸膜内注射CTB-SAP（25 µg）以靶向膈神经运动神经元，并额外注射游离CTB（25 µg）；对照组大鼠则注射未结合的CTB（25 µg）和SAP（25 µg）1,27。
在图3中，比较了成年对照大鼠与成年大鼠（12周龄）胸膜内注射CTB-SAP后7天的结果。胸膜内注射CTB-SAP后，CTB-SAP组大鼠的功能性运动单位数量（MUNE）降至约60个，而对照组大鼠正常值为74个功能性运动单位。然而，CTB-SAP组大鼠的复合肌肉动作电位（CMAP）幅值（峰-峰值14.25 mV）与对照组（峰-峰值14.5 mV）相比变化极小，这可能是由于侧支芽生所致。在图4，双侧膈肌的CMAP、单运动单位电位（SMUP）和MUNE在基线/注射前（n = 14）、注射后7天（n = 14）、14天（n = 14）、21天（n = 6）以及28天（n = 14）分别记录并取平均值。在图4中，各组之间未发现基线差异。MUNE在时间因素上显示出显著变化（p &#60; 0.05），CTB-SAP处理因素（p &#60; 0.001）以及时间与CTB-SAP的交互作用（p &#60; 0.01），CTB-SAP组大鼠的MUNE减少了约40%。CTB-SAP组大鼠的平均SMUP在时间（p &#60; 0.05）和CTB-SAP处理（p &#60; 0.01）上均表现出显著变化，但无显著交互作用，SMUP幅值增加了约50–60%。CMAP未显示显著变化。
<img alt="图 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66568/66568fig01.jpg" /> 
图 1：电极放置位置。 （A）刺激阴极和（B）阳极经皮下插入颈部外侧前斜角肌与中斜角肌之间，两者相距约 1 cm。（C）“记录电极”（E1）和（D）“参考电极”（E2）置于锁骨中线最后一根肋骨下缘，沿剑突与最后一根肋软骨交角定位。此外，（E）一个一次性盘状电极置于尾部作为接地电极，以减少干扰信号。由 BioRender.com 制作。&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66568/66568fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66568/66568fig02.jpg" /> 
图 2：复合肌肉动作电位。 从左侧膈肌半侧记录的代表性 CMAP 反应示意图。CMAP 的峰-峰振幅由负峰电压至正峰电压确定。缩写：CMAP = 复合肌肉动作电位。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66568/66568fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66568/66568fig03.jpg" /> 
图3：来自对照组大鼠以及胸膜内注射 CTB-SAP 后 7 天的成年大鼠的两个代表性 CMAP 和 MUNE 记录。 (A) 对照组成年大鼠（12周龄）左侧膈神经复合肌肉动作电位（CMAP），峰-峰振幅为14.5 mV。屏幕灵敏度 = 1 mV/格，屏幕时间量程 = 1 ms/格。B10 次连续递增反应的总振幅为 1.940 mV，除以 10 得到平均 SMUP 大小（0.194 mV）。屏幕灵敏度 = 0.2 mV/格，扫描速度 = 1 ms/格。计算得 MUNE = 74（MUNE = CMAP / 平均 SMUP = 14.5 mV / 0.194 mV）C) 注射 CTB-SAP 后第七天的膈神经复合肌肉动作电位（CMAP），显示 CMAP 峰-峰振幅几乎无变化，为 14.25 mV。屏幕灵敏度 = 1 mV/格，扫描速度 = 1 ms/格。 (D) 10 次连续递增反应的总峰-峰振幅为 2.360 mV，除以 10 得到平均 SMUP 大小为 0.236 mV。屏幕灵敏度 = 0.2 mV/格，扫描速度 = 1 ms/格。因此，计算得到的 MUNE 为 60。缩略语：CMAP = 复合肌肉动作电位；MUNE = 运动单位数量估计；CTB-SAP = 霍乱毒素 B 片段与皂皮素的偶联物；SMUP = 单个运动单位电位。*图中所示为电刺激引起的伪迹；需要注意的是，由于电刺激的振幅与 CMAP 及递增反应的振幅之间存在显著差异，我们仅绘制了刺激信号的一部分。采用色盲友好配色以增强递增反应的可视化效果，提高可读性。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66568/66568fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66568/66568fig04.jpg" /> 
图 4：CTB-SAP 处理后 CMAP、SMUP 和 MUNE 的电生理评估。 各组间基线无显著差异（CTB-SAP 组和对照组均为 7 只 11 周龄雄性大鼠）。(A) CMAP 未显示显著变化。( B)&#160; CTB-SAP 大鼠的平均 SMUP 随时间变化显著（p &#60; 0.05），且与 CTB-SAP 处理相关（p &#60; 0.01），无显著交互作用，表明 SMUP 振幅增加了 50–60%。(C) CTB-SAP 注射后 7 天，MUNE 平均值显著下降 27.07%，从 102.58 ± 20.54 降至 72.43 ± 15.59 个估计的功能性运动单位（均值 ± 标准差）。该下降持续存在，在第 28 天进一步下降 11.75%（MUNE：60.64 ± 11.33，p &#60; 0.01）。基线以及注射后 7、14 和 28 天的所有测量均来自 14 只大鼠，其中 n = 7 只注射了偶联的 CTB-SAP，n = 7 只注射了未偶联的 CTB 和 SAP 作为对照组。第 21 天使用了 6 只大鼠。CMAP、SMUP 和 MUNE 数据以均值表示，采用双因素方差分析进行比较。星号表示不同时间点的差异：*p &#60; 0.05，**p &#60; 0.01。缩略语：CMAP = 复合肌肉动作电位；MUNE = 运动单位数量估计；CTB-SAP = 霍乱毒素 B 片段与皂苷素偶联物；SMUP = 单个运动单位电位。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66568/66568fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本研究介绍了一种用于估算运动单元数量和大小的体内方法，以定量评估大鼠膈肌运动单元的连接情况。文中详细描述了这些技术的逐步操作流程。

呼吸肌功能丧失是运动神经元损伤和神经退行性变的后果（例如，颈段脊髓损伤和肌萎缩侧索硬化症...）

我们致力于研究在健康、衰老和疾病背景下，神经肌肉系统的正常与适应不良反应。具体而言，我们旨在探讨呼吸运动系统如何通过侧支 sprouting（collateral sprouting）等代偿机制应对运动神经元的丢失。目前，已有多种标记技术被用于量化啮齿类动物变性模型中支配神经支配的运动神经元数量，这些技术包括逆行示踪剂、腺病毒以及免疫组织化学方法。尽管标记技术在运动神经元评估中具有重要价值，但其在评估运动单位功能方面存在局限性，且不适用于纵向研究。MuNI技术是一种用于临床前啮齿类动物研究的非侵入性方法，可进行纵向重复使用，以定量分析膈神经运动单位。实施MuNI方案有望显著促进并加速实验研究成果向临床测试的转化，特别是在非侵入性、纵向评估膈神经与膈肌的神经肌肉功能障碍方面。我们多元化的实验室团队致力于研究健康状态及神经退行性疾病临床前模型中的神经肌肉功能。我们力求运用转化医学技术，深入探究可塑性的潜在机制是否能够被利用并加以调整，以维持呼吸功能，从而改善神经退行性疾病患者的生活质量。首先，将已麻醉并准备好的大鼠摆放在合适位置，用于记录复合肌肉动作电位。将有源针电极置于锁骨中线最后一根肋骨下缘皮下。然后将参考针电极置于剑突与最后一节胸肋软骨交角处皮下。接下来，在颈动脉鞘处使用一对28号单极针电极刺激膈神经。将电极置于颈侧皮下，位于前部与中部斜方肌之间，间距约为1厘米。确认刺激针的位置处于第四颈椎水平以下。然后将一次性表面电极置于尾部作为接地电极。首先，将麻醉后的大鼠进行准备并摆放到电生理实验所需的位置。施加单相阴极方波脉冲以刺激膈神经，记录复合肌肉动作电位（CMAP）反应。逐步增加刺激强度，直至反应幅度不再增加为止。然后将刺激强度提高至达到最大反应所需强度的约120%，以确保超强刺激，并记录一次额外的反应。测量并记录复合肌肉动作电位（CMAP）的峰-峰振幅，单位为毫伏。以0.1毫秒的持续时间、1赫兹的频率施加亚最大刺激。以0.03毫安为增幅，逐步增加刺激强度，以引发渐进性反应，直至达到最小的“全或无”反应。然后，使用2至10毫安范围内的刺激强度获取初始反应。保存第一次渐进反应后，继续以0.03毫安为增幅，逐步提高刺激强度，获取更多递增的反应数据。确保递增反应的初始负向波峰在时间上与最大复合肌肉动作电位（CMAP）反应的负向波峰对齐。由于膈肌参与呼吸运动，需检查每次递增反应的稳定性以及是否存在波形离散，以确认三次重复反应之间的一致性。实时观察递增反应，并将其与先前记录的波形叠加，以便进行直观区分。然后确认每次递增反应的波幅至少为25微伏。记录10次递增反应后，验证每次递增的波幅不超过最终反应总波幅的三分之一。为估算SMUP的平均波幅，取10次递增值的平均值。接下来，将最大CMAP波幅除以平均SMUP波幅，以确定运动单位数目估计值（MUNE）。在成年大鼠胸膜内注射CTB-SAP后7天，MUNE下降至60个功能性运动单位，而对照组大鼠为74个。CMAP波幅相对保持稳定，提示侧支 sprouting 可能是一种代偿机制。注射后28天内测量了膈肌的复合肌肉动作电位（CMAP）、单运动单位电位（SMUP）和运动单位计数（MUNE）。CMAP未显示明显变化。CTB-SAP大鼠的SMUP平均增加了约50%至60%。这些变化随时间具有显著性，并归因于CTB-SAP的作用。CTB-SAP 大鼠的 MUNE 减少了约 40%，表明时间和 CTB-SAP 处理具有显著影响。

assessing-rat-diaphragm-motor-unit-connectivity-outcome-measures-as

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

评估大鼠膈肌运动单元连接结果测量作为膈运动神经元变性和代偿的定量生物标志物

本视频介绍了通过刺激膈神经在大鼠膈肌纤维中记录复合肌肉动作电位（CMAPs）的方法。对膈神经施加高强度电脉冲刺激，可在膈肌纤维中引发动作电位，并通过获取反应曲线进行观察。...

通过刺激大鼠膈神经测量复合肌肉动作电位

复合肌肉动作电位记录可定量评估膈肌的膈神经运动神经元功能支配情况。全层膈肌免疫组织化学染色可用于评估单个神经肌肉接头处的形态学支配状况。本方案旨在展示这两种强大方法如何应用于多种脊髓疾病啮齿类动物模型中。...

膈神经运动神经元对膈肌支配的功能与形态学评估

呼吸系统并发症是颈段脊髓损伤（cSCI）患者死亡的首要原因。cSCI的动物模型对于机制评估和临床前研究至关重要。本文介绍了一种可重复的方法，用于评估大鼠单侧C2脊髓半切（C2SH）后膈肌（DIAm）功能活动的恢复情况。...

评估大鼠单侧颈段脊髓半切术后呼吸性膈肌功能的恢复

侧脑室壁包含成年哺乳动物大脑中最大的生发区域。传统上，对该区域神经发生的研究依赖于经典的组织学切片技术。本文我们介绍一种替代方法——全脑组织铺片技术，该方法可对这一生发区域提供全面的、表面观的视野。...

脑室下区的表面观：整体染色与室管膜液流

幼年斑马鱼是首个能够同时对脊髓运动神经元及其支配的骨骼肌进行膜片钳记录的脊椎动物模型系统。本视频展示了用于识别节段性CaP运动神经元及靶向肌细胞的显微技术，以及对这两类细胞进行记录的方法学。...

斑马鱼中运动神经元与靶向骨骼肌的配对膜片钳记录

培养的肌细胞作为模拟神经支配肌肉的模型存在不足 体内一个功能性的运动单位可以被复制 体外...

培养皿中的功能性运动单位：脊髓外植体与肌细胞的共培养

在多种情况下，神经肌肉接头（NMJ）会发生改变，有时可能导致突触功能障碍。本报告描述了基于荧光显微镜的方法，用于量化此类结构变化。...

神经肌肉接头：利用共聚焦荧光显微镜测量突触大小、碎片化程度及突触蛋白密度的变化

细胞内细胞器的形态、大小和位置在进化上是保守的，并且似乎直接影响其功能。了解这些过程背后的分子机制已成为现代生物学的重要目标。本文展示了如何通过应用定量技术来促进这些研究。...

为何定量至关重要：在表型水平上的特征描述 果蝇 幼虫神经肌肉接头

本文介绍一种简单且易于实现的方法，用于损伤黑腹果蝇（Drosophila）幼虫的节段神经，以在三龄幼虫的神经肌肉接头（NMJ）处观察并定量分析运动神经元的神经退行性变化。...

一种简单的神经元机械损伤方法用于研究 Drosophila 运动神经元变性

本文介绍了一种在经胸膜腔递送荧光标记的霍乱毒素B亚基后，鉴定小鼠膈神经运动神经元的实验方案。文中比较了两种胸膜腔注射技术：经膈肌法与经胸法。...

小鼠膈肌运动神经元的逆行神经解剖示踪

了解大鼠膈肌运动单元连接评估方法，使用MuNI技术量化膈运动神经元数量与大小。该技术可非侵入性纵向评估神经肌肉功能，为研究呼吸运动系统代偿机制提供重要工具。

评估大鼠膈肌运动单位连接性结局指标作为膈神经运动神经元变性与代偿的定量生物标志物

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