Name: 加强鸡胃肠道厌氧菌培养的策略 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 36 s
Description: 了解从鸡肠道中分离和培养厌氧菌的方法，以研究微生物网络与宿主的相互作用。该方案有助于恢复多种细菌种类，并揭示肌醇代谢相关的代谢途径。

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作者感谢雷霍沃特-霍亨海姆合作项目以及德国研究基金会（DFG）SE 2059/7-2项目的支持。本项目是研究单元P-FOWL（FOR 2601）的一部分。

该实验方案分为四个部分：取样、细菌分离、鉴定以及所获得微生物的保藏。动物使用许可已由德国图宾根区政府伦理委员会批准，批准编号为 HOH50/17 TE 和 HOH67-21TE。
1. 获取用于培养厌氧菌的样本
<ol>
	<li>动物的饲养与管理
	<ol>
		<li>维持动物在 随意摄取 商品化玉米基饲料（Legehennen/Junghennenfutter；参见 材料表）并饲养于霍恩海姆大学试验站。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转运溶液的制备
	<ol>
		<li>在采样前1至2天，准备含有1.00 g/L硫代乙醇酸钠、0.10 g/L二水合氯化钙（CaCl₂）、0.10 g/L氯化铁（FeCl₃）、0.10 g/L氯化镁（MgCl₂）、0.10 g/L氯化钾（KCl）、0.10 g/L氯化锰（MnCl₂）、0.10 g/L硫酸镁（MgSO₄）、0.10 g/L磷酸二氢铵（NH₄H₂PO₄）、0.10 g/L磷酸氢二铵（(NH₄)₂HPO₄）、0.10 g/L硫酸亚铁（FeSO₄）、0.10 g/L柠檬酸铁（FeC₆H₅O₇）、0.10 g/L L-半胱氨酸、0.10 g/L酵母提取物、0.10 g/L蛋白胨、0.10 g/L葡萄糖、0.10 g/L抗坏血酸、0.10 g/L半胱氨酸、0.10 g/L谷胱甘肽、0.10 g/L还原型谷胱甘肽、0.10 g/L氧化型谷胱甘肽、0.10 g/L维生素C、0.10 g/L维生素B₁、0.10 g/L维生素B₂、0.10 g/L维生素B₆、0.10 g/L维生素B₁₂、0.10 g/L叶酸、0.10 g/L烟酰胺、0.10 g/L泛酸钙、0.10 g/L生物素、0.10 g/L胆碱、0.10 g/L肌醇、0.10 g/L对氨基苯甲酸、0.10 g/L硫辛酸、0.10 g/L核黄素、0.10 g/L腺苷、0.10 g/L鸟苷、0.10 g/L胞苷、0.10 g/L尿苷、0.10 g/L脱氧腺苷、0.10 g/L脱氧鸟苷、0.10 g/L脱氧胞苷、0.10 g/L胸苷的转运溶液。2.2H2O）和0.5%的半胱氨酸21 0.1%刃天青钠溶液。</li>
		<li>将培养基的 pH 值在 25 °C 下调节至 6.0 ± 0.2，并在 15 psi 下于 121 °C 灭菌 15 分钟&#160;psi 压力</li>
		<li>待培养基冷却至约 50 °C 后，将培养基瓶的瓶盖替换为带有孔洞和橡胶塞的无菌螺旋盖。在橡胶塞的不同位置插入两根无菌注射器针头，并在其中一根针头上连接一个疏水性注射器滤器（0.22 µm）。 
		注意：更换瓶盖、插入针头和滤器应在层流洁净台（LAF）内进行。</li>
		<li>连接100%氮气（N2）管连接至注射器滤器，并用 N₂ 鼓泡2 在1 psi压力下向瓶中通入气体10分钟。</li>
		<li>随后，将培养基瓶和无菌亨盖特管转移至厌氧工作站内，在无菌条件下将转运培养基转移至亨盖特管中。完全充满亨盖特管至管口，确保管内无任何空气残留。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>屠宰与样品采集
	<ol>
		<li>在屠宰过程中，全程使用手套、口罩、塑料实验围裙和无菌外科器械，保持无菌条件以避免污染。此外，使用乙醇和擦拭纸对工作台面进行适当消毒，以维持无菌环境。</li>
		<li>在实验站中，使用由35% N2，35% CO2，和 30% O₂2 立即处死并断头。 
		注意：麻醉和处死操作应由熟悉动物福利和科学操作的实验动物技术人员进行。这可确保处死过程符合伦理标准、法律法规和安全指南。</li>
		<li>在开始解剖胃肠道（GIT）部位之前，使用无菌凯利止血钳（亦称凯利钳）固定所需的肠段，即嗉囊、回肠和空肠， 图1). 
		注意：动物解剖应由兽医或熟悉鸡解剖结构的经过良好培训的人员进行。</li>
		<li>将每个独立的样品部分转移至装有转运培养基的单独亨盖特管中，并正确盖紧管盖。如有需要，可向管中添加额外的转运培养基，以置换残留的空气。 
		注意：切片的转移是一个关键步骤，必须尽量减少任何延迟或切片暴露在空气中的时间，以避免长时间接触氧气。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样本运输
	<ol>
		<li>小心搬运Hungate管，将其放入泡沫塑料箱内，以防破损。若外界温度低于15 °C，应使用保温袋维持样品温度。确保运输时间不超过4小时。</li>
		<li>将试管小心转移至厌氧工作站内，以进行后续操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 厌氧菌的分离
<ol>
	<li>培养基制备 
	注意：上述方法在培养基制备过程中涉及多种注意事项。 表1 展示了用于微生物多样性分离的溶液分配示例。
	<ol>
		<li>将待使用的培养基配方成分分为四组溶液：碳源、氮源、琼脂和矿物源。对于脑心浸液（BHI）等富集培养基，分离并不总是可行（参见培养基2示例） 表1）。在此类情况下，务必分别制备并高压灭菌琼脂或其他溶液。</li>
		<li>在1/4中配制碳水化合物溶液th 所需培养基最终体积的，例如在250 mL中配制总体积为1 L的培养基。以培养基1为例 表1，将2 g葡萄糖和0.5 g淀粉溶于250 mL蒸馏水中。</li>
		<li>在1/4中制备蛋白质溶液th 所需培养基最终体积的，例如在250 mL中配制总体积为1 L的培养基。参照培养基1的示例 表1，将10 g蛋白胨溶解于250 mL蒸馏水中。</li>
		<li>在培养基最终体积的45%至48%范围内配制琼脂溶液，例如，若培养基总体积为1 L，则使用450至480 mL配制。以培养基1为例 表1，将15 g琼脂溶解于450至480 mL蒸馏水中。</li>
		<li>当培养基终体积为1 L时，在左侧的20至50 mL培养基体积中配制矿物溶液。参照培养基1的示例进行操作。 表1，加入0.5 g K2HPO4 在20至50 mL蒸馏水中。</li>
		<li>将蛋白质溶液、琼脂溶液和矿物溶液在121 °C、21 psi压力下高压灭菌15分钟。将碳水化合物溶液在110 °C、5 psi压力下高压灭菌30分钟。</li>
		<li>待所有溶液灭菌后，将其冷却至 50 °C，并在无菌条件下转移至带有孔塞和橡胶塞的已灭菌玻璃瓶中混合。随后，按步骤 1.2.3 和 1.2.4 操作。 
		注意：溶液的混合应在层流罩（LAF）内进行。</li>
		<li>待培养基混合并脱气后，在厌氧工作站内倒入无菌培养皿或试管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>厌氧细菌的分离 
	注意：以下方法介绍了一种用于培养鸡消化道中多种厌氧细菌的分离策略。
	<ol>
		<li>将样品转移至厌氧工作站，其中瓶装气体混合物由80% N2 （质量等级 5.0），15% CO2 （质量等级 3.0）和 5% H2 （质量等级5.0）由商业供应商提供（参见 材料表).</li>
		<li>在厌氧工作站内，使用经高压灭菌的镊子将菌片从亨盖特管转移至无菌培养皿中。</li>
		<li>使用无菌剪刀小心剪开肠段，再用无菌刮勺从肠段中取出约1 g的食糜内容物。 
		注意：取1 g消化物内容后，刮取并转移剩余消化物至相应的运输培养基管中，用于靶向分离。</li>
		<li>使用无菌生理盐水（0.85% NaCl）进行10倍系列稀释。</li>
		<li>将10−4至10−7稀释度的样品各0.1 mL加入无菌且标记正确的培养皿平板中，用无菌Drigalski涂布棒涂布均匀。</li>
		<li>在厌氧工作站内于 39 °C 培养平板 24–48 小时。 
		注意：在培养箱中孵育时，需先将培养皿放入密闭盒中，再将其从厌氧工作站中取出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>靶向分离特定细菌类群 
	注意：以下方法描述了一种用于分离可能能够同化MI的厌氧细菌的策略。
	<ol>
		<li>富集培养基、最小琼脂培养基和最小液体培养基的配制，请按照指定的成分进行 表2 和 表3，遵循步骤2.1中所述指南。在高压灭菌后，向最低限度琼脂培养基和最低限度肉汤培养基中加入0.2 mL/L的过滤除菌维生素混合物（成分如前所述）。</li>
		<li>使用涡旋混合器将初始样品匀浆10–15秒。随后，用移液器将匀浆后的样品以5%的比例转移至含有增菌培养基的试管中（例如，若增菌培养基体积为10 mL，则接种0.5 mL匀浆样品）。将 freshly 接种的样品置于厌氧工作站内，于39 °C培养24小时。</li>
		<li>孵育后，使用涡旋振荡器振荡10–15秒或通过移液操作充分混匀富集管中的液体。随后，将混匀的样品以5%的比例转接至无菌最低限度肉汤培养基中，于39 °C孵育24小时。</li>
		<li>将样品用无菌生理盐水溶液（即0.85% NaCl）进行连续稀释，起始稀释度为1:10，依次稀释至1:1000。每次稀释后，在室温下使用涡旋振荡器充分混匀10–15秒，或通过移液操作彻底混匀。</li>
		<li>在无菌且厌氧条件下，将1 mL稀释样品转移至培养皿中。加入约15–20 mL熔化的最低限度琼脂培养基，轻轻水平旋转混匀。 
		注意：琼脂温度应约为 45 °C，以确保无结块产生，并防止样品因高温而失活。培养基倾注应在厌氧条件下进行。</li>
		<li>琼脂凝固后，将培养皿倒置于厌氧工作站或培养箱中，于39 °C培养24小时。培养24小时后，细菌菌落呈现为分散的微小点状，嵌于培养基中。 
		注意：将培养皿放入培养箱中孵育时，需在将其移出厌氧工作站前，先转移至密闭容器中。</li>
		<li>使用无菌接种环，小心挑取单个细菌菌落，并将其转移至不同的最小培养基肉汤试管中。</li>
		<li>将菌落转移至单独的试管后，在39 °C下厌氧培养接种的试管24 h。培养结束后，培养基中浊度增加表明细菌生长。 
		注意：每次将培养基瓶转移至厌氧工作站内之前，均应按照步骤2.1.7中所述进行脱气处理。&#160;步骤 2-8 应在厌氧工作站内进行。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 厌氧菌的鉴定
<ol>
	<li>从培养时间为24至48小时的菌种中提取DNA，采用酶解裂解法进行操作22.</li>
	<li>将培养物在 3000 x g 4 °C下离心10分钟，用移液器弃去上清液。</li>
	<li>用2 mL磷酸盐缓冲液（PBS）重悬沉淀，洗涤2次。使用涡旋混合器将样品匀浆10–15秒。以3000 × g重复离心步骤 g 4 °C下离心10分钟，小心弃去上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于0.2 mL pH 7.4的PBS中，加入1 U溶菌酶和1 U重组溶菌素，在50 °C孵育30分钟，随后加入5 µL蛋白酶K，在56 °C继续孵育30分钟。</li>
	<li>向每个离心管中加入 4 µL 的 RNAseA，室温孵育 10 分钟。在 21168 x g 条件下离心离心管 g 孵育1分钟。回收上清液，并使用磁珠进行纯化。</li>
	<li>根据双链DNA定量试剂盒的制造商说明书，使用荧光定量法进行DNA定量（试剂盒见文中提及） 材料表). 
	注意：提取的DNA可在-20 °C下保存。</li>
	<li>使用引物27f和1492r以DNA样品为模板进行PCR扩增23 如下所示条件 表4为确保PCR反应成功，使用1×TAE缓冲液和1%琼脂糖，按照标准琼脂糖凝胶电泳方法进行琼脂糖凝胶电泳。</li>
	<li>使用商业化的PCR纯化试剂盒纯化PCR产物，以去除引物、核苷酸及其他污染物。</li>
	<li>将PCR产物送至合适的测序服务机构进行Sanger测序。 
	注意：除测序外，服务提供商还可提供PCR产物纯化服务，但需额外收费。PCR产物可保存在4 °C或-20 °C。</li>
	<li>获得以 FASTA 格式提供的测序结果及色谱图文件（通常为 ABI 或 SCF 格式）后，使用生物信息学工具分析序列。利用序列分析软件打开并可视化色谱图文件。 
	注意：色谱图的整体质量通过清晰且分明的峰形且无过度噪音来评估</li>
	<li>使用美国国家生物技术信息中心（NCBI）非冗余GenBank 16S核糖体RNA数据库中的基本局部比对搜索工具（BLAST），对扩增子进行比对并比照近缘物种进行序列比对24 和 Refseq 基因组数据库。 
	注意：使用 NCBI BLAST 时，需将完整的 FASTA 序列复制到搜索栏中。</li>
</ol>
4. 纯细菌培养物的保藏
<ol>
	<li>从培养24至48小时的生长良好的细菌培养物中，通过离心（3000 × g，10分钟）或从无菌平板培养物中收集菌体。</li>
	<li>将细菌培养物悬浮于适当的等渗无菌溶液（0.85% NaCl）中，并在4 °C下以3000 × g离心10分钟进行洗涤。</li>
	<li>弃去上清液，将菌体沉淀重悬于少量无菌等渗溶液（0.5 mL）中。为确保完全去除任何培养基残留，重复洗涤一次。</li>
	<li>将沉淀重悬于0.8 mL至1 mL的无菌浓缩培养基中，使用涡旋振荡器混匀5–10秒，或轻轻吹打混匀。</li>
	<li>取0.5 mL细胞悬液转移至已灭菌并正确标记的1 mL冻存管中，加入0.5 mL经高压灭菌的50%甘油溶液。使用涡旋振荡器混匀冻存管内容物，随后置于-80 °C冰箱的冻存架中保存（图3）。 
	注意：在将冻存管转移至-80 °C冰箱之前的所有操作步骤均应在厌氧工作站内进行。</li>
</ol>

Cultivation Strategies for Uncultured Microbial Diversity in the Chicken GI Tract

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<li>Zenner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early-life+immune+system+maturation+in+chickens+using+a+synthetic+community+of+cultured+gut+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Early-life immune system maturation in chickens using a synthetic community of cultured gut bacteria.</a> mSystems. 6 (3), 1110-1128 (2021).</li>
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作者声明，他们不存在与本稿件所报告工作相关的任何竞争性财务或个人利益。

本方法的目的是通过改善采样条件、样品处理以及培养基的配制和制备，提高厌氧肠道细菌的培养效果。在配制培养基时，必须考虑样品的理化条件（如pH值、碳源、氮源和辅因子的可利用性）。与来自猪、人或小鼠的细菌培养物收集相比1,26,27&#160;，有关鸡源培养基选择的报道相对较少，甚至对于粪便和盲肠等高关注度部位的研究也可能被低估2,28。因此，本研究所采用的培养基配制与制备方案提供了80种不同的培养条件，旨在覆盖其他研究中通过测序方法所报道的微生物的代谢需求29,30,31。
除了培养基的选择和添加成分外，还需注意培养基的配制以及在制备和灭菌过程中各成分之间的相互作用。为了避免磷酸盐与琼脂结合后产生过氧化氢（H2O2），将磷酸盐溶液与琼脂溶液分别配制。该改进通过提高过氧化氢酶阴性细菌的存活率，增强了分离菌株的多样性。为防止灭菌过程中发生美拉德反应生成反应产物（MRP），碳水化合物被单独配制成溶液，并在不同的条件下进行灭菌。这两项改进虽然增加了材料消耗和操作时间，但其优势在于能够混合并配制出多种不同培养基的组合。
在溶解成分及寻找合适的灭菌条件以避免沉淀形成的过程中，分别配制小体积溶液可能带来挑战。但培养基配方通常不会达到饱和状态。我们倾向于将矿物盐溶液在60 °C下溶解后通过过滤除菌，以防止沉淀产生。对于需在高压灭菌器中通过高温高压进行灭菌的溶液，需特别注意碳水化合物溶液在高温高压条件下的氧化问题。为避免任何化学结构的改变，所有碳水化合物溶液必须在5 psi压力下于110 °C灭菌30分钟。这些预防措施有助于提高营养物质的可利用性，例如必需氨基酸、铜、锌或铁等辅因子，并减少由生成的羰基化合物所修饰的某些蛋白质的水解活性32。
在各项研究中，极少有作者讨论培养基对培养结果的直接影响。在人类微生物培养研究中常用的处理方法（如血液培养、瘤胃液或黏蛋白预培养）被不加区分地沿用于其他物种的肠道培养组学研究中，而这些物种具有不同的肠道环境2,28,33。在本研究中，给予鸡的植物性饮食促使我们基于植物性营养的主要成分（肽类和碳水化合物）调整培养基配方，以模拟鸡胃肠道内的环境，并考虑营养物质的可利用性。
大多数研究采用对鸡的下消化道区域（盲肠和粪便）进行培养的方法2,3,28,34. 很少有培养方法能够分离出该科的成员 乳杆菌科，梭菌科 和 肠杆菌科35,36 来自上消化道。然而，这些研究均未采用现代培养组学方案。2021年，Zenner 等人报道了唯一一例分离 Ligilactobacillus aviarius 获得&#160;来自鸡回肠，其余培养物则源自盲肠。相比之下，本研究报道的多样性结果显示存在重复分离的 L. aviarius，以及其他属的物种 Lactobacillus, Ligilactobacillus 和 Limosilactobacillus25这一差异说明了使用单独配制的培养基相较于市售即用型配方的优势。
在整个分离和培养过程中维持厌氧条件是非常关键的步骤，因为即使微量的氧气也可能对厌氧菌的生长产生不利影响。为了在样品运输过程中监测并维持厌氧环境，需在运输液中添加甲苯胺蓝钠（sodium resazurin）。该化合物在接触氧气时会发生还原反应，颜色由蓝色变为粉红色。在低浓度下，其对细菌活性无影响。然而，必须避免使用过高浓度，否则可能对细菌产生非预期的影响。通过严格控制甲苯胺蓝钠的浓度，可在不损害细菌样品完整性的前提下，准确监测厌氧条件。为实现目标菌的分离，采用倾注平板法结合涂布平板法，因其具有保持细菌菌落均匀分布的优势，便于精确挑选单个菌落。此外，该方法对外源性空气污染或其他污染的敏感性较低。同时，它为不同类型的细菌（包括生长速度快和慢的菌种）提供了稳定的生长环境，使每种细菌菌株均能以各自固有的速度独立增殖，而不受其他微生物的干扰。
为保存菌种，选择基于菌体沉淀的甘油冻存法而非基于液体培养基的甘油冻存法，因其可实现更高的细菌浓度并降低污染风险。该方法是一种在 -80 °C 下保存细菌培养物的有效手段，可确保长期储存的稳定性。
本方法的初始部分概述了一种分离新型厌氧菌株的策略，主要目标是探索鸡肠道内此前未培养菌株的多样性。培养和鉴定厌氧细菌是深入理解家禽健康、动物福利、微生物与宿主相互作用以及潜在益生菌株分离的有力工具。此外，该方法还有助于更深入地了解这些菌株的遗传组成和代谢产物能力，为调控肠道微生物群以实现家禽生产中理想性状的干预策略奠定基础。本方法的后续部分聚焦于分离能够代谢肌醇（MI）的厌氧菌，这一研究方向在阐明MI代谢途径方面具有重要意义，而该代谢过程至今尚不明确。值得注意的是，这些方法的应用范围不仅限于鸡，还可推广至多种样本类型，因此本研究所提出的方法是分离厌氧菌株的高效策略之一。

在研究微生物时，培养技术的复兴补充了宏基因组学研究所提供的见解，为检验此前仅被部分描述和定量的代谢假设提供了实验材料。肠道细菌的培养为持续研究微生物与宿主之间的相互作用提供了资源，有助于开展靶向定植研究，并提升分子相互作用研究的水平1,2,3。关于胃肠道微生物的知识进步已通过影响饲料配方和提高营养物质的可利用性，改善了动物营养与福利4。这一理解也促进了益生元与益生菌相互作用应用效果的提升。然而，要全面了解生化与理化条件如何相互作用并影响微生物群落的组成及其结构，仍需深入研究。为实现这一目标，微生物培养仍然不可或缺，是深入探究胃肠道环境中微生物群落复杂动态的关键工具。
与大量关于人类肠道微生物及临床培养研究的文献相比5，针对家畜来源微生物的研究主要使用有限种类的培养基进行分离，这可能限制了所获得菌株的多样性2,3。此外，培养基配方的优化以及磷酸盐和盐类与琼脂相互作用的研究（由Tanaka等人和Kawasaki等人阐明）迄今尚未应用于肠道微生物组研究中6,7,8,9。
肌醇（myo-inositol, MI）被认为是一种半必需物质，据报道在多种代谢、生理和调控过程中发挥关键作用10,11。这些过程包括参与骨骼矿化、胸肌发育、细胞信号传导、促进排卵和生育能力、调节神经元信号传导，以及作为家禽体内葡萄糖稳态和胰岛素调节的调控因子10,11。MI 通过其在关键生化过程中的相互转化，作为前体物质发挥作用，这些过程包括糖酵解/糖异生、三羧酸循环以及磷酸戊糖途径。此外，MI 还是磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol, PI）的前体，而后者进一步参与甘油磷脂代谢12。少数研究表明，MI 的代谢会导致骨骼稳定性及动物生产性能的改变，包括饲料转化率和体重增加的提升，表明其在动物体内吸收和利用后具有显著影响13,14。然而，MI 的代谢途径及其对家禽代谢的影响仍不明确15。此外，少数研究提出细菌可能在 MI 的利用中发挥作用，尤其是在回肠等高代谢活性区域16,17,18,19。
从动物胃肠道（GIT）中培养细菌的研究工作旨在扩充基因组数据库、推动科学研究、验证基于基因组的假设，并理解这些资源的生态重要性20。本研究的目标是改进从鸡胃肠道中培养细菌的策略，以提高分离菌群的多样性，并实现对能够同化和代谢肌醇的特定生态类群进行靶向分离。

<table><tbody><tr><td>乙酸</td><td>VWR</td><td>20104.334</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>VWR</td><td>97064-332</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵</td><td>Carl Roth</td><td>P726.1</td><td></td></tr><tr><td>厌氧工作站</td><td>Don Whitley Scientific</td><td>A35 HEPA</td><td></td></tr><tr><td>丁酸</td><td>Merck</td><td>8.0045.1000</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>97061-904</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>鸡溶菌酶（胞壁质酶）</td><td>VWR</td><td>1.05281.0010</td><td></td></tr><tr><td>半胱氨酸</td><td>VWR</td><td>97061-204</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>VWR</td><td>90000-908</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>Carl Roth</td><td>P749.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>母鸡/青年母鸡饲料</td><td>Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH &amp; Co. KG, D&amp;uuml;sseldorf, Germany</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>MagAttract HMW DNA 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>67563</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>混合气体（80% N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;（质量等级 5.0）、15% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;（质量等级 3.0）和 5% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;（质量等级 5.0））</td><td>Westfalen Gase GmbH, Germany</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>重组溶葡球菌酶（冻干粉）</td><td>A&amp;A Biotechnology</td><td>1017-10L</td><td></td></tr><tr><td>肌醇</td><td>Carl Roth</td><td>4191.2</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>ChemSolute</td><td>8418.01</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Carl Roth</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>丙酸</td><td>Carl Roth</td><td>6026.1</td><td></td></tr><tr><td>QuantiFluor dsDNA 检测试剂系统</td><td>Promega</td><td>E2671</td><td></td></tr><tr><td>RNase A&amp;nbsp;</td><td>QIAGEN 核糖核酸酶 A (RNase A)&amp;nbsp;</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>VWR</td><td>27800.291</td><td></td></tr><tr><td>刃天青钠</td><td>VWR</td><td>85019-296</td><td></td></tr><tr><td>硫乙醇酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>102933</td><td></td></tr><tr><td>大豆蛋白胨，无转基因成分，无动物源成分</td><td>VWR</td><td>97064-186</td><td></td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Carl Roth</td><td>8952.1</td><td></td></tr><tr><td>吐温80</td><td>Carl Roth</td><td>9139.2</td><td></td></tr><tr><td>维生素混合物（添加剂）</td><td>VWR</td><td>968290NL</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Star Lab</td><td>07127/92930</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Carl Roth</td><td>9257.05</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-D-果糖</td><td>VWR</td><td>53188-23-1</td><td></td></tr></tbody></table>

提高从鸡胃肠道培养厌氧细菌的策略

Strategies to Enhance Cultivation of Anaerobic Bacteria from Gastrointestinal Tract of Chicken

鸡的胃肠道（GIT）是一个复杂的生态系统，栖息着数以万亿计的微生物，这些微生物在宿主的生理功能、消化、营养吸收、免疫系统成熟以及抵御病原体入侵方面发挥着关键作用。为了实现动物的最佳健康与生产性能，明确这些微生物的特征并理解其功能至关重要。尽管家禽胃肠道蕴藏着大量具有潜在益生菌应用价值的微生物，但其大部分多样性仍未被充分探索。为了加深对未培养微生物多样性的认识，迫切需要系统性努力将这些微生物成功培养。分离和培养定植于胃肠道的微生物可获得可重复的实验材料，包括细胞、DNA 和代谢产物，从而为环境中的代谢过程提供新的见解。若缺乏培养手段，这些微生物在自然环境中的功能将仍不明确，仅能停留在描述性层面。我们的目标是实施一系列培养策略，旨在提高从鸡胃肠道中分离多种厌氧微生物的效率，综合运用动物生理学、动物营养学、宏基因组学、饲料生物化学以及现代培养技术等多学科知识。此外，我们还致力于规范采样、运输和培养基制备等关键操作流程，这些环节已被证实显著影响分离成功率。适当的方法学应确保持续无氧环境、最佳气体条件、适宜的宿主孵化温度，并根据各类微生物的特异性需求提供相应的营养支持。遵循这些方法不仅可实现可重复的分离结果，还将优化分离流程，从而促进对鸡胃肠道内复杂微生物生态系统的全面理解。

运输过程中厌氧条件的监测 
由于添加了刃天青钠，若在将样本转移至试管前，运输溶液颜色变为粉红色，则表明厌氧条件的维持已受到破坏或失效。因此，在运输过程中应避免使用出现颜色变化的试管，仅使用未发生颜色变化的试管，如图2所示。
测序结果分析 
对于色谱图数据存在过高背景噪音、基线紊乱、信号强度低的峰、单个位置出现多个或重叠峰以及峰高不一致的分离菌株，需使用新鲜且纯净的培养物重新进行DNA提取，因为这些现象表明样本可能存在污染、扩增不均或测序过程中出现问题。在NCBI中进行BLAST比对时，选择显示最高序列相似性百分比和较高查询覆盖度的菌株作为与本研究分离株相关的菌株，从而实现对分离株的鉴定。
多种厌氧菌的培养 
通过分离获得的厌氧菌在五种分别制备和灭菌的培养基中产生了600多个分离株。利用16S rRNA基因进行鉴定，共鉴定出15个不同的细菌属（图4）。在所有分离株中，超过一半为专性厌氧菌，其余为兼性厌氧菌。
分离株的多样性包括8个菌株，代表了与梭菌科（Clostridiaceae）、乳杆菌科（Lactobacillaceae）和颤螺菌科（Oscillospiraceae）成员相关的新型分类学物种（表5）25。这些结果凸显了在培养基制备过程中遵循良好操作规范，并使用多种培养基以确保培养研究成功的重要性。
靶向分离 
在最低限度琼脂培养基上观察到菌落，表明可能存在能够利用肌醇（MI）作为碳源的厌氧细菌（图5）。为了在基因水平上确证这些发现，可进行全基因组测序的综合分析。该测序方法能够鉴定出与肌醇代谢相关或参与肌醇代谢的特定基因，包括 iolA, iolB, iolC, iolD, iolE, iolF, iolG, iolH, iolI, iolJ, iolT, 和 iolW。
<img alt="胃肠道活检操作；组织取样、保存于试管中、注射器注入。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66570/66570fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：胃肠道组织取样及运输用于厌氧菌培养的流程。 1) 切取前将组织两端夹闭，虚线表示推荐的切割位置。2) 将取下的组织段转移至装有运输液的亨盖特管中。3) 通过注入运输液置换管内空气，以维持厌氧环境。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66570/66570fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于生长分析的带标签微生物培养管试管架，实验组与对照组设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66570/66570fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：含有从鸡回肠段获取样品的亨盖特试管示意图。 该图像展示了亨盖特试管中正确填充转运溶液的情况，确保无气相空间，并且颜色与未加样品的对照组相比保持一致。样品管中明显的浑浊现象归因于食糜的溶解。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66570/66570fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细菌培养制备流程图，包括离心和添加培养基步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66570/66570fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：厌氧菌保存的连续步骤。 1) 从等渗溶液中培养24至48小时的无菌培养物中收获生物量。2) 通过离心并去除上清液洗涤细菌细胞，以清除残留培养基。3) 重复洗涤过程。4) 将菌体沉淀溶解于培养基和50%甘油溶液中，随后分装至无菌冻存管，于-80 °C保存。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66570/66570fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="不同培养基配方中按属分类的细菌分离株百分比图表；堆叠柱状图；微生物学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66570/66570fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：分离细菌在属水平上的分类分布。 堆叠柱状图展示了从五种不同培养基配方中分离出的细菌多样性，突显了本研究中使用多种培养基配方的有益影响。培养基配方列于表 1中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66570/66570fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="在琼脂平板上的细菌生长、微生物学实验结果、菌落形成分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66570/66570fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：在最低限度琼脂培养基上的厌氧细菌菌落。 厌氧细菌在39 °C下培养24小时后，在最低限度琼脂培养基上生长形成的菌落。菌落的形成表明，除其他碳源外，myo-肌醇可能被作为主要碳源进行同化利用。展示了两个稀释度的结果，（A）10-1，由于菌落过于密集，数量超过可实际计数的范围；（B）10-2，菌落分布清晰可辨，便于进行选择性分析和计数。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66570/66570fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">培养基</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>蛋白胨培养基</td>
			<td>多糖培养基</td>
			<td>短链脂肪酸培养基</td>
			<td>碳水化合物培养基</td>
			<td>硫酸盐还原菌（SRB）培养基</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">碳源</td>
			<td>葡萄糖 0.2%</td>
			<td rowspan="2">禽类饲料（2%）</td>
			<td rowspan="2">乙酸 0.17%、异戊酸 0.01%、丙酸 0.2%、丁酸 0.2%</td>
			<td rowspan="2">葡萄糖 5%</td>
			<td rowspan="2">Na-DL-乳酸、抗坏血酸</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>淀粉 0.05%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>氮源</td>
			<td>大豆氨基酸（1%）</td>
			<td>-</td>
			<td>胰蛋白胨和肉提取物中的氨基酸（0.1%）</td>
			<td>大豆蛋白胨中的氨基酸（0.1%）、(NH4)3柠檬酸（0.1%）</td>
			<td>NH4Cl（0.1%）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>矿物质来源</td>
			<td>K2HPO4（0.05%）</td>
			<td>-</td>
			<td>K2HPO4（0.05%）</td>
			<td>K2HPO4（0.05%）</td>
			<td>K2HPO4（0.05%）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>琼脂</td>
			<td>1.50%</td>
			<td>1.50%</td>
			<td>1.50%</td>
			<td>1.50%</td>
			<td>1.50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>辅因子（灭菌后添加）</td>
			<td>酵母提取物（0.1%）</td>
			<td>-</td>
			<td>维生素混合物（0.01%）</td>
			<td>维生素混合物（0.01%）</td>
			<td>酵母提取物（0.01%）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抑制剂</td>
			<td>无</td>
			<td>无</td>
			<td>Tween 80（1%）</td>
			<td>甲萘醌（0.05%）</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：用于广泛细菌分离的培养基成分。 五种琼脂培养基的成分，每种培养基均根据碳源、氮源、矿物来源以及辅因子和抑制剂的添加情况的不同而独特配制。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>成分</td>
			<td>含量 (g/L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>酪蛋白胨</td>
			<td>17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>大豆蛋白胨</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>氯化钠</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>磷酸氢二钾</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>肌醇</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：富集培养基成分。该培养基采用多种复杂成分配制而成，旨在支持广泛细菌的生长。每种成分的添加量以 g/L 表示。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>成分</td>
			<td>最低限度琼脂培养基 (g/mL)/L</td>
			<td>最低限度肉汤培养基 (g/mL)/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-半胱氨酸</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>氯化钠</td>
			<td>0.3</td>
			<td>0.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>硫代乙醇酸钠</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>二水合磷酸氢二钠</td>
			<td>0.53</td>
			<td>0.53</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>磷酸二氢钾</td>
			<td>0.41</td>
			<td>0.41</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>氯化铵</td>
			<td>0.3</td>
			<td>0.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>氯化钙</td>
			<td>0.11</td>
			<td>0.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>氯化镁</td>
			<td>0.1</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胰蛋白胨</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>0.00773</td>
			<td>0.00773</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SL7 微量元素溶液</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>维生素混合物</td>
			<td>0.2</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>肌醇 (20 mM)</td>
			<td>3.6</td>
			<td>3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>琼脂</td>
			<td>15</td>
			<td>--</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH（使用 1 mM HCl 调节）</td>
			<td>6 ± 0.2</td>
			<td>6 ± 0.2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：最小培养基成分。 该培养基以肌醇作为主要碳源。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>初始变性</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>4 min</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>变性</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>30 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>退火</td>
			<td>52 °C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>30x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>延伸</td>
			<td>68 °C</td>
			<td>90 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>最终延伸</td>
			<td>68 °C</td>
			<td>10 min</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>4 °C</td>
			<td>∞</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4：16S rRNA基因扩增的最佳条件。 在热循环仪中用于高效扩增目标基因的理想温度、持续时间及循环参数。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>新分类学指认</td>
			<td>基因组大小</td>
			<td>GC 含量</td>
			<td>肠道区域</td>
			<td>16S 登录号 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Limosilactobacillus galli</td>
			<td>1861581</td>
			<td>50.43</td>
			<td>嗉囊</td>
			<td>OM760982</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Limosilactobacillus avium</td>
			<td>2158112</td>
			<td>48.49</td>
			<td>回肠</td>
			<td>OM760983</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Limosilactobacillus pulli</td>
			<td>1924125</td>
			<td>45.87</td>
			<td>回肠</td>
			<td>OQ831033</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clostridium butanoliproducens</td>
			<td>3507657</td>
			<td>28.34</td>
			<td>嗉囊</td>
			<td>OQ831034</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faecalispora anaeroviscerum</td>
			<td>2921858</td>
			<td>50.36</td>
			<td>回肠</td>
			<td>OM760984</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Limosilactobacillus viscerum</td>
			<td>1993658</td>
			<td>44.9</td>
			<td>回肠</td>
			<td>OM760986</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligilactobacillus hohenheimensis</td>
			<td>1381484</td>
			<td>50.47</td>
			<td>空肠</td>
			<td>OM760988</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Limosilactobacillus difficilis</td>
			<td>1998683</td>
			<td>47.38</td>
			<td>回肠</td>
			<td>OQ832131</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表5. 新细菌物种的分类学鉴定。 本研究中从鸡胃肠道分离并鉴定的新细菌物种，及其基因组大小、GC含量、分类和16S rRNA基因登录号详见此表。该表格经修改自25。

该方案介绍了两种改进厌氧肠道细菌分离的方法。第一种方法侧重于利用不同的培养基分离多种多样的细菌。第二种方法则专注于特定微生物类群的培养步骤，该类群可能具有代谢肌醇的能力。-肌醇，以全面理解其生态学意义。

鸡的胃肠道（GIT）是一个复杂的生态系统，定植着数以万亿计的微生物，这些微生物在宿主的生理过程中发挥着关键作用，……

我们的目标是从鸡肠道中分离并培养细菌，以增进对微生物网络及其与宿主相互作用的理解。对这些厌氧菌的表征有助于深入了解肠道内的生物学过程，并为未来的科学研究扩充细菌数据库。其中主要挑战之一是在采样和培养过程中防止氧气暴露以及活性氧物质的产生，以避免细菌失活。根据我们的经验，这提高了厌氧菌的多样性回收率。本方案旨在填补对家禽肌醇代谢认知的空白。通过从鸡肠道中分离潜在的肌醇代谢细菌，我们的目标是阐明参与其中的特定细菌群落及其代谢途径，推动该领域的知识进展。我们的主要目标是理解微生物群落如何与宿主相互作用，尤其是在肠道环境中。 食物在此处被分解，营养物质被吸收，并与这些微生物发生重要相互作用。首先，将每种碳水化合物、蛋白质、琼脂和矿物质溶液各250毫升加入一个高压灭菌玻璃瓶中。用带有孔洞和橡胶塞的瓶盖密封该瓶子。在用氮气对混合物进行脱气后，将其倒入厌氧工作站内的无菌培养皿中。接着，将鸡的肠道样本转移至含有氮气、二氧化碳和氢气混合气体的厌氧工作站内。使用无菌镊子将肠道样本从亨盖特管转移至无菌培养皿中。使用无菌剪刀小心剪开待处理部位，然后用无菌刮勺取出一克消化道内容物。将消化道内容物转移至含有无菌生理溶液的离心管中，并进行十倍系列稀释。 从10⁴至10⁷稀释度的样品中吸取0.1毫升，加入无菌且正确标记的培养基平板中。使用无菌Drigalski涂布棒将样品均匀涂布。最后，将培养皿倒置于厌氧工作站内，在39°C条件下培养24至48小时。分离出15个不同属的细菌。分离物的多样性包括8个菌株，这些菌株代表了与梭菌科（Clostridiaceae）、乳杆菌科（Lactobacillaceae）和颤螺菌科（Oscillospiraceae）成员相关的新型分类学物种。首先，取自屠宰后鸡只肠道收集的食糜，在涡旋振荡器上匀浆处理10至15秒。将匀质后的样品转移至含有增菌培养基的试管中。孵育后，使用涡旋振荡器充分混匀增菌试管，持续10至15秒。然后将混匀的样品转移至无菌最低营养肉汤培养基中，按之前条件进行孵育。接下来，在无菌生理盐水中对样品进行连续稀释，起始稀释度为1:10，依次稀释至1:1,000。每次稀释后，均需在涡旋混合器上充分混匀样品。在无菌且厌氧条件下，将1毫升稀释后的样品转移至培养皿中。然后将15至20毫升融化的最低限度琼脂培养基倒入培养皿中。轻轻旋转培养皿以确保均匀混合。待琼脂凝固后，将培养皿倒置于厌氧工作站中，在39摄氏度下孵育24小时。培养结束时，菌落应呈现为明显、微小的嵌入状斑点。现在使用无菌接种环小心挑取每个单独的细菌菌落。将菌落分别转移至含有5 mL最小培养基的试管中。孵育结束时浊度增加表明有细菌生长。在最低限度琼脂培养基上观察到能够利用肌醇的细菌菌落。

strategies-to-enhance-cultivation-anaerobic-bacteria-from

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科研

JoVE Journal

Biology

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