Name: 基于 SPE-UPLC 的单花生 （Arachis spp.） 中黄曲霉毒素和二苯乙烯类植物抗毒素的无损定量分析种子 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-19T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 了解基于UPLC的无损定量分析方法，用于单粒花生种子中黄曲霉毒素和二苯乙烯类植物抗毒素的检测。该方法可筛选野生Arachis种质资源，鉴定抗Aspergillus真菌的遗传抗性材料，为培育抗病花生品种提供技术支持。

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本工作获得了美国农业部农业研究局（USDA-ARS）CRIS 项目 6044-42000-011-00D 和 CRIS 项目 6044-21000-005-000-D 的资金支持。我们感谢 Dan Todd 制作了微型色谱柱固定架。本文中提及的商标名称或商业产品仅为提供具体信息之目的，并不意味着美国农业部对这些产品或名称的推荐或认可。

1. 真菌侵染实验用种子的准备
<ol>
	<li>孵育产黄曲霉毒素的 曲霉属 flavus 试管斜面马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上培养 NRRL 3357，25 °C 恒温培养 6 天 30 &#176;C收获&#160;含有 Tween 20 的 10 mL 水中的试管真菌孢子100 &#956;L 将Tween溶于1 L蒸馏灭菌水中，通过置于漏斗中的玻璃棉过滤，参照使用手册，用血细胞计数板对孢子进行计数。</li>
	<li>用无菌水将孢子悬液稀释至每微升1,000个孢子/μL&#956;L 浓度。使用血细胞计数板确认浓度。 
	注意：孢子悬液应在挑战实验前不超过2小时配制。</li>
	<li>轻轻敲开花生荚果并去除果壳。将种子放入无菌烧杯中，种子体积不超过烧杯容积的1/5，加入0.05%过氧化氢溶液至烧杯容积的约70%，让种子吸水浸泡3 h。</li>
	<li>将过氧化氢溶液从种子中倾倒出去，向烧杯中加入约3倍体积的80%乙醇-水混合液（v/v），以浸没种子。静置1分钟后，用等体积的无菌蒸馏水冲洗种子2次。</li>
	<li>添加&#160;将3%过氧化氢溶液以5倍体积加入含有乙醇灭菌种子的烧杯中，静置5分钟，然后倾去液体，再用等体积无菌水冲洗种子两次（图2A).</li>
</ol>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig2.jpg" /> 
图2：花生种子接种、培养及黄曲霉毒素和植物抗毒素组分提取的制备过程。（A）使用3%过氧化氢对吸胀后的种子进行表面灭菌；（B）去除种子的种皮（外皮）；（C）切去胚轴部分；（D,E）用钻头在半个子叶上钻孔形成空腔；（F）将钻孔后的种子部分放置于琼脂培养基上；（G）将真菌孢子&#160;接种至钻孔空腔中；（H）培养后的种子置于培养皿中；（I）将培养后的单粒种子（对照样品照片）放入加强型珠磨管中；（J）加入定量的提取溶剂；（K）在珠磨破碎仪中粉碎样品；（L）对粉碎后的匀浆进行离心处理。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="6">
	<li>将种子置于无菌纸巾上，用镊子去除种皮，并用解剖刀切下约三分之一含有胚轴的种子部分（图2B，C）。</li>
	<li>丢弃该部分种子，或将其用于在含培养基的试管中培育植株（图1B，E）。</li>
	<li>将剩余的种子部分分离成两片子叶，放入培养皿中，用湿润的无菌滤纸覆盖种子部分，&#160;盖上皿盖以防止脱水，并立即进行接种操作。</li>
	<li>在进行难度较高的实验前，准备足量含有种子培养基的培养皿：将26 mL 1.5%无菌水琼脂倒入100 × 15 mm培养皿中，静置过夜使其凝固。&#160;</li>
	<li>在每片子叶剩余部分的外侧中央，使用直径为1.6–2.34 mm的无菌锋利钻头手动钻出深约1.5–2 mm的孔洞。每个孔洞的钻取时间约为2–5秒（图2D，E）。</li>
	<li>将4&#160;至6&#160;个已“钻孔”的种子片段放入含琼脂的培养皿中，并用10 μL移液器向每半个子叶片段的钻孔中加入2 μL浓度为1,000个孢子/μL的孢子悬浮液。对照组种子则加入等量无菌水而非孢子悬浮液（图2F，G）。</li>
	<li>盖上所有培养皿的皿盖，在30 °C黑暗条件下培养72小时。</li>
</ol>
2. 黄曲霉毒素和植物抗毒素分析用培养种子样品的采集与制备
<ol>
	<li>用镊子从琼脂上取下种子片段，于72小时收集，并将每份放入已标记的7 mL珠磨管中，每管加入13颗氧化锆陶瓷珠（12颗直径为2.8 mm，1颗直径为6.5 mm）（图2H，I）。 
	注意：此时若不立即处理，可将珠磨管置于-80 °C冰箱中保存，最长可保存2个月后再进行后续处理。</li>
	<li>在同一份种子提取物中同时测定植物抗毒素和黄曲霉毒素。根据种子的目测大小（小、中或大），向珠磨管中加入2 mL或4 mL精确量取的甲醇-水混合液（90:10，v/v），在5.5 m/sec条件下研磨45秒。将研磨后的种子样品管放入离心机，以1,860 × g离心3分钟（图2J - L）。 
	注意：以下几种重要的17，22二苯乙烯类衍生物将被测定（均为反式构型）：白藜芦醇、花生醇-1、花生醇-2、花生醇-3、3′-异戊二烯基-3,5,4′-三羟基二苯乙烯（IPD）和SB-1。</li>
	<li>进行黄曲霉毒素分析前，在开展具有挑战性的实验之前，需按以下步骤制备足够数量的净化柱。借助一根90o角切割的玻璃棒，将一个匹配的聚乙烯多孔滤片（20 μL）放入1.5 mL聚丙烯柱中。使用自制的小勺向柱内加入50 mg镁硅胶（100-200目），再用另一相同滤片盖住柱子，并用玻璃棒将其压紧（图3A - E）。 
	注意：该量的镁硅胶占据75 μL体积，吸附剂层高度为3 mm。</li>
</ol>
<img alt="图 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig3.jpg" /> 
图 3：净化柱和滤膜的制备。（A,B）将多孔烧结板放入筒体中；（C,D）在筒体内填充硅酸镁；（E）压实吸附剂，并在筒体顶部插入另一块多孔烧结板。（F）将直径为 11.5 mm 的玻璃纤维圆片置于巴斯德移液管顶端。（G,H）用塑料或木棒将圆片中心向下推至巴斯德移液管筒体底部，并将玻璃纤维紧密压实。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="4">
	<li>此时，按照 图3F - H 所示制备相应数量的定制滤膜。</li>
	<li>进行黄曲霉毒素分析时，准确量取最多0.5 mL上清液（按步骤2.2所述方法获得），转移至定制填充的小柱中，让提取液依靠重力流入4 mL玻璃小瓶中。随后，向小柱中加入1.0 mL甲醇-水（90:10，v/v）混合液，通过重力作用将杂质冲洗至同一4 mL小瓶中（图4A）。</li>
</ol>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig4.jpg" /> 
图4:&#160;种子提取物的纯化及UPLC分析前处理。（A）&#160;装填好的固相萃取柱架。（B）使用N2气体将6个4 mL小瓶中从净化柱洗脱出的纯化提取物的溶剂蒸发。（C）在向4 mL小瓶中加入进样溶剂（MeOH-H2O 9:1, v/v）前后，将小瓶和滤器置于装有冰块的泡沫容器（1和2）中，使其达到零下温度。（D）将冷却后的提取物从4 mL小瓶过滤至400 µL自动进样瓶中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="6">
	<li>弃去合并的洗脱液。用 1.2 mL 丙酮-乙腈-水-88% 甲酸（65:31:3.5:0.5，v/v）混合液通过重力洗脱，将黄曲霉毒素组分从柱中洗脱至一支洁净的 4 mL 玻璃小瓶中（图 4A).</li>
	<li>或者，用 2.0 mL 乙腈-水-88% 甲酸（96:3.5:0.5，v/v）混合液从柱中洗脱黄曲霉毒素，并进样部分洗脱液，最多至 2 &#956;L，直接注入超高效液相色谱（UPLC）系统（无需用氮气蒸发溶剂）2). 
	注意：在此情况下，黄曲霉毒素的定量限预期可降低至原来的十分之一；在大多数情况下，这种灵敏度的下降是可以接受的，因为受污染种子中的黄曲霉毒素浓度通常较高。</li>
	<li>从样品瓶中在氮气流下除去溶剂2 在加热块中 45 &#176;C将小瓶盖紧，放入装有碎冰的容器中，冰浴30–45秒，以减少下一步添加溶剂时的挥发。将定制滤器放入一次性试管中，并将试管插入另一容器的冰中，以减少过滤过程中溶剂的挥发。图4B, C).</li>
	<li>溶剂蒸发后，将干燥残留物溶解于精确量取的0.25–1.0 mL甲醇-水混合液（90:10，v/v）中，涡旋1–2秒。将含有纯化提取物的小瓶置于UPLC自动进样器中，进样量为0.1至 3.0 &#956;L 进入UPLC系统（图5A，B). 
	注意：如果涡旋后溶液疑似含有悬浮颗粒，需通过预冷的滤膜过滤溶液（图4D).</li>
</ol>
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig5.jpg" /> 
图5超高效液相色谱分析纯化提取物的过程与结果 (A将装有纯化后样品提取物的样品架放入UPLC自动进样器中。B) 进行仪器分析，获取数据，并解释结果。C) 四种主要黄曲霉毒素的超高效液相色谱分析；重点关注的主要峰，黄曲霉毒素B1 和 B2 分别代表 0.04 和 0.004 ng。D) 赭曲霉毒素B的超高效液相色谱分析1 和 B2；峰2代表黄曲霉毒素B1 在2 pg水平（含 8 &#181;L 流动池）。E超高效液相色谱（UPLC）&#160;来自当地花生田野生植株所收获种子的纯化提取物 花生属 物种。F) 经碱性氧化铝小柱纯化的受挑战花生种子提取物的UPLC分析。G) 经Florisil柱纯化的受侵染花生种子提取物的UPLC图谱；蓝色色谱峰表示用1 mL甲醇-水（90:10 v/v）混合液从柱上洗脱下来的杂质；黑色色谱峰显示黄曲霉毒素M的峰1 和 B1黄曲霉毒素B的水平1 为 48 ng/g。HA&#160;花生在受到胁迫后 stilbenoids 的典型色谱图；缩写：IPD = 3&#8242;-异戊二烯基-3,5,4&#8242;-三羟基二苯乙烯。注：种子提取物中的所有茋类化合物均处于 转-构型。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>&#160;
<ol start="10">
	<li>进行植物抗毒素分析时，从每个珠子小瓶中转移 200 μL 上清液至上述巴斯德移液管滤器中。使用压缩氮气罐中的 N2 气体，加快过滤至 400 μL UPLC 自动进样瓶中，并用带有聚四氟乙烯（PTFE）隔垫的匹配瓶盖密封小瓶（图 4D）。</li>
</ol>
3. 黄曲霉毒素分析
<ol>
	<li>分离种子提取物中的黄曲霉毒素时，使用配备自动进样器、四元泵、荧光检测器、UPLC BEH C18 3.0 mm × 100 mm，1.7 µm 色谱柱及匹配的保护柱，以及带有标准编织 PTFE 管（内径 0.25，剪裁至原长度的 25%）的柱后光化学反应器（PHRED）的超高效液相色谱（UPLC）系统。 
	注：作者所使用的 UPLC 仪器及相关设备列于材料表中。</li>
	<li>流动相使用水（A）、甲醇（B）和乙腈（C），采用以下梯度程序：初始条件为 62.7% A、24% B、13.3% C，在 3.75 分钟内线性变化至 30% A、45% B、25% C，在 3.751 分钟时变为 0% A、64.4% B、35.6% C，等度保持 3.249 分钟，随后在 0.01 分钟内恢复至初始条件，并在下一次进样前等度保持 2.499 分钟。设置流速为 0.45 mL/min，运行时间为 9.5 分钟。使用系统柱温箱将色谱柱温度维持在 40 °C。黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2 和 M1 定量时，激发波长和发射波长分别设为 362 nm 和 440 nm。主要黄曲霉毒素的结构见图 6A。 
	注：在本实验条件下，预期仅黄曲霉菌株 A. flavus NRRL 3357 产生黄曲霉毒素 B1 和 B2；若使用寄生曲霉（A. parasiticus）菌株进行种子接种，则预期产生黄曲霉毒素 B1、B2、G1 和 G2。</li>
	<li>根据相应标准品的峰面积（校准曲线）确定黄曲霉毒素的浓度，具体方法参见软件用户手册。 
	注：由于在荧光检测器高灵敏度设置下，UPLC 方法存在基线噪声，因此采用广泛接受的信噪比（S/N）3:1 和 10:1 分别评估黄曲霉毒素的检出限（LOD）和定量限（LOQ）。在本方案第 2 和第 3 节所述的花生种子常规分析实验条件下，黄曲霉毒素 G1 和 B1 的定量限预计分别不高于 0.8 ng/g 和 0.08 ng/g，G2 和 B2 的定量限亦分别不高于相应数值。</li>
</ol>
4. 萜烯类植物抗毒素分析
<ol>
	<li>分离芪类化合物时，使用水（A）、甲醇（B）和88%甲酸（C），采用以下梯度：初始条件为53% A、42% B、5% C，在2.0分钟内线性变为35% A、60% B、5% C，等度保持4分钟；随后在0.5分钟内变为0% A、95% B、5% C，等度保持2.5分钟；然后在0.1分钟内恢复至初始条件，等度保持2.9分钟，再进行下一次进样。设置流速为0.5 mL/min，运行时间为12.0分钟。</li>
	<li>根据相应标准品的峰面积（校准曲线）和/或软件用户手册中所述的已发表摩尔消光系数来确定芪类化合物的浓度。主要芪类衍生植保素的结构见图6B。 
	注意：植保素的分离使用相同的系统，但不使用荧光检测器和PHRED反应器，而是采用二极管阵列检测器对花生芪类化合物进行检测和定量。对于主要的芪类植保素，定量限（LOQ）并无实际意义，因为这些芪类化合物在相同提取物中的浓度比黄曲霉毒素高出数个数量级；经过3天孵育后，芪类化合物可被可靠地定量。</li>
</ol>

Evaluation of Wild Peanut Species for Resistance to Aflatoxin Accumulation

<ol><li>Janila, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+breeding+for+introgression+of+fatty+acid+desaturase+mutant+alleles+%28ahFAD2A+and+ahFAD2B%29+enhances+oil+quality+in+high+and+low+oil+containing+peanut+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular breeding for introgression of fatty acid desaturase mutant alleles (ahFAD2A and ahFAD2B) enhances oil quality in high and low oil containing peanut genotypes.</a> Plant Sci. 242, 203-213 (2016).</li>
<li>Rasooly, R., Hernlem, B., He, X., Friedman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-linear+relationships+between+aflatoxin+B1+levels+and+the+biological+response+of+monkey+kidney+vero+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Non-linear relationships between aflatoxin B1 levels and the biological response of monkey kidney vero cells.</a> Toxins (Basel). 5 (8), 1447-1461 (2013).</li>
<li>American Association for Cancer Research: AACR. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+chemicals+and+industrial+processes+associated+with+cancer+in+humans+based+on+human+and+animal+data%3A+IARC+Monographs+Volumes+1+to+20%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">An evaluation of chemicals and industrial processes associated with cancer in humans based on human and animal data: IARC Monographs Volumes 1 to 20.</a> Cancer Res. 40 (1), 1-12 (1980).</li>
<li>Turner, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+epidemiology+of+chronic+aflatoxin+driven+impaired+child+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Scientifica%22%5BJournal%5D)">The molecular epidemiology of chronic aflatoxin driven impaired child growth.</a> Scientifica. , 21(2013).</li>
<li>Williams, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+aflatoxicosis+in+developing+countries%3A+a+review+of+toxicology%2C+exposure%2C+potential+health+consequences%2C+and+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Human aflatoxicosis in developing countries: a review of toxicology, exposure, potential health consequences, and interventions.</a> Am. J. Clin. Nutr. 80 (5), 1106-1122 (2004).</li>
<li>van Egmond, H. P., Jonker, M. A. Worldwide regulations on aflatoxins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avan+Egmond%2C+HP+%22Aflatoxinandfood+safety%22">Aflatoxinandfood safety</a>. Abbas, H. K. , Taylor and Francis. Baca Raton, Florida. 77-93 (2005).</li>
<li>European Commission. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commission+Regulation+%28EC%29+1525%2F98%5BTitle%5D)+AND+%22Off.+J.+Eur.+Comm.+L%22%5BJournal%5D)">Commission Regulation (EC) 1525/98.</a> Off. J. Eur. Comm. L. 201, 43-46 (1998).</li>
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<li>de Blas, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+smut+resistance+in+wild+Arachis+species+and+its+introgression+into+peanut+elite+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of smut resistance in wild Arachis species and its introgression into peanut elite lines.</a> Crop Sci. 59 (4), 1657-1665 (2019).</li>
<li>Mallikarjuna, N., Pande, S., Jadhav, D. R., Sastri, D. C., Rao, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introgression+of+disease+resistance+genes+from+Arachis+kempff-mercadoi+into+cultivated+groundnut%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Breeding%22%5BJournal%5D)">Introgression of disease resistance genes from Arachis kempff-mercadoi into cultivated groundnut.</a> Plant Breeding. 123 (6), 573-576 (2004).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

根据我们以往的经验28，我们开发了一种简单、低成本、环境友好的化学方法，适用于对野生花生属（Arachis）种质资源进行筛选，以鉴定对曲霉菌（Aspergillus）具有抗性的物种，并用于发现和表征对该机会性真菌具有遗传抗性的新资源。该方法基于固相萃取（SPE）技术对种子提取物进行纯化，并采用超高效液相色谱法（UPLC）对黄曲霉毒素进行定量，具有较高的回收率、精密度和准确性。所提出的&#34;弗罗里硅土&#34;方法是对单层微型柱净化步骤的改进，其原理是利用弗罗里硅土（镁硅酸盐凝胶）能够强效且选择性地吸附黄曲霉毒素的特性28。与原始方法类似，种子样品使用甲醇-水（MeOH-H2O）混合液进行提取，但本方法采用90:10（v/v）的比例，而非文献报道的80:20（v/v）。这一调整使洗脱溶剂在净化柱中的流速提高了至多2.5倍，同时保持了相同的黄曲霉毒素回收率。使用90:10（v/v）的甲醇-水混合液，在向提取溶剂中添加相当于每克基质含5–50 ng黄曲霉毒素浓度的加标标准品时，对黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2的回收率接近100%，并且在加标花生种子样品中也获得了足够高的回收率（表1）。
研究表明，黄曲霉毒素只能使用大量丙酮30、丙酮-甲醇31,32以及丙酮-水混合液33,34,35,36从弗罗里硅土吸附剂中洗脱下来。在本研究过程中，我们发现酸化乙腈在从弗罗里硅土上洗脱黄曲霉毒素方面与丙酮具有相似的性能。据我们所知，乙腈的这一特性在文献中尚未见报道。该特性的发现使得纯化后的提取物可直接进样至UPLC系统，省去了溶剂蒸发步骤，显著缩短了样品前处理时间。即使将乙腈与丙酮混合使用（丙酮-乙腈-水-88%甲酸（65:31:3.5:0.5, v/v）），也能快速、完全且顺畅地去除纯化洗脱液中的水分，大幅减少溶剂蒸发时间。乙腈的存在使得仅需使用一种洗脱溶剂——甲醇-水（90:10, v/v）混合液，即可有效去除弗罗里硅土柱上的杂质，而相比之下，已有文献报道的方法则需要额外使用甲醇和氯仿-甲醇混合液两种洗涤溶剂28。
使用 1.2 mL 洗脱液洗脱黄曲霉毒素时，黄曲霉毒素 B1 标准品的平均回收率约为 98%。选择 50 mg 的弗罗里硅土用量，是为了使 1.2 mL 洗脱溶剂恰好将微型柱填充至柱管顶部，同时获得满意的回收率（表 1）。该方法加快了净化过程，因为柱管只需填充一次即可。在本项目初期，尚不清楚颗粒尺寸相对较大的商用弗罗里硅土（100–200 目）是否适用于仅装填 3 mm 吸附剂层的小型色谱柱。因此，我们使用美国标准试验筛（120–140、140–170、170–200、200–270、270–400 和 &#62;400 目）对商用 100–200 目产品进行分级，并测试了不同粒径组分的效果。所有这些组分均表现出可重复且几乎一致的结果，并具有满意的回收率。尽管在紫外光下观察，较小粒径的组分在柱中形成的黄曲霉毒素条带更窄，但其在任何方面均未优于商用 100–200 目产品。此外，100–200 目组分在整个操作过程中表现出最短的洗脱时间（8–12 分钟）。
梯度UPLC溶剂输送实现了黄曲霉毒素的良好分离，同时可将非极性杂质完全从色谱柱上清除（图&#160;5G）。该方法确保了色谱柱的无故障运行，并使数百个样品的分析结果具有高度可重复性。从弗罗里硅土柱洗脱出的黄曲霉毒素的身份已如前所述得到确认28。与相同化学性质的2.1 mm内径色谱柱相比，本研究所用的3 mm内径分析型UPLC色谱柱在较高浓度下对黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2表现出更高的选择性和更可靠的分离效果。此外，3 mm色谱柱的使用寿命（超过1,200次进样）显著长于2.1 mm色谱柱（最多800次进样）。尽管3 mm色谱柱需要更高的流动相流速（高出40%），但其上述优势明显超过了这一缺点。
弗罗里硅土微型柱对严重污染了Aspergillus代谢产物的花生种子提取物具有良好的纯化效果（图5G）；此类种子还含有高水平的芪类植物抗毒素，这些物质是种子在应对真菌侵染时自身产生的。所有这些杂质在种子中的浓度可能比黄曲霉毒素高出多达106倍22，使得这类种子成为黄曲霉毒素分析中的难点样本。图5G显示，在黄曲霉毒素的保留时间内，色谱图中无干扰峰出现，因此在所有测试水平下均能实现不受干扰的黄曲霉毒素检测与定量（表1）。如表1所示，该方法在1.0–50.0 ng/g的测试范围内具有足够高的准确度和精密度，而此范围也正是黄曲霉毒素检测中最关键的浓度区间。不同水平下多种野生花生基因型的回收率表现一致，且五次不同提取的实验结果标准偏差极低。
该方法还测试了花生、棉花、玉米和水稻种子，这些种子天然污染程度从零到极高，总黄曲霉毒素含量超过 10,000 ng/g。在 5 ng/g 添加水平下，玉米、棉籽和稻米中黄曲霉毒素 B1、B2、G1 和 G2 的回收率分别为 76.1% 至 93.7%、77.1% 至 86.6% 和 90.5% 至 96.2%。稻米中黄曲霉毒素的最高回收率与洗脱液的&#34;纯度&#34;相关，即几乎不含任何杂质。此外，稻米是所测试样品中单粒质量最小的，平均每粒约 19 mg。
使用弗罗里硅土小柱对单粒花生种子进行全部前处理（包括脱壳、称重、提取、离心和纯化）所需时间不超过20分钟。弗罗里硅土小柱的成本比商用净化小柱低&#62;10倍。与已发表的方法相比28，该方法在吸附剂、溶剂和氮气的使用量上更少，进一步节约了成本。&#160;该小柱无需泵或真空装置即可操作，且可长期保存。
探索植物种质资源对黄曲霉毒素的抗性极为困难，因为霉菌毒素的积累不符合正态分布37,38；需要对单粒种子进行大量黄曲霉毒素分析以克服这一现象。除了黄曲霉毒素含量外，关于植物抗毒素定量组成的资料也极具价值，尤其是在从单粒种子中可获取大量信息的背景下图1A)&#160;并追踪到特定植株 (图1E该方法已成功用于筛选数百份花生种质资源，包括地方品种、高代育种品系和优良花生品种。建议在花生预育种和育种研究项目中应用该方法，其可能有助于花生抗真菌相关基因的鉴定。

花生（Arachis hypogaea L.）是世界上主要的粮食作物之一，在超过100个国家种植，总产量超过4500万吨1。花生、玉米和棉籽等农产品常常受到土壤中的曲霉属（Aspergillus）真菌侵染，这些真菌可产生黄曲霉毒素2。当环境条件高温且干旱时，这些农产品在收获前尤其容易受到黄曲霉毒素污染3。黄曲霉毒素是已知最强的致癌物之一4，全球约四分之一的农产品受到其污染，导致全球约一半人口长期暴露于黄曲霉毒素5。由于其极强的致癌性和毒性，世界上大多数国家均将食品中黄曲霉毒素的含量限制在实际可行的最低水平6。
欧盟（EU）已立法规定，供人类食用的产品中黄曲霉毒素B1的最大限量为2 ng/g，总黄曲霉毒素（B1、B2、G1和G2）为4 ng/g7。如此严格的限量给农业及加工受黄曲霉毒素污染商品的食品工业带来了巨大压力。对受污染花生进行黄曲霉毒素监测和再加工，可被视为一种被动且成本高昂的策略，用以防止黄曲霉毒素进入食物链。正因如此，花生产业的各个主要环节&#160;均因现有花生栽培品种易受黄曲霉毒素污染而蒙受巨大利润损失，这些品种通常对真菌病害的抗性有限。解决黄曲霉毒素问题的一种前瞻性方法是通过基因渐渗获得抗真菌的花生栽培品种，即将抗性野生花生物种的遗传信息转移到优良栽培品种中。近年来8,9，由于栽培花生遗传基础狭窄，已无法为花生植株提供所需的抗病性状水平10,11，野生花生物种因此被广泛视为遗传抗病性的潜在来源。成功实现来自野生花生物种的基因渐渗，需要对成千上万颗单粒、细小且稀少的&#160;种子进行分析（图1A）12。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig1.jpg" /> 
图1：单粒种子分析流程图。（A）不同市场类型的花生品种与野生Arachis物种的种子大小比较：（1）弗吉尼亚型；（2）匍匐型；（3）西班牙型；（4）野生Arachis物种。（B）将野生Arachis物种（A板，种子4）切成三部分，（5）含胚轴的半粒种子；该部分用于种植植株（E）。（C）将（6）和（7）两部分用钻头打孔，（D）并接种真菌孢子。在30 °C下培养72小时后，取其中一部分（6或7）用于黄曲霉毒素和植物抗毒素分析，另一部分用于RNA/转录组测序。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
花生对真菌病原体的抗性与植物抗毒素密切相关13,14,15,16,17。花生植物抗毒素主要为抗微生物的芪类化合物，这类物质在植物组织受到外界刺激（尤其是真菌侵染）后生物合成并积累16,17,18。在真菌侵染部位迅速积累足够浓度的植物抗毒素可抑制真菌生长，对植物防御至关重要19,20,21。当植物抗毒素积累至抑制浓度时，病原菌的生长即被阻断16,22。三十多年前，田间试验已评估了芪类化合物在花生中抵御产黄曲霉毒素真菌的作用13。这些试验明确支持了“花生芪类化合物是收获前黄曲霉毒素污染的关键抗性因子”这一假说。该结论的依据包括：芪类化合物可在田间受损花生中自然产生；其对产黄曲霉毒素真菌具有显著的生物活性；且仅当花生因干旱导致种子脱水而丧失植物抗毒素合成能力时，才检测到黄曲霉毒素污染。另一组田间试验进一步证实了植物抗毒素的产生与花生基因型对重要农业病害抗性之间的关联17。
深入了解花生基于天然植物抗毒素抵御真菌侵染的机制，是控制黄曲霉毒素污染的有效策略15,17. 因此，除了黄曲霉毒素分析外，对相同种子进行植物抗毒素的定量分析也十分重要。尽管这种抗性机制尚未得到充分研究和阐明，但对于培育和遗传改良具有抗真菌能力的新花生品种而言，该机制至关重要23尽管针对不同商品中黄曲霉毒素的检测已存在多种分析方法，但在特定研究中仍需要更为简便的方法，尤其是当传统方法无法满足分析需求或成本效益要求时。花生产业、农业及私营实验室所采用的大多数现代净化方法均基于抗体技术24 和免疫测定25,26,27设备。它们具有选择性和高灵敏度，但成本显著高于填充普通吸附剂的微型柱。此外，这些方法均未针对数毫克量级样品的分析而设计。基于我们先前关于使用填充镁硅酸盐（Florisil）的微型柱进行分析的研究28我们对该程序进行了改进，以满足当前及未来育种前阶段和育种计划的需求。
本研究旨在建立一种非破坏性、中等通量且环境友好的方法，用于单粒花生种子中黄曲霉毒素和植物抗毒素的定量检测。该方法已经成功建立。与已发表的方法相比，其优势在于灵敏度更高，能够对单粒种子提取物中的黄曲霉毒素和植物抗毒素同时进行分析，无需称量样品，并且由于耗材用量更少而成本更低。集成方法的流程图见图1。本文文字及图示中提及了遗传分析及其他步骤，以说明所建议方法的重要性及其与整个流程的整合方式。

<table><tbody><tr><td>丙酮，Optima</td><td>Fisher Scientific</td><td>A929-4</td><td></td></tr><tr><td>乙腈，Optima</td><td>Fisher Scientific</td><td>A996-4</td><td></td></tr><tr><td>Acquity BEH C18 2.1 x 5 mm Van-Guard 保护柱</td><td>沃特世公司</td><td>186003975</td><td></td></tr><tr><td>Acquity BEH C18 3 x 100 mm 柱</td><td>沃特世公司</td><td>186004661</td><td></td></tr><tr><td>Acquity BEH C18 2.1 x 100 mm 柱</td><td>沃特世公司</td><td>186002352</td><td></td></tr><tr><td>黄曲霉毒素 B1、B2、G1 和 G2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9441-1VL</td><td>将市售小瓶中的内容物溶于5 mL甲醇中，以获得5 &amp;micro;g/mL，黄曲霉毒素B1和G1为1.5 &amp;micro;B2 和 G2 的单位为 g/mL</td></tr><tr><td>黄曲霉毒素 B1（1mg）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6636-1MG</td><td></td></tr><tr><td>黄曲霉毒素 B2（1mg）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9887-1MG</td><td></td></tr><tr><td>黄曲霉毒素G1（1mg）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0138-1MG</td><td></td></tr><tr><td>黄曲霉毒素 G2（1mg）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0263-1MG</td><td></td></tr><tr><td>黄曲霉毒素 M1 (10 &amp;micro;g)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CRM46319</td><td></td></tr><tr><td>琼脂，粉状（2公斤）</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD214510</td><td></td></tr><tr><td>氧化铝碱性（60-325目）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A941-500</td><td></td></tr><tr><td>基础培养基</td><td>穆拉希格和斯科格</td><td>M5519</td><td></td></tr><tr><td>Bead Ruptor 24&amp;nbsp;</td><td>Omni International</td><td>19-042E</td><td></td></tr><tr><td>烧杯（1000 mL）</td><td>康宁（派热克斯）</td><td>10001L</td><td></td></tr><tr><td>烧杯（250 mL）</td><td>康宁（派热克斯）</td><td>1000250</td><td></td></tr><tr><td>烧杯（400 mL）</td><td>康宁（派热克斯）</td><td>1000400</td><td></td></tr><tr><td>烧杯（600 mL）</td><td>康宁（派热克斯）</td><td>1000600</td><td></td></tr><tr><td>刀片，手术刀</td><td>羽毛</td><td>#10</td><td></td></tr><tr><td>离心机（LSE Compact）</td><td>康宁</td><td>型号：6755</td><td></td></tr><tr><td>离心机，微型</td><td>康宁</td><td>型号：6770</td><td></td></tr><tr><td>陶瓷珠（2.8 mm）</td><td>Omni International</td><td>19-646</td><td></td></tr><tr><td>陶瓷珠（6.5 mm）</td><td>Omni International</td><td>19-682</td><td></td></tr><tr><td>Chromeleon 7 系列软件</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>钻头</td><td>京瓷</td><td>07896</td><td>1.6 mm</td></tr><tr><td>钻头</td><td>京瓷</td><td>07357</td><td>2.0 mm</td></tr><tr><td>钻头</td><td>京瓷</td><td>07985</td><td>2.34 mm</td></tr><tr><td>乙醇（200 proof）</td><td>Decon Labs</td><td>2805M</td><td></td></tr><tr><td>蒸发仪，氮气</td><td>organimation</td><td>11106</td><td>6-位点</td></tr><tr><td>Excel，微软</td><td>微软</td><td>Office 365</td><td></td></tr><tr><td>滤纸（#4）</td><td>Cytiva Whatman</td><td>1004-090</td><td></td></tr><tr><td>滤纸切割器，不锈钢（内径 11.5 mm）</td><td>未知</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滤纸，玻璃纤维</td><td>Cytiva Whatman</td><td>934-AH</td><td></td></tr><tr><td>烧瓶（2800 mL）</td><td>康宁（派热克斯）</td><td>44202XL</td><td></td></tr><tr><td>弗罗里硅土（100-200目）</td><td>Fisher Scientific</td><td>F101-500</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Integra Lifescience（Miltex）</td><td>PM-0300</td><td></td></tr><tr><td>甲酸（88%，ACS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A118P-500</td><td></td></tr><tr><td>-80℃冰箱&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C)</td><td>Fisher Scientific</td><td>TSX70086D</td><td></td></tr><tr><td>漏斗（15 x 80 mm）</td><td>DWK生命科学（Kimax）</td><td>2902060</td><td></td></tr><tr><td>Gelzan（中等浓度）</td><td>Caisson Labs&amp;nbsp;</td><td>G024</td><td></td></tr><tr><td>玻璃棒（定制）</td><td>定制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃棉</td><td>康宁（派热克斯）</td><td>3950</td><td></td></tr><tr><td>刀柄，手术刀&amp;nbsp;</td><td>羽毛</td><td>#7</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>豪泽科学</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-4</td><td>30%，认证符合美国化学会标准</td></tr><tr><td>带盖圆形冰桶</td><td>康宁</td><td>432122</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Percival</td><td>136VL</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech SCIENCE 品牌 Kimwipes 纸巾</td><td>Kimtech</td><td>34120</td><td>8.2&quot; x 4.39&quot;</td></tr><tr><td>Kimtech SCIENCE 品牌 Kimwipes 纸巾</td><td>Kimtech</td><td>34256</td><td>16.4&quot; × 14.43&quot;</td></tr><tr><td>实验服</td><td>Cenmed</td><td>B113660SBXL</td><td></td></tr><tr><td>甲醇，Optima</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td></td></tr><tr><td>微型柱架（定制）</td><td>定制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>混匀器，触控式（Maxi Mix II）</td><td>Thermolyne</td><td>37600（型号 231）</td><td></td></tr><tr><td>腈类手套&amp;nbsp;</td><td>Microflex</td><td>XC310M</td><td></td></tr><tr><td>氮气，压缩（超高纯度）</td><td>琼斯焊接</td><td></td><td></td></tr><tr><td>纸巾</td><td>乔治亚太平洋</td><td>20023 (D400)</td><td></td></tr><tr><td>pH计</td><td>Fisher Scientific（Accumet）</td><td>13-636-AB15</td><td></td></tr><tr><td>pH/ATC电极</td><td>Fisher Scientific（Accumet）</td><td>13-620-111</td><td></td></tr><tr><td>PhCR 光化学反应器</td><td>沃特斯（Vicam）</td><td>600001222</td><td></td></tr><tr><td>移液管，巴斯德</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td>9&quot;</td></tr><tr><td>移液器（1 mL）（参考文献 2）</td><td>Eppendorf</td><td>4924000088</td><td></td></tr><tr><td>移液器（10 &amp;mu;L）（参考）</td><td>Eppendorf</td><td>022470051D</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头：10 &amp;mu;L，200 &amp;mu;L，1 mL</td><td>Eppendorf</td><td>F144054M</td><td></td></tr><tr><td>移液器（200 &amp;micro;L)(Ergofit)&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-146-679</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（100×15 mm）</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>马铃薯葡萄糖琼脂（500g）</td><td>Becton Dickinson&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BD213400</td><td></td></tr><tr><td>加强型珠管（2 mL）</td><td>Omni International</td><td>19-660</td><td></td></tr><tr><td>加强型珠管（7 mL）</td><td>Omni International</td><td>19-651</td><td></td></tr><tr><td>Repipettor，Dispensette III（10 mL）</td><td>Brandtech</td><td>4701141</td><td></td></tr><tr><td>白藜芦醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5010-100MG</td><td></td></tr><tr><td>挖取（定制）</td><td>定制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>螺口瓶（250 mL）&amp;nbsp;</td><td>康宁（派热克斯）</td><td>1395250</td><td></td></tr><tr><td>硅胶，球形（200-400目）&amp;nbsp;</td><td>Supelco</td><td>97727-U</td><td>100 g</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>SPE萃取纯化用1.5 mL聚丙烯柱&amp;nbsp;</td><td>美国色谱耗材</td><td>SP-5122382</td><td></td></tr><tr><td>SPE 提取净化聚丙烯筛板（适用于 1.5 mL 微柱）</td><td>美国色谱耗材</td><td>SP-3119414</td><td></td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-385-351（Genesys 50）</td><td></td></tr><tr><td>试管</td><td>康宁（派热克斯）</td><td>982516X</td><td>16x125毫米</td></tr><tr><td>一次性试管（16x125 mm）</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-31</td><td></td></tr><tr><td>试管（一次性）（150×250 mm）</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-34</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Vanquish DAD 检测器（UPLC）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>VF-D11-A-01</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Vanquish 荧光检测器（UPLC）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>VF-D51-A</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Vanquish 四元泵 F（UPLC）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>VF-P20-A</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Vanquish Split Sampler FT（超高效液相色谱）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>VF-A10-A-02</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20（聚山梨酯20）（酶级）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>4 mL 小瓶盖</td><td>Fisher Scientific</td><td>C4015-75A</td><td></td></tr><tr><td>小瓶盖（自动进样器用）</td><td>Fisher Scientific</td><td>C4010-60A</td><td></td></tr><tr><td>小瓶 &amp;amp; caps (16 mL)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>B7800-4</td><td></td></tr><tr><td>玻璃瓶（4 mL）</td><td>Fisher Scientific</td><td>C4015-1</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯小瓶（自动进样器用）（400 mL）</td><td>Fisher Scientific</td><td>C4010-11</td><td></td></tr><tr><td>水，Optima&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-4</td><td></td></tr></tbody></table>

基于非破坏性spe-uplc法对单粒花生（arachis spp.）种子中黄曲霉毒素和芪类植物抗毒素的定量分析

Non-destructive SPE-UPLC-based Quantification of Aflatoxins and Stilbenoid Phytoalexins in Single Peanut (Arachis spp.) Seeds

黄曲霉毒素是一些真菌物种产生的高致癌性次级代谢产物，尤其是Aspergillus flavus。黄曲霉毒素常污染包括花生在内的多种具有重要经济价值的农产品，对人类和动物健康构成严重威胁。由于栽培花生遗传基础狭窄，其对真菌病原体的抗性有限。因此，许多对Aspergillus具有耐受性的野生花生物种已被科学家广泛研究，作为抗病性的潜在来源。
探索植物种质资源对黄曲霉毒素的抗性具有挑战性，因为黄曲霉毒素的积累不符合正态分布，这就要求分析数千粒单粒花生种子。充分水合的花生（花生属 spp.) 种子在被感染时 曲霉属 物种能够产生具有生物活性的芪类化合物&#160;（芪类化合物），被认为是一类具有防御功能的植物抗毒素。花生芪类化合物能够抑制真菌生长及黄曲霉毒素的产生。因此，对同一花生种子中芪类化合物进行分析，对于阐明种子对真菌侵染的抗性或敏感性机制至关重要 曲霉属 侵染。目前发表的方法中，尚无一种能够对黄曲霉毒素和/或芪类植物抗毒素进行单粒种子分析。
我们尝试满足对一种环境友好、耗材廉价且具有高灵敏度和选择性的方法的需求。此外，该方法具有非破坏性，仅使用种子的一半，而保留包含胚轴的另一半完整无损。这种技术使得用于黄曲霉毒素和芪类化合物分析的同一颗种子仍可继续萌发并生长至花生植株完全成熟。该方法中整合的关键步骤——人工接种Aspergillus真菌——是一个耗时较长且劳动密集型的限制性环节，相较于方法中的其他步骤需要更多时间和人力。该方法已被用于对野生Arachis种质资源的探索，以鉴定对Aspergillus具有抗性的物种，并用于发现和表征对该真菌病原体具有遗传抗性的新资源。

在种子中定量黄曲霉毒素的所开发方法是评估野生花生种质对黄曲霉毒素积累抗性整个流程的核心。定制包装的微型层析柱和滤膜显著节约成本，并因无需大量溶剂、昂贵且不必要的0.22或0.45 µm商用滤器以及泵送装置而使整体操作更为简便。该黄曲霉毒素分析方法在1.0–50.0 ng/g的测试范围内，对研磨种子中的黄曲霉毒素具有高回收率、准确性和精密度，如表1所示。高度污染的样品被稀释至线性检测范围内的数值。图5C显示了四种主要黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2在5分钟洗脱时间内实现基线分离的结果，这是可接受的，因为花生种子的真菌接种挑战才是该流程的限速步骤，而非UPLC分析。
该方法具有足够的灵敏度，黄曲霉毒素B1的定量限为2 pg（图5D）。提取物的高纯度使得黄曲霉毒素的定量结果明确可靠，如从野生花生属（Arachis）物种田间收获种子的纯化提取物的UPLC图谱所示（图5E）。相比之下，先前发表的微型柱方法29在处理受真菌侵染的花生种子时，无法达到令人满意的纯度（图5F），而本研究所提出的方法则表现出更优的纯化效果（图5G）。从图5F可以明显看出，由于存在高浓度的干扰杂质，黄曲霉毒素B2、G1和G2难以被可靠地检测和定量；其中许多杂质在黄曲霉毒素之后洗脱，主要为芪类植物抗毒素和真菌代谢产物。相反，图5G展示了镁硅胶柱在去除黄曲霉毒素组分中杂质方面的高效性。蓝色色谱图代表使用1 mL甲醇-水（90:10）混合液从柱上洗脱下来的干扰杂质；黑色色谱图显示了未受干扰的黄曲霉毒素M1和B1的峰。该色谱图对应于受侵染的野生种籽提取物，其中黄曲霉毒素B1的含量为48 ng/g。
花生植保素的定量分析是对同一样品中黄曲霉毒素分析的有益补充，该样品可能来自田间的天然种子，也可能是经真菌侵染处理的种子。 图5H 展示了来自经真菌侵染处理的花生种子中防御性芪类化合物的典型色谱图。这些化合物的分离使用了与黄曲霉毒素分析相同的分析柱。该色谱柱及选定的色谱条件可实现各峰的良好分离，从而对芪类化合物进行可靠的定量分析。在侵染处理的种子中评估黄曲霉毒素与植保素之间的关系超出了本研究的范围，本文仅建议该方法作为一种潜在的研究工具。该方法已在作者实验室中使用多年，实践证明具有良好的应用价值。

<img alt="图6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig6.jpg" /> 
图6：&#160;主要黄曲霉毒素和花生芪类植物抗毒素的结构。（A）主要黄曲霉毒素的结构：1，B1；2，B2；3，G1；4，G2。&#160;（B）主要花生芪类植物抗毒素的结构：6，白藜芦醇；7，花生四烯素-1；8，花生四烯素-2；9，花生四烯素-3；10，IPD（3′-异戊二烯基-3,5,4′-三羟基芪）；11，SB-1。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">加标水平a 
			(ng/g)</td>
			<td colspan="4">黄曲霉毒素</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B1</td>
			<td>B2</td>
			<td>G1</td>
			<td>G2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50</td>
			<td>85.87 (0.97)</td>
			<td>82.33 (0.67)</td>
			<td>86.63 (2.89)</td>
			<td>84.01 (0.86)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>91.43 (2.76)</td>
			<td>87.32 (0.47)</td>
			<td>88.08 (2.08)</td>
			<td>87.73 (0.77)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>81.21 (3.16)</td>
			<td>85.33 (1.98)</td>
			<td>81.76 (4.66)</td>
			<td>88.46 (3.24)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：使用弗罗里硅土柱和1.2 mL黄曲霉毒素洗脱液混合物从花生种子中回收黄曲霉毒素的结果。 [平均值（标准差），%；n = 5]。将50 g不含黄曲霉毒素的Georgia 06G花生品种粉碎样品，使用微量注射器均匀添加浓度为50、5或1 ng/g的黄曲霉毒素储备溶液，在室温下放置16小时。a 加标水平针对黄曲霉毒素B1和G1给出；对于黄曲霉毒素B2和G2，应使用0.33的乘数进行换算。

我们展示了一种利用超高效液相色谱法对单粒花生种子中黄曲霉毒素和芪类植物抗毒素进行中通量定量分析的方法。该方法专为野生种 花生属 由产毒黄曲霉菌挑战的物种 曲霉属 物种

基于非破坏性SPE-UPLC法对单粒花生（Arachis spp.）种子中黄曲霉毒素和芪类植物抗毒素的定量分析

黄曲霉毒素是一些真菌物种产生的强致癌性次级代谢产物，尤其是黄曲霉（Aspergillus flavus）。黄曲霉毒素常污染……

本研究的目标是开发一种定量检测数千粒花生种子中黄曲霉毒素和防御性植物抗毒素的方法，以探索野生花生种质资源，鉴定对曲霉菌具有抗性的物种，并确定和表征对该真菌病原体具有遗传抗性的新来源。我们的研究团队发现，鉴定不积累黄曲霉毒素的花生种质资源最有前景的方法是对每粒种子进行整体分析，包括其转录组学、基因组学、植物抗毒素和霉菌毒素谱的分析。我们已建立了适用于野生和栽培花生种子分析的实验方案，即利用单粒种子的四分之一进行化学成分分析。开发高通量方法，用于花生种子样品中植物抗毒素的有效挑战、提取及准确定量。我们已发现多种花生植物抗毒素，并建立了高效且低成本的黄曲霉毒素分析方法，以及筛选黄曲霉毒素积累减少或无积累的花生种质资源的方法。这些方法包括基因分型和种子活力测定。在30摄氏度下将产黄曲霉毒素的黄曲霉（Aspergillus flavus）NRRL 3357菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基中培养六天后，用含有Tween 20的10毫升水从试管中洗脱真菌孢子。将试管涡旋振荡20秒。将真菌孢子悬液通过置于漏斗中的玻璃棉进行过滤，并使用涡旋后的滤液进行稀释。取100微升滤过后的悬浮液，用9.9毫升水稀释。涡旋混匀后，使用血细胞计数板对孢子进行计数。根据屏幕上的公式，计算将斜面培养物的原始悬浮液稀释至每微升含1,000个孢子所需加入的水量。将一份体积的原始悬浮液加入到计算量的水中。接着，轻轻敲开花生荚果，去除果壳。将种子放入无菌烧杯中。加入0.05%过氧化氢溶液至烧杯体积的70%，使种子吸水浸泡3小时。倒去种子中的过氧化氢溶液，加入约三倍体积的80%乙醇水混合液以浸没种子。孵育1分钟后，用等体积的无菌蒸馏水冲洗种子两次。向烧杯中加入五倍体积的3%过氧化氢溶液，静置五分钟。倒出过氧化氢溶液后，用等体积的无菌水冲洗种子两次。将一张直径90毫米的滤纸放入培养皿盖内，并加入一毫升无菌水润湿滤纸。将盖子盖在培养皿上。将种子放在无菌的纸巾上。使用镊子去除种子的种皮。将去种皮的种子立即放入培养皿中，以避免脱水。切取约三分之一含有胚轴的种子部分。将种子分离成子叶，并使用锋利的钻头在每片子叶外侧中部钻约1.5至2毫米深的小孔。将四到六片钻孔的种子放置于含1.5%琼脂的培养皿中。使用10微升移液器，向每半个子叶片的钻孔处加入2微升孢子悬浮液。盖上培养皿后，在30°C、避光条件下孵育72小时。在花生种子接种黄曲霉孢子并孵育后，使用镊子将种子碎片从琼脂上取出。将种子碎片放入已标记的7毫升珠磨管中，管内含有13颗氧化锆陶瓷珠。根据种子大小，为提取植物抗毒素和黄曲霉毒素，向珠磨管中加入2或4毫升甲醇-水混合液，并以每秒5.5米的速度研磨45秒。然后，在1,860 G条件下离心3分钟，并将上清液收集到一个新的小瓶中。进行黄曲霉毒素分析时，使用一个以90度角切割的玻璃棒，将聚乙烯多孔烧结滤板插入一个1.5毫升的聚丙烯柱中。用自制的小勺向柱中加入50毫克硅酸镁。 用一个相同的烧结滤片封住柱子，并用玻璃棒轻轻下压。将0.5毫升上清液加入自制填装的微型柱中，依靠重力使提取物流入一个4毫升的玻璃小瓶中。向柱中加入1毫升甲醇-水混合液，通过重力作用将杂质冲洗到同一个玻璃小瓶中。弃去小瓶中合并的洗脱液后，向柱中加入 1.2 毫升丙酮、乙腈和水、88% 甲酸的混合液，将黄曲霉毒素组分洗脱至洁净的玻璃小瓶中。在 45 摄氏度的加热模块中，用氮气流吹干小瓶中的溶剂。溶剂蒸发后，盖上瓶盖，并在碎冰中冷却一分钟。将自制的巴斯德移液管滤器放入一次性试管中，并置于冰上以减少过滤过程中的蒸发。用精确量取的0.25至1.0毫升甲醇-水混合液溶解干燥残留物。涡旋混匀后，取0.2毫升等分试样转移至滤器中。使用氮气加速过滤，将滤液收集至400微升的自动进样瓶中。将自动进样瓶放入UPLC自动进样器中，并设置进样体积为0.1至3.0微升。对于植物抗毒素的检测，从7毫升离心管中吸取200微升上清液，转移至巴斯德吸管滤器中。过滤后，将带有聚四氟乙烯隔垫的匹配瓶盖盖在小瓶上。针对黄曲霉毒素的分离，采用水、甲醇和乙腈按特定百分比组成的梯度洗脱程序，并设定运行时间为9.5分钟。设置流速为0.45毫升/分钟，运行时间为9.5分钟。在系统柱加热器中，将色谱柱温度设置为 40 摄氏度。为定量黄曲霉毒素，将激发波长和发射波长分别设置为 362 和 440 纳米。然后采用校准曲线法及 UPCL 软件手册，进行分析以测定测试样品中的黄曲霉毒素浓度。对于二苯乙烯类化合物的分离，使用由水、甲醇和88%甲酸组成的流动相梯度洗脱程序，并采用特定的百分比条件和时间。设定流速为0.5毫升/分钟，运行时间为12分钟。采用标准曲线法测定二苯乙烯类化合物的浓度，并将待测样品的色谱峰面积与纯品标准品进行比较。基于超高效液相色谱的黄曲霉毒素定量方法实现了对黄曲霉毒素B1的高灵敏度定量，每针进样的检测限为2皮克。对采自野生花生种种子的纯化提取物进行检测，结果显示黄曲霉毒素的定量结果明确可靠。与先前方法相比，氧化镁-硅胶柱法能有效去除黄曲霉毒素组分中的杂质，表现出更高的定量效率。此外，该方法还有助于花生植物抗毒素的定量分析。

non-destructive-spe-uplc-based-quantification-aflatoxins-stilbenoid

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基于 SPE-UPLC 的单花生 （Arachis spp.） 中黄曲霉毒素和二苯乙烯类植物抗毒素的无损定量分析种子

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