13C6-葡萄糖标记结合液相色谱-质谱法：植物次生代谢物合成中主要器官的鉴定
2024年3月22日
结合液相色谱-高分辨质谱法的13C6-葡萄糖标记方法具有广泛适用性，为今后研究药用植物中次生代谢物合成所涉及的主要器官和代谢途径，以及次生代谢物的综合利用奠定了基础。
我们的目标是设计一种通用的三步法，用于鉴定药用植物中负责产生病理性代谢物的器官。该方法结合了特定的6-葡萄糖标记、液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）以及疾病模型，提供一种经济且可行的方法，以确定这些重要化合物的合成部位。
近期的研究进展主要集中在代谢物动态、蛋白质定量以及复杂生物基质的探索。多模式质谱分析结合核磁共振、光谱学、生物信息学，以及数据分析工具，可推动化学同位素标记技术的发展。本实验的主要挑战在于基质效应。
样品中其他元素或化合物的信号可能会干扰碳同位素的精确测定，导致产生可能扭曲结果的测量效应。我们的研究结果为多项新的科学探索开辟了途径，包括代谢合成机制、基因调控、环境因素影响、器官间物质转运以及农业实践。首先，将1.26克霍格兰粉和0.945克硝酸钙溶于4升水中。
将清洗后的两年生 PPY 幼苗浸入 1 × 4 标准浓度的霍格兰营养液中，持续三天。接着，将 0.2 克碳同位素 13 葡萄糖粉末加入含有 100 毫升纯化水的烧杯中。然后设置水培箱和氧气泵。
设置四个处理组，第一个为不饲喂处理，第二个为叶片饲喂处理，第三个为根茎饲喂处理，第四个为茎部切口饲喂处理。处理组1和处理组2的幼苗均在常规霍格兰营养液中培养。在处理组2的叶片上，分别于早晨、下午和晚上各喷施一次5毫升0.2%碳同位素¹³C标记的葡萄糖溶液。
对于处理组3和4，将幼苗转移至含有0.2%碳同位素13葡萄糖的霍格兰营养液中。对于处理组4，使用解剖刀从茎中部切断，保持维管束完整。让幼苗标记三天，每1.5天更换一次营养液。
标记完成后，彻底清洗收集的植物器官以去除表面杂质。将各处理组的叶片、茎、根茎和根分别收集，并将收集的样品放入相应的信封中。
将标记好的信封放入电热恒温鼓风干燥箱中。使用全自动样品快速研磨仪，将干燥的样品研磨成细粉。称取每种样品粉末30毫克，转移至含有2毫升75%乙醇水溶液的离心管中。
使用数控超声波清洗器在 25 摄氏度条件下进行 20 分钟的超声提取。最后一次提取完成后，将所有溶液合并。称取三份平行样品。
接下来，将氮气干燥后的样品溶解于色谱级甲醇中，定容至1毫升。最后，在进行质谱分析前，通过0.22微米的有机相滤膜过滤样品。处理组3和处理组4的碳13与碳12同位素比值明显高于处理组2。
概述
本研究提出了一种用于鉴定药用植物中负责产生次生代谢物器官的新方法。通过将13C6-葡萄糖标记与液相色谱-高分辨质谱联用，旨在加深对代谢物合成途径的理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 植物生物学
背景
- 次生代谢物在植物防御和人类健康中发挥着关键作用。
- 了解其合成途径有助于更好地将其应用于医药领域。
- 目前研究这些代谢物的方法往往存在局限性。
- 质谱技术的进步为分析这些物质提供了新的机遇。
研究目的
- 建立一种用于鉴定代谢物产生器官的通用方法。
- 将葡萄糖标记与先进的质谱技术相结合。
- 促进对代谢物动态变化及其生物学意义的研究。
使用方法
- 13C6-葡萄糖标记技术。
- 液相色谱-高分辨质谱法（LC-MS）。
- 复杂生物基质的分析。
- 用于化学同位素标记测量的数据分析工具。
主要结果
- 鉴定参与次生代谢物合成的关键器官。
- 深入了解代谢物生成的动态过程。
- 建立一种适用于多种药用植物的通用方法。
- 为未来深入探索代谢途径的研究提供潜力。
结论
- 该方法的建立为未来的研究提供了基础。
- 它增强了我们对次生代谢物合成的理解。
- 该方法具有可及性，可在植物生物学中广泛应用。
常见问题
行业高管相关性
准确鉴定负责次生代谢物合成的植物初生器官，对于降低天然产物药物研发中靶点选择的风险并优化资源分配至关重要。将13C6-葡萄糖标记与液相色谱-质谱联用（LC-MS）相结合，可实现对生物合成途径的精确定位，从而提高对特定器官代谢物生成的预测可靠性。该方法增强了植物源治疗药物从早期发现到临床前评价阶段的转化连续性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够直接检测器官特异性生物合成活性，用于功能靶点的验证。
- 通过明确关键次级代谢产物的空间来源，支持作用机制层面的风险评估。
- 通过区分具有生产性与非生产性的组织来源，促进项目组合的优先级筛选。
筛选与检测方法开发
- 为下游代谢物定量分析流程制备经过验证的植物器官系统。
- 标准化同位素标记和液相色谱-质谱（LC-MS）检测，以实现可重复的检测方法开发。
- 实现在不同实验处理间对代谢物合成的可靠比较。
转化与临床前研究
- 将药用植物中生物合成途径的绘制与疾病相关的代谢物靶标相结合。
- 实现从器官水平发现到生物活性化合物临床前验证的连贯性研究。
- 支持基于风险评估的植物来源先导候选物的推进决策。
流程与工作流整合
该方法将同位素标记与液相色谱-质谱分析技术应用于植物源药物候选物早期发现与先导化合物鉴定的交汇环节。
- 发现生物学： 实现对器官特异性代谢物合成及通路定位的假设验证。
- 筛选： 提供定量、可重复的同位素比值输出，用于评估检测的准备就绪状态。
- 分析： 提供高分辨率的13C/12C比值及同位素离子峰分布测量。
- 转化研究： 将生物合成图谱与药理活性代谢物的临床前评价相连接。
- 企业级复用： 建立可扩展、可适应多种药用植物系统的标准化工作流程。
运营与企业影响
- 科学价值：提高器官水平靶点验证的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：标准化同位素标记和液相色谱-质谱（LC-MS）方案，以实现可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过聚焦具有高效生物合成能力的组织，优化决策流程并提升资本使用效率。
- 项目组合影响：基于已验证的生物合成来源，实现对植物来源候选分子的风险校准优先排序。
实施注意事项
- 需要具备稳定同位素标记和液相色谱-质谱分析的专业知识。
- 需要能够使用高分辨质谱仪及相关样品制备基础设施。
- 需要跨团队对标记、提取和分析流程进行标准化。
- 针对不同植物物种或代谢物类别可能需要进行方法调整。
- 基质效应和样品基质复杂性可能影响同位素比率的准确性。
