Name: 用于单分子相关力和荧光显微镜的原位核小体组装 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T12:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: 了解原位核小体组装技术，用于单分子相关力和荧光显微镜研究染色质系统。该方法可在天然DNA序列上快速组装核小体，显著减少试剂用量和制备时间，为染色质动力学和蛋白质相互作用研究提供高效工具。

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G. N. L. C. 承认获得美国国立卫生研究院（NIH）下属国家心理健康研究所的支持，资助编号为 F31MH132306。S. L. 获得罗伯逊基金会、国际Rett综合征基金会以及美国国立卫生研究院（NIH）（资助编号 R01GM149862）的支持。

本研究中所用试剂和设备的详细信息见材料表。
1. 生物素标记DNA的制备
<ol>
	<li>准备一个120 µL的反应体系，包含20 µg的λ DNA、33 µM的生物素标记dCTP、33 µM的生物素标记dUTP、33 µM的生物素标记dATP、33 µM的dGTP、10单位的Klenow酶以及1× NEB Buffer 2。 
	注意：本实验步骤特别使用线性双链（ds）、无甲基化的噬菌体λ基因组DNA（48,502 bp），其具有12个核苷酸&#160;（nt）的5'单链（ss）DNA突出端23。然而，该方案可调整用于任何长度或序列的线性双链DNA，只要其含有至少数个核苷酸的5'单链突出端，突出端的长度和核苷酸序列将决定在每个末端安装的生物素化核苷酸数量，以用于后续在光镊之间进行连接。此外，反应体系可按比例缩小。例如，可在30 µL反应体系中使用5 µg DNA。另外，通过此方法生成的DNA底物不具有扭转约束。如需构建具有扭转约束的DNA，可参考已发表的文献24,25。</li>
	<li>在室温下孵育反应体系15分钟。</li>
	<li>加入10 mM EDTA，并在75 °C下孵育20分钟。</li>
	<li>进行乙醇沉淀以获得生物素化DNA产物。
	<ol>
		<li>加入0.1倍体积的3 M醋酸钠和3倍体积的预冷100%乙醇。在-20 °C下静置至少1小时至过夜。在4 °C下以13,500 × g离心30分钟。</li>
		<li>小心移除上清液，避免扰动沉淀，加入1 mL 75%乙醇。在4 °C下以13,500 × g离心1分钟。</li>
		<li>重复上清液移除、乙醇添加和离心步骤。</li>
		<li>小心彻底移除所有上清液，将沉淀在空气中干燥10分钟。将沉淀溶解于100–200 µL TE缓冲液或ddH2O中（可于37 °C孵育以促进溶解）。使用Nanodrop分光光度计测定浓度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 流动池中通道的制备
注意：本实验步骤基于一种市售的微流控芯片（见材料表），但也可适配于任何配备多通道流动池的单分子毛细管自由流电泳仪（smCFFM）。
<ol>
	<li>钝化通道（ch.）4 和 5（或任何将用于装载蛋白质的ch.）（通道示意图见图 1A）。向每个通道加入 500 µL 的 0.1% BSA，以 0.8 bar 的压力（对于内径为 0.010 英寸的管路，流速约为 0.45 µL/s）流动 8 分钟。移除溶液。</li>
	<li>向每个通道加入 500 µL 的 0.05% Pluronic-F127，以 0.8 bar 的压力流动 8 分钟。移除溶液，并用 1x PBS 冲洗注射器。向每个通道加入 2 mL 的 1x PBS，以 0.8 bar 的压力流动 27 分钟。</li>
	<li>涡旋混合链霉亲和素包被的微珠储备液（本实验使用 3.13 µm 直径的微珠），取 2.15 µL 微珠溶液加入 1 mL 的 1x PBS 中。将混合液加入ch. 1。 
	注意：链霉亲和素包被微珠的尺寸和浓度可根据用户需求进行调整。</li>
	<li>将 30–80 ng 的生物素化 λ DNA 加入 1 mL 的 1x PBS 中。将混合液加入ch. 2。 
	注意：生物素化 DNA 的浓度可根据用户需求进行调整。DNA 用量增加会提高形成 DNA 悬挂链的频率，但也会增加同时悬挂多个 DNA 分子的几率，从而增加实验难度。</li>
</ol>
3. Nap1介导的 原位 核小体形成
<ol>
	<li>加入 500 µL 无蛋白&#160;图像缓冲液至 第3章. 
	注意：缓冲液的成分在 第3章 具有灵活性，应适用于核小体及特定目标蛋白。用户可选择性地添加抗氧清除系统以减少荧光染料的光漂白，和/或添加竞争性DNA以去除未正确包裹成核小体的组蛋白八聚体。</li>
	<li>加入 2 nM S. cerevisiae Nap1 与 2-5 nM LD655 标记的 H4 组蛋白八聚体（HO）加入 500 µL 1x HR 缓冲液中18添加至 第4章. 
	注意：组蛋白八聚体和Nap1可从商业途径购买，也可在实验室内部制备（参见 材料表。每个锚定DNA上形成的核小体数量取决于八聚体的浓度以及在此通道中的孵育时间。通过调节这两个参数中的一个或两个，可以调控用户期望的以及近似的核小体密度。此外，用户可选择使用其偏好的荧光染料对组蛋白八聚体进行标记。</li>
	<li>可选：加入染色质结合蛋白或其他目的蛋白 第5章 在适当的缓冲液中。</li>
	<li>以1.0 bar的压力使所有通道流过样品约30秒（在当前实验设置下约为0.55 µL/s），以冲洗流路通道。</li>
	<li>将流速设定为 0.2 bar（在当前实验装置中约为 0.16 µL/s）。移动光镊（OTs）至 第1章 并捕获一对合适的链霉亲和素包被的磁珠。</li>
	<li>将 OTs 移至 第3章，对珠对进行力校准，打开红色共聚焦激光（或其他选择的激光线），并校准成像区域。</li>
	<li>将流速设定为 0.2 bar，并移动 OTs 至 第2章捕获生物素标记的DNA。</li>
	<li>将 OTs 移动至 第3章 并停止流动。增加光镊之间的距离以拉伸DNA，同时监测相应的力-距离（FD）曲线，以确认存在单根DNA连接（而非多根连接）。该曲线应符合给定轮廓长度下双链DNA的蠕虫状链模型。26.</li>
	<li>调整光镊之间的距离，使DNA张力读数约为1 pN。 
	注意：1 pN 的张力足够低，可使核小体保持被 DNA 缠绕的状态27 但足以使整个DNA分子位于线扫描成像轴范围内。</li>
	<li>打开线扫描，开始使用红色激光采集明场图像。 
	注意：可根据用户偏好获取DNA系留的显微图像或二维扫描图。</li>
	<li>将 OTs 移动至 第4章 关闭流动后，在Nap1的促进下，组蛋白八聚体（HOs）实时加载到DNA上并缠绕形成核小体。核小体的加载可通过DNA上出现的荧光轨迹在kymograph中可视化。同时，当光镊（OTs）位置保持恒定时，随着更多组蛋白八聚体加载到DNA上，可通过检测作用力的增加来实时监测核小体的形成过程。 
	注意：在核小体形成步骤期间，可关闭荧光激发激光以避免荧光染料发生光漂白。此外，使用本方案时可能发生组蛋白八聚体与DNA的非特异性结合，即八聚体未缠绕形成核小体的情况。此类结合事件不会产生 &#34;撕裂&#34; 当DNA被拉伸时（如下文“解离核小体”（步骤4）方案所述），有时会被温和的缓冲液流冲走，特别是当缓冲液中含有游离的竞争性DNA时。</li>
	<li>当形成大约所需数量的核小体时，开始收集数据。</li>
</ol>
4. 解离核小体
<ol>
	<li>完成步骤2和步骤3。</li>
	<li>在形成含有核小体的DNA系链后，将光镊移动至ch. 3。</li>
	<li>通过减小光镊之间的距离，直至力接近于零，以准备核小体解缠实验，并将力归零。</li>
	<li>以0.1 µm/s的恒定速度开始将光镊1远离光镊2移动。在延时图像（kymograph）中，光镊1中的微球将视觉上逐渐远离光镊2中的微球。在力-距离（FD）曲线中，随着距离增加，力将上升。当核小体解缠时，会在力值约8–37 pN处出现&#34;撕裂&#34;或跃迁现象，标志着单个核小体内部缠绕结构的解开27,28,29。 
	注意：解缠发生的力值取决于拉伸速率，这是非平衡过程的典型特征。有时多个核小体会同时解缠，导致FD曲线上跃迁对应的距离变化更大。此外，在本实验条件下，核小体外层缠绕结构的解开不易被观察到（详见讨论部分）。</li>
</ol>
5. 可视化蛋白质与染色质的结合
<ol>
	<li>完成步骤2和步骤3。</li>
	<li>向ch. 5中的500 µL成像缓冲液中加入10 nM的Cy3标记连接组蛋白H1.4。 
	注意：可根据需要将任何目标蛋白以选定浓度加入ch. 5（通常低于100 nM，以便进行单分子成像）。</li>
	<li>在形成包含核小体的DNA拴系结构后，除红色激光外，开启绿色激光，并将光镊移至ch. 5，以实时成像H1与染色质的结合过程。</li>
	<li>持续采集延时图像（kymographs）或扫描数据，直至获得足够的统计量（至少约10–20张kymographs，具体数量取决于事件发生频率和实验难度）。</li>
</ol>

In Situ Nucleosome Reconstitution for Single-Molecule Studies

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<li>Leicher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+nucleic+acid+binding+and+coacervation+by+linker+histone+H1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-stranded nucleic acid binding and coacervation by linker histone H1.</a> Nat Struct Mol Biol. 29, 463-471 (2022).</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

本方案在核小体重建方面具有多项优势，包括减少试剂用量和操作时间，同时能够实现分子伴侣依赖性的核小体形成，且适用于任意（潜在天然的）DNA序列。此外，原位（in situ）方法简化了实验流程，并便于向单分子水平的核小体力学及蛋白质-染色质相互作用检测过渡。然而，该方法的局限性包括无法精确控制核小体在DNA上的定位（即使引入强核小体定位序列），以及难以精确调控每条DNA锚定链上形成的核小体数量（尽管可通过标准化实验流程进行经验性优化）。因此，采用该方法的研究者是以牺牲核小体定位和密度的精确控制为代价，换取更简便的操作流程和更低的试剂需求，具体选择应根据实验的具体需求而定。还需注意的是，由于锚定DNA较长（约48.5 kbp）以及缓冲液条件的限制，当前方案无法解析DNA的外圈结构32。若需获取有关DNA外圈结构以及核小体间堆叠的信息，使用者可选择缩短DNA长度，在DNA上加载更高密度的核小体，和/或采用盐梯度透析法，将核小体定位在由规则连接子长度分隔的强定位序列上。最后，组蛋白八聚体与DNA之间可能发生非特异性结合；因此，在结果解读时需同时考虑荧光信号和力学信号。
当前方案的一个关键方面是确保组蛋白八聚体具有较高的荧光标记效率（如果需要进行可视化），以便绝大多数甚至全部核小体均可被直观检测。另一个关键方面是确认用户已选择适合成像通道的缓冲液，该缓冲液需与核小体及任何其他目标蛋白相容。用户可根据需要对本方案进行修改，包括将荧光染料偶联至不同的组蛋白（参见文献33,34中使用该方法构建标记H3或H2B的核小体的示例）、选用其他荧光染料、引入不同序列和长度的DNA连接臂、添加耗氧系统以延长荧光染料的寿命、选择不同尺寸的微珠，以及采用替代的DNA-微珠偶联系统（例如地高辛-抗地高辛抗体连接）。
综上所述，所述方法为单分子光镊-荧光联用技术（smCFFM）提供了一种便捷且多功能的途径，可用于生成含核小体的连接结构，进而轻松研究生物学中一系列以染色质为核心的问题。适用的研究领域包括由组蛋白变体和翻译后修饰调控的染色质力学特性、染色质结合蛋白的生物物理相互作用及其动力学，以及由核小体介导的高级结构组装过程（如生物分子凝聚）35,36,37,38。

真核生物染色质的基本包装单位是核小体，其中约147个碱基对（bps）的DNA缠绕在一组核心组蛋白八聚体上1,2。除了基因组包装功能外，核小体结构还构成了另一层丰富的生物物理调控机制，染色质结合蛋白在执行其多种功能时可利用这一结构3,4。由于这些单位在极小尺度上发挥作用（例如，纳米级长度、皮牛顿级作用力），实验上获取和测量核小体的物理特性一直面临技术挑战，因此对其探测需要足够的灵敏度和精度，以有效揭示其功能机制。此外，染色质结合蛋白通常与其底物发生瞬时相互作用，而大多数整体测量方法缺乏足够的时间分辨率来阐明这些相互作用的动力学过程5。幸运的是，单分子技术的发展使得实时观察和操控单个蛋白质及其相互作用成为可能，从而揭示了发生在纳米尺度上的分子事件的机制信息6。特别是，单分子关联力与荧光显微技术（smCFFM）结合了高分辨率荧光检测与力学操控工具，能够同时解析染色质及染色质-蛋白质复合物的力学特性、组成成分及其协调行为7,8。
在特异性采用 smCFFM 的情况下 &#34;光镊&#34; 作为力操控方法，使用高度聚焦的激光在三维空间中捕获介电物体，通常是微米级的塑料小球9一种生物聚合物，例如一段DNA，可以偶联到微珠上（通过，例如链霉亲和素-生物素、地高辛-抗地高辛抗体连接），用户既可施加校准后的力，也可测量系统产生的力/位移10添加的荧光模块可实现同步多色荧光成像，用于追踪蛋白质组成与行为。
用于smCFFM的核小体重建主流方法是通过盐透析在定制DNA模板上组装核小体11,12,13。该方法中，将纯化的组蛋白八聚体与DNA模板在高盐缓冲液（约1 M氯化钠）中孵育，随着盐分缓慢透析去除，核小体会以序列依赖的方式自发地在DNA上组装14,15。因此，通常会在DNA模板中引入强核小体定位序列（例如Widom 60116、X. laevis 5S rDNA17），以生成定制的核小体阵列。尽管这一成熟方法能够精确控制DNA上核小体的位置和数量，但仍存在若干缺点：（1）引入强核小体定位DNA序列可能导致形成人工稳定化的核小体，从而影响染色质结合蛋白的活性；（2）通过盐透析形成核小体的过程需要大量DNA和八聚体；（3）该过程耗时长达一天至数天，且需投入大量精力优化DNA与八聚体的比例，以获得理想的核小体阵列密度。
在本文中，我们描述了一种在DNA上组装核小体的替代方法 原位 使用重组组蛋白伴侣蛋白Nap1，在单分子相关力与荧光显微镜下模拟体内核小体形成的生理途径18,19,20,21,22该方法可在几分钟内实现非特异性DNA序列上的核小体组装，轻松调节核小体密度，并显著减少试剂用量。此外，还可形成核小体DNA锚定结构 原位 简化了实验流程，并提供了内置的单分子可视化与操控便利性。因此，当无需严格要求核小体精确定位时，本方案为研究核小体力学特性或染色质上蛋白质行为提供了一种实用选择，我们同时描述了相关示例检测方法。

<table><tbody><tr><td>1x HR 缓冲液</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>30 mM&amp;nbsp;tris&amp;nbsp;acetate pH 7.5, 20 mM 醋酸镁, 50 mM 氯化钾, 0.1 mg/mL BSA&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1x PBS（磷酸盐缓冲盐水）</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>137 mM 氯化钠, 2.7 mM 氯化钾, 10 mM 磷酸氢二钠, 1.8 mM 磷酸二氢钾&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Millipore Sigma</td><td>AX0074-6</td><td>用于配制 tris acetate</td></tr><tr><td>Biotin-11-dUTP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-803-BIOX-S</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-14-dATP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-835-BIO14-S</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-14-dCTP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-956-BIO14-S</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9418-50G</td><td>溶于 H2O 并经 0.22 µm 滤膜过滤</td></tr><tr><td>Cy3 马来酰亚胺单反应性染料</td><td>Cytiva</td><td>PA23031</td><td>带有马来酰亚胺功能基团的 Cy3 荧光染料</td></tr><tr><td>dGTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0442S</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5425 R</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-414-051</td><td>带制冷功能的台式离心机</td></tr><tr><td>乙醇，纯级</td><td>Millipore Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Millipore Sigma</td><td>E9884</td><td>溶于 H2O 配制成 0.5 M 溶液</td></tr><tr><td>人组蛋白八聚体（H4, L50C；H2A, K119C）&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>重组组蛋白蛋白及携带标记突变的组蛋白均按先前所述方法在本实验室纯化（参见参考文献 33, 34, 35, 36）。简言之，重组组蛋白在 BL21 (De3) pLySS 细胞（Promega）中表达。超声破碎后收集包涵体，并在变性条件下提取组蛋白。组蛋白被透析至缓冲液 A（7 M 尿素, 10 mM tris 盐酸盐 pH 8.0, 100 mM 氯化钠, 1 mM EDTA, 和 5 mM 2-巯基乙醇）中，然后加入装有 Q Sepharose Fast Flow（Cytiva）的重力柱。流出液再加入装有 SP Sepharose Fast Flow（Cytiva）的重力柱，通过添加含 600 mM 氯化钠的缓冲液 A 洗脱组蛋白。携带标记突变的组蛋白（H4, L50C；H2A, K119C）在纯化后，使用马来酰亚胺功能化染料（Cytiva, Lumidyne）以 20:1 的染料与蛋白摩尔比进行偶联（参见参考文献 33, 34）。组蛋白八聚体通过在变性条件下等摩尔混合各野生型或荧光标记组蛋白，透析至含 2 M 氯化钠的高盐缓冲液中，随后按先前所述方法通过尺寸排阻色谱纯化（参见参考文献 36, 37）。此外，单个组蛋白蛋白或预制组蛋白八聚体也可商业购买（例如 Epicypher）。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>成像缓冲液</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>20 mM tris 盐酸盐 pH 8.0, 100 mM 氯化钠</td></tr><tr><td>Klenow 片段（3' 至 5' 外切酶缺陷型）</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>λ DNA（dam⁻, dcm⁻）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SD0021</td><td>无甲基化 &amp;lambda; DNA</td></tr><tr><td>LD655-MAL</td><td>Lumidyne Technologies</td><td>9</td><td>带有马来酰亚胺功能基团的 LD655 荧光染料</td></tr><tr><td>连接组蛋白 H1.4（A4C）</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>本实验室制备的纯化重组蛋白（参见参考文献 38）</td></tr><tr><td>LUMICKS C-Trap Dymo</td><td>LUMICKS</td><td>N/A</td><td>双光镊配置；仪器标准材料由制造商提供</td></tr><tr><td>醋酸镁溶液</td><td>Millipore Sigma</td><td>63052-100ML</td><td>用于配制 HR 缓冲液</td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td>随 Klenow 片段试剂盒提供</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Millipore Sigma</td><td>P2443-250G</td><td>溶于 H2O 并经 0.22 µm 滤膜过滤</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Millipore Sigma</td><td>P3911</td><td>用于配制 PBS 和 HR 缓冲液</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Millipore Sigma</td><td>P0662</td><td>用于配制 PBS</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;S. cerevisiae&lt;/em&gt; Nap1</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Nap1 按先前所述方法在本实验室纯化（参见参考文献 33, 34）。此外，Nap1 也可商业购买（例如 Active Motif）。</td></tr><tr><td>醋酸钠</td><td>Millipore Sigma</td><td>241245</td><td>溶于 H2O 配制成 3 M 溶液</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9888</td><td>用于配制 PBS 和成像缓冲液</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9763</td><td>用于配制 PBS</td></tr><tr><td>SPHERO 生物素包被微球（3.0–3.4 &amp;micro;m）</td><td>Spherotech</td><td>TP-30-5</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c 分光光度计</td><td>Fisher Scientific</td><td>ND2000</td><td>NanoDrop 分光光度计</td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>溶于 H2O 并调节至适当 pH；用于配制成像缓冲液和 tris acetate</td></tr></tbody></table>

原位核小体组装用于单分子关联力与荧光显微镜技术

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

核小体是真核生物染色质的基本单位，其生物物理特性及与染色质结合蛋白的相互作用已成为众多单分子研究的重点。在这些研究中，DNA上的核小体重建通常采用盐梯度透析法，该方法可精确控制沿DNA锚定链形成的核小体的位置和数量。然而，该方案耗时较长，且需要大量DNA和组蛋白八聚体作为输入材料。为了提供一种替代策略，本文描述了一种利用组蛋白伴侣蛋白Nap1的原位（in situ）核小体重建方法，适用于单分子力谱和荧光显微镜检测。该方法使用户能够在任意DNA模板上组装核小体，无需强核小体定位序列，可根据需求调节核小体密度，并减少试剂用量。原位（in situ）核小体的形成在数秒内完成，实验流程更简便，且可便捷地过渡到单分子测量。文中进一步介绍了两种下游检测方法的应用实例，用于探究核小体的力学特性以及可视化单个蛋白质在染色质上的行为。

使用步骤3中所述的装置（图1A），通过二维扫描中出现的红色荧光焦点（图1B，左）或在延时显微图（kymograph）上的轨迹（图1B，右），可观察到DNA连接链上核小体的形成。正确缠绕的核小体在共聚焦检测的衍射极限内（约300 nm）表现出随时间保持静止的荧光轨迹。值得注意的是，在衍射极限范围内彼此靠近形成的多个核小体在空间上无法分辨，会表现为更亮的焦点或轨迹。然而，通过对单个核小体轨迹的光漂白步数进行分析，常观察到1步（图1C）或2步（图1D）光漂白事件，结合本样品中H4蛋白约70%的标记率，表明这些焦点主要包含单核小体。此外，基于本实验条件下单个LD655荧光染料的平均光子计数，估算了每条核小体轨迹中标记H4蛋白的拷贝数，结果显示核小体位点中绝大多数（>75%）含有1或2个标记的H4拷贝（图1E），再次支持这些核小体主要以空间分离的单核小体形式组装。其他更亮的焦点含有超过3个标记的H4拷贝，可能代表在衍射极限内存在多个核小体。
当光镊位置保持不变而有更多DNA缠绕在组蛋白八聚体上时，随着系留链上张力的增加，也可监测到核小体的形成（图1B，底部）。在不存在Nap1的情况下，组蛋白八聚体仍可结合DNA，但大部分保持未缠绕状态，因为在固定光镊位置时所测得的张力保持恒定（图1F）。即使存在Nap1，组蛋白八聚体与DNA之间仍可能发生非特异性结合。在另一项实验中，采用相同方案组装含Cy3标记H2A的核小体，结果与使用LD655标记H4所获得的结果相似（图1G），表明完整的八聚体成功组装为核小体。
使用步骤4中所述的装置图 2A），随着时间推移，在kymograph上观察到核小体解缠绕过程，伴随系留距离的增加（图2B). 之前有报道称，组蛋白八聚体在解旋后通常仍与DNA保持结合30,31，因此，即使在高张力下，荧光轨迹通常仍然持续存在。核小体解缠绕也在相应的力-距离（FD）曲线上进行了监测（图2C）。FD 曲线的可量化特征包括核小体解缠绕时的力（参见“转变 F”） 图2C 插入片段）以及从组蛋白八聚体释放的DNA长度（见“ΔL”） 图2C 插图），其长度为约24 nm的倍数，与单个核小体DNA内圈独立解缠绕的现象一致27,30这些参数可用于估算每条染色质纤维上形成的核小体数量，或用于核小体力学特性的进一步下游分析。因此，将机械拉伸实验中获得的内圈断裂次数与基于单体强度估算的每条核小体轨迹上标记的H4拷贝数进行比较，结果显示两者数量基本一致（示例见于 图2D-G）。然而，需要注意的是，由于样品中H4蛋白的标记效率约为70%，以及存在一定的Nap1非依赖性组蛋白与DNA的残留结合，导致结果并不完全匹配，如图所示。 图1F最后，正如预期的那样，拉伸与Nap1结合的无组蛋白裸DNA链不会产生力诱导的构象转变图 2H），表明Nap1单独存在时不会显著扭曲DNA。
采用步骤5中所述装置（图3A），通过观察到绿色荧光焦点在染色质锚定链上出现，可实现连接组蛋白H1与染色质结合的可视化（图3B）。值得注意的是，与H1结合的核小体产生了双色轨迹（见图3B中的白色箭头），这些轨迹在时间推移中保持静止。此外，还观察到H1在无核小体DNA区域上的扩散轨迹（见图3B中的绿色星号）。
<img alt="静态平衡共聚焦荧光示意图；用于DNA-核小体分析的光镊装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66579/66579fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：Nap1介导的 原位 核小体形成 (A) Nap1介导的实验装置示意图 原位 核小体形成实验方案（步骤3）。在通道1中，利用光镊捕获一对微珠，随后在通道2中通过生物素-链霉亲和素连接将单个λ DNA分子固定于两微珠之间。接着将该DNA连接结构转移至通道4，该通道含有LD655标记的组蛋白八聚体（红色）和Nap1，以实现DNA上核小体的实时组装。BLD655-H4标记的含核小体DNA链的代表性二维扫描图像（左）和明场轨迹图（右）。在光镊位置保持恒定的情况下，当DNA链移动至通道4时，相应的力读数（底部）立即升高，表明核小体发生缠绕。较亮的轨迹信号提示在约300 nm的衍射极限范围内存在多个相邻的核小体。C) 含LD655-H4的核小体单步光漂白事件（白色箭头）的典型延时成像图。D) 含LD655-H4的核小体发生两步光漂白事件（白色箭头）的示例显微轨迹图。E) 基于荧光强度估算的每条轨迹中LD655标记H4分子数量的相对频率。F) 无Nap1存在时，与组蛋白八聚体结合的染色质纤维的典型延时成像图。相应的受力读数（底部）在组蛋白八聚体结合DNA的过程中保持不变。GCy3-H2A标记的含核小体DNA链的代表性明场显微图像。关联的力信号读数（底部）显示，当DNA链移至通道4（含有八聚体和Nap1）时，力值立即上升，这是因为在光镊位置保持恒定的条件下发生了核小体的组装。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66579/66579fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="核小体解缠绕的光镊实验；LD655标记H4；力-距离曲线；显迹分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66579/66579fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2核小体解缠绕实验 (A) 解开核小体实验装置示意图（步骤4）。含有核小体的DNA链被移至第3通道（ch. 3），该通道中为不含蛋白质的成像缓冲液，通过增加珠间距离使核小体解开。B含有核小体的DNA链通过逐渐增加珠间距离被拉伸至高张力的代表性明场图像。荧光强度在靠近底部珠端逐渐减弱，可能是由于DNA轻微倾斜偏离了扫描聚焦平面所致。C) 相关的力-距离曲线显示了在8–37 pN之间发生的由力诱导的内圈DNA解缠绕转变。插图展示了一个典型转变的放大视图，可记录并进一步分析解缠绕的距离（ΔL = 单个核小体DNA内圈约24 nm）和转变力（Transition F）。对于该DNA链，共有26个核小体被解缠绕，且该链在约65 pN时断裂，如kymograph中的白色虚线所示。D，ELD655-H4 核小体锚定链在高拉力下的示例，其中每条轨迹中的 H4 数量被估算 通过 荧光强度（在kymograph中指示）， D）并估算被包裹的核小体数量 通过 力致距离变化的大小（在相应的力-距离曲线中指示）， E). (F，G) 另一个示例如（D，E). (H仅在含有Nap1的通道中孵育后，被拉伸至高作用力的DNA系留（n = 5）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66579/66579fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="组蛋白-DNA 相互作用示意图，包含光镊、共聚焦荧光和核小体分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66579/66579fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：可视化蛋白质-染色质相互作用。（A）可视化蛋白质结合染色质实验方案（步骤 5）中所述实验装置的示意图。含有核小体的 DNA 连接链被移至通道 5，其中含有 10 nM 的 Cy3 标记连接组蛋白 H1（绿色）。（B）H1 结合含核小体 DNA 连接链的代表性双色延时图像。H1-核小体共定位事件以白色箭头标示。未结合核小体的轨迹以品红色箭头标示。在裸露 DNA 上扩散的 H1 分子以绿色星号标示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66579/66579fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种用于重建含核小体的DNA系链以进行单分子相关力与荧光显微镜检测的详细实验流程。此外，还描述了若干后续实验，可用于观察染色质相互作用蛋白的结合行为，并分析核小体物理性质的变化。

核小体是真核生物染色质的基本单位，已成为大量富有启发性的单分子研究的关注焦点，涉及……

单分子技术是研究染色质系统力学特性、协调机制和组成成分的有力工具，因此研究人员一直在寻求更优的方法来制备核小体底物。本文介绍了一种在单分子关联力与荧光显微镜中，直接在DNA上原位形成核小体的实验方案。通常，核小体底物是通过盐透析法，将核小体组装在含有强定位序列的DNA上而制备的。尽管这种方法具有一些优势，但会产生人为稳定的核小体，并且试剂用量较大。我们的方案可在几分钟内无需特定DNA序列且使用更少试剂的条件下，制备用于单分子相关力与荧光显微镜研究的核小体底物。该方案能够实现天然DNA序列上的核小体组装，易于调节核小体密度，同时缩短制备时间并减少试剂使用量。此外，原位形成的核小体DNA系连结构能够简化实验流程，并提供内置的单分子可视化与操控便利性。当实验无需严格要求核小体精确定位时，我们的研究结果可帮助科研人员更高效地在单分子水平上研究染色质及其结合蛋白。通过节省下来的时间和资源，可以开展更多实验，以进一步探究其他变量和条件。我们目前考虑的相关研究领域包括由组蛋白变体及其他翻译后修饰所调控的染色质力学特性。我们也在关注其他染色质结合蛋白的生物物理相互作用及其动力学。最后，我们还研究核小体驱动的高级组装过程，例如生物分子凝聚作用。首先，在流动池的第三通道中加入 500 微升无蛋白质的成像缓冲液。将 2 纳摩尔的酿酒酵母 Nap1 与 2 至 5 纳摩尔的 LD655 标记 H4 组蛋白八聚体混合于 500 微升 1XHR 缓冲液中。将此混合物加入流动池的第四通道。以 1.0 bar 的压力使所有通道流动 30 秒，用样品冲洗通道。将流速设为 0.2 bar，然后将光镊移动至通道 1，捕获一对合适的链霉亲和素包被的微珠。接着，将光镊移至通道 3。关闭流体，对磁珠对进行力校准。打开红色共聚焦激光，校准成像区域。将流速设为 0.2 bar 后，移动光镊至通道 2 以捕获生物素化 DNA。然后将光镊移动至通道3，并停止流动。增大光镊之间的距离以拉伸DNA，同时监测相应的力-距离曲线，以确认存在单根DNA连接。调节光镊之间的距离，使DNA张力读数约为一皮牛顿。打开线扫描，开始使用红色激光采集显微图像。然后在关闭流动的条件下将光镊移动至第4通道，以在DNA连接处形成核小体。如需解旋核小体，则将光镊移至第3通道。将力读数设为零，速度设为 0.1 微米每秒，移动光镊 1 远离光镊 2。将 10 纳摩尔的 Cy3 标记连接组蛋白 H1.4 加入 500 微升成像缓冲液中，混匀后加入通道 5。在形成包含核小体的 DNA 拴系结构后，除红光激光外，开启绿光激光，并将光镊移至通道 5，以实时成像 H1 与染色质的结合过程。通过二维扫描和明场图像，可在DNA系链上观察到静止的红色荧光焦点，表明核小体的形成。光漂白分析显示为一步或两步光漂白事件，提示存在单核小体。在缺乏Nap1的情况下，组蛋白八聚体仍可结合DNA，但大部分保持未缠绕状态，表现为持续的张力。使用Cy3标记的H2a，获得的核小体组装结果与使用LD655标记的H4所得结果相似。核小体解旋随时间推移导致系留距离增加，在kymograph上可见，并产生具有特征性“撕裂”峰的受力距离曲线，这些峰代表单个核小体的解旋事件。染色质上连接组蛋白H1的结合表现为绿色荧光焦点，双色固定轨迹代表H1与核小体的结合，而绿色锯齿状轨迹则代表扩散状态的H1运动轨迹。

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科研

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生物化学

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