Name: 从人脂肪来源的间充质干细胞中纯化和表征细胞外囊泡 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T13:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 54 s
Description: 学习从人脂肪来源的间充质干细胞中纯化细胞外囊泡的标准化方法，采用超速离心技术提高分离效率。该方案为基因递送等治疗应用提供了可靠的实验框架。

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本工作部分得到了中国国家自然科学基金（82202473）的支持。

实验方案步骤的概述见图1。研究中所用试剂和设备的详细信息列于材料表中。
1. 培养基制备
<ol>
	<li>使用450 mL基础培养基、50 mL无外泌体的胎牛血清和5 mL三联抗生素配制无外泌体的ADSC培养基。</li>
</ol>
2. 复苏与培养ADSCs
注意：复苏 ADSCs。
<ol>
	<li>提前打开超净台的紫外辐射，消毒30分钟。</li>
	<li>提前将培养基置于37 °C水浴中预热。</li>
	<li>从液氮中取出2管冻存的脂肪来源间充质干细胞（ADSCs，P3代），在37 °C恒温水浴中轻轻振荡，直至完全解冻。 
	注意：冻存管管口不应接触水，以防污染。</li>
	<li>用75%酒精对冻存管进行消毒，然后转移至超净台内。用移液器吸取细胞悬液，转移至15 mL离心管中。</li>
	<li>将离心管放入低速离心机中，在4 °C条件下以250 × g离心5分钟。</li>
	<li>准备四个10 cm培养皿，每个培养皿中加入9 mL培养基。标记名称、细胞类型、代数和实验日期，然后放入37 °C恒温细胞培养箱中预热。</li>
	<li>对离心管进行消毒后移入超净台，用移液器吸除上清液。</li>
	<li>加入4 mL培养基，轻轻吹打混匀（细胞密度为1 × 105 cells/mL），使细胞均匀分散。 
	注意：吸取上清液时注意不要吸出细胞沉淀。</li>
	<li>向每个培养皿中加入1 mL细胞悬液，采用十字法轻轻振荡培养皿。 
	注意：将培养皿置于水平台面上，以十字交叉方式（上下左右移动）振荡5–6次，避免画圈，以免导致细胞在中心聚集。</li>
	<li>在光学显微镜下以40倍物镜观察细胞，然后将培养皿放入培养箱中。 
	注意：观察细胞的主要目的是确认细胞是否分布均匀，分布不均将影响后续生长。</li>
	<li>为细胞更换培养基。
	<ol>
		<li>提前打开超净台的紫外辐射，消毒30分钟。</li>
		<li>提前将培养基置于37 °C水浴中预热。</li>
		<li>在光学显微镜下以40倍物镜观察细胞状态，细胞融合度约为50%。 
		注意：细胞融合度是指细胞贴壁并充分伸展后，其占据的面积与培养皿表面积的比值。</li>
		<li>将培养皿消毒后转移至超净台（生物安全二级），吸除旧培养基。</li>
		<li>用2 mL PBS溶液轻轻冲洗每个培养皿两次。</li>
		<li>向每个培养皿中加入10 mL新鲜培养基，将培养皿转移至培养箱中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 收集ADSCs上清液并提取EVs
<ol>
	<li>提前开启超净台的紫外辐射，消毒30分钟。</li>
	<li>在显微镜下观察细胞状态，融合度约为80%。</li>
	<li>消毒后将培养皿转移至超净台内，小心用移液器收集上清液，并转移至50 mL离心管中。 
	注意：细胞可选择冻存或丢弃。若无需保持无菌，后续步骤可在操作台进行。此时实验可暂停，待后续继续。若实验中断，上清液可在4 °C冰箱中保存不超过一周，不建议长期保存，以免影响细胞外囊泡（EVs）的活性。最佳做法是立即提取EVs。</li>
	<li>离心（300 × g，10分钟，室温）以去除悬浮细胞，用移液器收集上清液。 
	注意：不要倾倒，保留少量上清液以防止吸出沉淀。</li>
	<li>离心去除细胞碎片（2000 × g，10分钟，4 °C），继续用移液器收集上清液。 
	注意：关键操作要点与步骤3.4相同。</li>
	<li>使用0.22 µm滤膜过滤上清液，以去除大颗粒和细胞碎片。 
	注意：过滤前先用2 mL无菌PBS润湿滤膜。</li>
	<li>在超速离心机中离心（10,000 × g，30分钟，4 °C）。</li>
	<li>随后在4 °C条件下以100,000 × g离心70分钟，弃去沉淀并收集上清液。 
	注意：通过多次离心纯化所获得的EVs，以提高其纯度。沉淀可能肉眼不可见，因此操作移液器时务必轻柔，并在管底保留少量上清液，避免吸入沉淀。</li>
	<li>用移液器移除上清液，将沉淀用PBS重悬，再次离心（100,000 × g，70分钟，4 °C）。 
	注意：沉淀可能肉眼不可见，因此用移液器吸取上清液时，必须轻柔且彻底地去除上清液，以最大程度提高EVs的纯度。</li>
	<li>移除上清液，获得EVs沉淀。用1 mL PBS重悬沉淀，转移至1 mL离心管中，置于4 °C冰箱中保存，用于后续检测。 
	注意：沉淀可能肉眼不可见，因此用移液器吸取上清液时，务必轻柔且彻底地去除上清液，以最大程度提高EVs的纯度。若样品需长期保存，应置于-80 °C冰箱中。</li>
</ol>

Ultracentrifuge-Based Isolation of Extracellular Vesicles from Human ADSCs

<ol><li>Al-Ghadban, S., Artiles, M., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+stem+cells+in+regenerative+medicine%3A+Looking+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Adipose stem cells in regenerative medicine: Looking forward.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 837464(2021).</li>
<li>Xin, H., Li, Y., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%2FmiRNAs+as+mediating+cell-based+therapy+of+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Exosomes/miRNAs as mediating cell-based therapy of stroke.</a> Front Cell Neurosci. 8, 377(2014).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tissue+origin+effect+of+extracellular+vesicles+on+cartilage+and+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">The tissue origin effect of extracellular vesicles on cartilage and bone regeneration.</a> Acta Biomater. 125, 253-266 (2021).</li>
<li>Gao, X., Salomon, C., Freeman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+from+adipose+tissue-a+potential+role+in+obesity+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles from adipose tissue-a potential role in obesity and type 2 diabetes.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 8, 202(2017).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+biological+effects+of+extracellular+vesicles+from+adipose-derived+stem+cells+were+markedly+increased+by+low-intensity+ultrasound+stimulation+for+promoting+diabetic+wound+healing%29%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev+Rep%22%5BJournal%5D)">Production and biological effects of extracellular vesicles from adipose-derived stem cells were markedly increased by low-intensity ultrasound stimulation for promoting diabetic wound healing).</a> Stem Cell Rev Rep. 19 (3), 784-806 (2023).</li>
<li>Mou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+from+human+adipose-derived+stem+cells+for+the+improvement+of+angiogenesis+and+fat-grafting+application%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles from human adipose-derived stem cells for the improvement of angiogenesis and fat-grafting application.</a> Plast Reconstr Surg. 144 (4), 869-880 (2019).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+bone+immobilized+with+human+adipose+stem+cells-derived+exosomes+promotes+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered bone immobilized with human adipose stem cells-derived exosomes promotes bone regeneration.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 10 (6), 5240-5254 (2018).</li>
<li>Han, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cell-derived+extracellular+vesicles+inhibit+the+fibrosis+of+fibrotic+buccal+mucosal+fibroblasts+via+the+microRNA-375%2Ffoxf1+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicles inhibit the fibrosis of fibrotic buccal mucosal fibroblasts via the microRNA-375/foxf1 axis.</a> Stem Cells Int. 2021, 9964159(2021).</li>
<li>Brezgin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technological+aspects+of+manufacturing+and+analytical+control+of+biological+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Technological aspects of manufacturing and analytical control of biological nanoparticles.</a> Biotechnol Adv. 64, 108122(2023).</li>
<li>Kim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Character+comparison+of+abdomen-derived+and+eyelid-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Character comparison of abdomen-derived and eyelid-derived mesenchymal stem cells.</a> Cell Prolif. 46 (3), 291-299 (2013).</li>
<li>Gan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+from+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+improve+liver+fibrosis+by+regulating+the+miR-20a-5p%2FTGFBR2+axis+to+affect+the+p38+MAPK%2FNF-%CE%BAB+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Exosomes from adipose-derived mesenchymal stem cells improve liver fibrosis by regulating the miR-20a-5p/TGFBR2 axis to affect the p38 MAPK/NF-κB pathway.</a> Cytokine. 172, 156386(2023).</li>
<li>Jung, M. K., Mun, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+and+imaging+of+exosomes+by+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Sample preparation and imaging of exosomes by transmission electron microscopy.</a> J Vis Exp. (131), e56482(2018).</li>
<li>Han, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-transplantation+of+exosomes+derived+from+hypoxia-preconditioned+adipose+mesenchymal+stem+cells+promotes+neovascularization+and+graft+survival+in+fat+grafting%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Co-transplantation of exosomes derived from hypoxia-preconditioned adipose mesenchymal stem cells promotes neovascularization and graft survival in fat grafting.</a> Biochem Biophys Res Commun. 497 (1), 305-312 (2018).</li>
<li>Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+centrifugation+induces+aggregation+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 4, 29509(2015).</li>
<li>Lamparski, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+clinical+grade+exosomes+derived+from+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells.</a> J Immunol Methods. 270 (2), 211-226 (2002).</li>
<li>Baranyai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+exosomes+from+blood+plasma%3A+Qualitative+and+quantitative+comparison+of+ultracentrifugation+and+size+exclusion+chromatography+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation of exosomes from blood plasma: Qualitative and quantitative comparison of ultracentrifugation and size exclusion chromatography methods.</a> PLoS One. 10 (12), e0145686(2015).</li>
<li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+extracellular+vesicles+by+three-dimensional+dynamic+culture+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Engineering extracellular vesicles by three-dimensional dynamic culture of human mesenchymal stem cells.</a> J Extracell Vesicles. 11 (6), e12235(2022).</li>
<li>Eguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+with+cancer+stem+cell-like+properties+secrete+exosomes+and+HSP90+in+a+3D+nanoenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Organoids with cancer stem cell-like properties secrete exosomes and HSP90 in a 3D nanoenvironment.</a> PLoS One. 13 (2), e0191109(2018).</li>
</ol>

作者声明无经济利益冲突。

在正式的实验过程中，有几个关键点对于获得最佳实验结果至关重要。根据我们以往的经验，建议选用第3至第6代的脂肪来源间充质干细胞（ADSCs），以确保细胞处于最佳状态。在第3代之前，红细胞、内皮细胞及其他杂细胞可能尚未被充分筛选去除；而在第6代之后，细胞可能逐渐老化，从而影响分泌的细胞外囊泡（EVs）的状态。其次，收集上清液时应确保细胞融合度在80%至90%之间，以保证尽可能充分地分泌大量EVs。为了保持EVs的最高纯度，研究人员在前三次离心过程中必须谨慎操作，确保不留任何液体残留，防止杂质混入或沉淀被吸出。在最后两次离心过程中，应彻底去除上清液，同时注意保护沉淀物。
超速离心法成本较低，且无需进一步处理。该技术已广泛应用于细胞外囊泡（EV）研究，并通过表征实验验证了其在获取EV方面具有令人满意的效率。然而，该方法仍存在一些不可避免的缺点：首先，EV的回收率较低；其次，EV有时容易发生聚集；此外，可能同时分离出非细胞成分，且部分EV在过程中可能发生破裂，导致碎片积累14,15,16。为克服这些缺陷，目前大多数研究集中于EV的纯化12,13。然而，本方案涵盖了从细胞培养到外泌体纯化的完整流程，因为我们认为整个操作过程均会影响最终提取EV的状态与纯度。操作过程中严格遵循上述指南至关重要。此外，收集更多上清液并采用三维（3D）细胞培养可能更有利，因为大量研究已证实，与二维（2D）培养相比，3D培养在促进EV分泌方面更具优势17,18。
本方案概述了使用超速离心法从脂肪来源间充质干细胞（ADSCs）中提取细胞外囊泡（EVs）的流程。该方案提供了实用的操作指导，帮助实验人员在操作过程中尽可能避免遗漏细节。总之，本方案有助于提高样品质量，并提醒我们：在关注每一步骤细节的同时，还应将实验作为一个整体来考虑。

大多数ADSCs来源于脂肪组织，已被证明可促进多种组织和器官的再生与重建，包括心肌、骨骼和皮肤1。近期研究表明，ADSCs的再生功能可能归因于细胞间的直接接触及其旁分泌效应2。旁分泌效应是细胞在短距离内相互作用和传递信息的重要方式，该功能主要通过细胞外囊泡（EVs）实现。
细胞外囊泡（EVs）是由细胞产生的双层膜结构，直径范围为40 nm至160 nm（平均约为100 nm）。它们可影响多种细胞功能，如细胞因子产生、细胞增殖、凋亡和代谢3,4。目前已有大量关于脂肪来源间充质干细胞（ADSC）EVs功能的研究，包括促进骨再生、口腔黏膜组织再生、移植后脂肪组织的存活以及皮肤伤口修复5,6,7,8，表明ADSC EVs在再生医学中具有巨大潜力。从上清液中提取和分离EVs的方法多种多样，包括基于离心、沉淀、分子大小、亲和性以及微流控技术的方法。其中，超速离心法被广泛认为是分离EVs的金标准9。超速离心分离EVs的基本原理在于样品中颗粒的沉降系数不同，从而在离心过程中沉降并聚集于不同的分离层。然而，目前尚未建立一套详细强调超速离心过程中注意事项的操作方案。
因此，本研究以逻辑清晰的信息流程和准确、正式的语言，客观地概述了脂肪来源干细胞（ADSC）的培养、上清液收集以及细胞外囊泡（EVs）超速离心的实验步骤与关键要点，为后续实验提供了有价值的参考。

<table><tbody><tr><td>Supor 膜针头滤器</td><td>Acros Organics</td><td>4652</td><td>0.22 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>细胞培养基础培养基</td><td>OriCell</td><td>BHDM-03011</td><td></td></tr><tr><td>无外泌体胎牛血清 + 培养补充剂（用于人脂肪来源间充质干细胞）</td><td>OriCell</td><td>HUXMD-05002</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>OLYMPUS</td><td>Lx70-S8F2</td><td></td></tr><tr><td>低速离心机</td><td>安徽优胜特克中科科学仪器有限公司</td><td>SC-3612</td><td></td></tr><tr><td>诺卡霉素</td><td>InvivoGen</td><td>ant-nr-05</td><td></td></tr><tr><td>Optima Max-XP 台式超速离心机</td><td>贝克曼库尔特</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素-庆大霉素溶液（100 倍浓缩）</td><td>Solarbio</td><td>P1410</td><td></td></tr></tbody></table>

人脂肪源性间充质干细胞来源的细胞外囊泡的纯化与表征

Purification and Characterization of Extracellular Vesicles from Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells

人脂肪来源的间充质干细胞（ADSCs）能够促进多种组织和器官的再生与重建。近期研究表明，其再生功能可能归因于细胞间的直接接触以及细胞的旁分泌作用。旁分泌作用是细胞在短距离内相互作用和传递信息的重要方式，其中细胞外囊泡（EVs）作为载体发挥功能性作用。ADSC来源的EVs在再生医学中具有巨大潜力。已有大量研究报道了这些方法的有效性。目前已有基于离心、沉淀、分子大小、亲和性以及微流控等原理的多种EVs提取与分离方法。超速离心法被认为是分离EVs的金标准。然而，目前仍缺乏一套详细强调超速离心过程中注意事项的操作流程。本研究介绍了ADSC培养、上清液收集以及EV超速离心的关键步骤与方法。但尽管超速离心法成本较低且无需额外处理，仍存在一些不可避免的缺点，例如回收率较低以及EV聚集现象。

首先，对ADSCs进行了表征与鉴定，包括其形态学特征10和表面抗体表达。根据图2A可知，ADSCs呈 spindle 形排列，在密集生长后形成涡旋状结构。培养的细胞可向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化，并分别用油红O、茜素红和阿利新蓝进行染色11。诱导分化实验及流式细胞术结果证实，这些细胞确为具有多向分化潜能的ADSCs。然而，结果中显示有22%的细胞CD45呈阳性，但由于存在足够的阳性和阴性抗体支持，该结果不影响最终结论（图2A、B）。
接下来，对提取的细胞外囊泡（EVs）进行鉴定至关重要。鉴定主要包括三个方面：形态、粒径和标志蛋白。透射电镜（TEM）结果清晰地显示了具有双层膜结构的杯状EV形态12（图3A）。纳米颗粒追踪分析（NTA）表明，EVs的粒径分布约为50–150 nm，浓度约为1.6 × 1010 粒粒/mL（图3B）。Western Blot分析还显示，EVs的标志蛋白（包括CD9、CD63和TSG10113）均得到良好表达（图3C）。
<img alt="ADSC 外泌体的制备、流程图、离心步骤、细胞培养、过滤过程" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66585/66585fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：实验方案步骤概览。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66585/66585fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="脂肪来源干细胞染色及流式细胞术结果；分化分析，干性标志物。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66585/66585fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：ADSCs 的表征。（A）ADSCs 呈梭形形态。将 ADSCs 分别在成脂、成骨和成软骨诱导培养基中进行培养。通过油红O染色鉴定成脂分化，通过茜素红染色和阿利新蓝染色分别确认成骨和成软骨分化。比例尺：100 µm。（B）ADSCs 的流式细胞术分析，检测间充质干细胞表面标志物（CD90、CD105、CD29 和 CD73）以及造血细胞特异性标志物（CD31、CD34、CD45 和 HLA-DR）。设门策略：首先圈选空白对照组，以此为基础，根据各组标记的抗体依次圈选 CD90、CD105、CD29、CD73、CD31、CD34、CD45 和 HLA-DR。本图改编自 Han, Y. D. 等人13。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66585/66585fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="纳米颗粒研究：TEM 图像、粒径分布图、生物标志物的蛋白质 Western 印迹分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66585/66585fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：细胞外囊泡（EVs）的表征。（A）透射电镜（TEM）结果清晰地显示出双层膜结构的杯状 EV 形态。比例尺：200 nm。（B）纳米颗粒跟踪分析（NTA）表明，EVs 的粒径分布约为 50–150 nm，浓度约为 1.6 × 1010 粒子/mL。（C）通过 Western 印迹法检测外泌体中 TSG101、CD9 和 CD63 的表达。本图改编自 Han, Y. D. 等人13。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66585/66585fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

本方案描述了从培养人脂肪来源的间充质干细胞（ADSCs）、收集上清液到通过超速离心法提取细胞外囊泡（EVs）的全部操作步骤。

人脂肪来源的间充质干细胞（ADSCs）可促进多种组织和器官的再生与重建。近期研究……

我们的研究重点是从人脂肪来源的间充质干细胞中制备和纯化细胞外囊泡。我们希望解决的问题是如何标准化这一过程并提高纯化效率。目前，有许多技术可用于提取细胞外囊泡，例如超速离心法、超滤法、体积排阻色谱法、聚合物沉淀法、免疫亲和捕获法、微流控技术等。然而，超速离心法被公认为是金标准。未来，我们将致力于细胞外囊泡作为载体的应用研究，包括携带mRNA、质粒及其他小分子并将其转染入细胞。首先，从液氮中取出两支冻存管，内含第3代冻存的人脂肪来源间充质干细胞。将它们置于37摄氏度水浴中振荡，直至完全解冻。然后使用75%酒精对管子进行消毒。将消毒后的管子放置于超净工作台上。使用移液器吸取细胞悬液，并将其转移至15毫升离心管中。在低速离心机中以250 ×g、4 °C离心5分钟。同时，准备4个10厘米培养皿，每皿中加入9毫升培养基。在每块培养皿上标记名称、细胞类型、代数和实验日期。然后，将其放入37°C恒温细胞培养箱中预热。五分钟后离心结束，将离心管移至超净工作台前需先进行消毒。使用移液器吸除上清液，并加入 4 mL 培养基以达到所需细胞浓度。轻轻振荡溶液，直至细胞均匀分散。随后，将 1 mL 细胞悬液加入每个预热的培养皿中，并在水平台面上以十字交叉方式轻轻摇动培养皿，使细胞悬液混匀。将培养皿放入37摄氏度培养箱之前，在光学显微镜下以40倍放大倍数观察细胞。第二天，在进行换液准备之前，于光学显微镜下以40倍放大倍数观察细胞状态。消毒后，将培养皿转移至生物安全二级的超净台中。移除每个培养皿中的培养基，用两毫升磷酸盐缓冲液（PBS）溶液轻轻冲洗培养皿两次，然后向每个培养皿中加入10毫升培养基。将细胞转移至培养箱中，直至准备收集上清液。首先，在人脂肪来源的间充质干细胞培养达到80%融合度时，收集培养液上清。使用移液器小心收集上清液，并转移至50毫升离心管中。在室温下以300 ×g离心10分钟，以去除悬浮细胞。然后，使用移液器吸取上清液，注意不要扰动沉淀。将上清液在4°C条件下以2,000 G离心10分钟，以去除细胞碎片。用移液器收集所得上清液，并通过0.22微米滤膜过滤，以去除大颗粒和细胞碎片。将滤液在4°C条件下以10,000 G离心30分钟。然后，在4°C条件下以100,000 G进行最终离心，持续70分钟。使用移液器小心移除上清液，避免收集沉淀物。将沉淀重悬于PBS中，然后在4°C条件下以100,000 G离心70分钟。弃去上清液，将获得的细胞外囊泡（EVs）沉淀重悬于1毫升PBS中。最后将EV悬液转移至1毫升离心管中，在4°C保存直至进一步分析。透射电子显微镜清晰地揭示了细胞外囊泡（EVs）具有双层膜结构的杯状形态。纳米颗粒追踪分析表明，其粒径分布约为50至150纳米。蛋白质印迹分析显示，EVs的特征性标志蛋白得到良好表达。

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医学

从人脂肪来源的间充质干细胞中纯化和表征细胞外囊泡

本方案提供了一种无需使用酶消化的方法，通过组织块法从腹部整形术和吸脂术样本中分离间充质干细胞。该方法避免了剧烈的酶处理或离心步骤，所获得的干细胞更符合临床应用需求，可用于体外研究或重新返回临床应用。...

一种无需酶解法分离与扩增人脂肪源性间充质干细胞的方法

本方案展示了如何在简单的实验室台式条件下分离人脐带来源的间充质干细胞小细胞外囊泡（hUC-MSC-sEVs）。通过纳米颗粒追踪分析、BCA蛋白定量检测、蛋白质印迹以及透射电子显微镜，分别对分离得到的hUC-MSC-sEVs的粒径分布、蛋白浓度、sEVs标志物及形态进行表征。...

一种简易台式过滤法从人源间充质干细胞分离小细胞外囊泡

本方案描述了通过差速离心法从培养的人源间充质干细胞（MSCs）中分离和表征典型细胞外囊泡（EVs，包括外泌体和微囊泡）的方法。本文还介绍了这些细胞外囊泡的进一步应用。...

从培养的人源间充质干细胞中分离、表征及治疗性应用细胞外囊泡

分离与鉴定源自Sprague Dawley大鼠脂肪组织的间充质干细胞

脂肪组织是间充质干细胞的优良来源。本文详细介绍了从小鼠附睾脂肪组织中分离、培养和鉴定脂肪组织来源干细胞（ADSCs）的逐步操作方法。...

从小鼠附睾脂肪组织中分离、体外扩增及表征间充质干细胞

本方案详细描述了间充质基质细胞释放的细胞外囊泡（EVs）的分选方法。特别是，重点介绍了仪器设置以及分选条件的优化。目标是在保持细胞外囊泡特性的同时对其进行分选。...

设定外泌体分离的成功分选条件

该方案利用脂肪细胞特异性的CD63-GFP报告小鼠品系，可视化并定量脂肪细胞来源的细胞外囊泡（EVs）的分泌，并展示其被前体细胞摄取的过程，揭示了脂肪组织内的一种旁分泌通路。...

利用CD63-GFP报告小鼠模型表征脂肪细胞来源的细胞外囊泡分泌 在体 内 和 体外

在此，我们介绍一种高效分离脂肪来源干细胞和脂肪细胞的标准方法，其特征在于...

高效分离猪脂肪组织来源的间充质干细胞和脂肪细胞

本方案描述了从脂肪抽吸物中分离脂肪源性基质细胞以及制备4...

使用抽脂术获取的脂肪源性基质细胞修复颅骨临界尺寸缺损模型

所述方法通过使用以下任一方式分离和表征人牙髓干细胞（hDPSCs） 牙髓组织的酶解离（DPSC-ED） 或 牙髓组织外植体中干细胞的直接迁出（DPSC-OG）。随后 体外...

利用两种不同方法分离、鉴定及比较源自恒牙的人牙髓干细胞的分化特性

学习从人脂肪来源的间充质干细胞中纯化细胞外囊泡的标准化方法，采用超速离心技术提高分离效率。该方案为基因递送等治疗应用提供了可靠的实验框架。

人脂肪源性间充质干细胞来源的细胞外囊泡的纯化与表征

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