Name: 通过封装无细胞表达系统重建细菌谷氨酸受体通道 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-08T14:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: 学习利用反相液滴乳化法在合成细胞脂质双层中重建膜蛋白的无细胞表达技术。该方法为神经科学和膜蛋白功能研究提供了稳定的实验平台。

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APL 感谢美国国家科学基金会（EF1935265）、美国国立卫生研究院（R01-EB030031 和 R21-AR080363）以及美国陆军研究办公室（80523-BB）的支持

本研究所用的试剂和设备见材料表。
1. 小型单层囊泡（SUVs）存在下的体相CFE反应
<ol>
	<li>SUV 制备 
	注意：此步骤必须在通风橱中进行，并遵循氯仿操作的安全说明。
	<ol>
		<li>在玻璃小瓶中制备 5 mM 1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷脂酰胆碱（POPC）SUV，方法是转移 76 µL 溶于氯仿的 25 mg/mL POPC 储备液。</li>
		<li>轻轻旋转玻璃小瓶的同时，向瓶内通入温和的氩气流，使脂质在瓶底形成干燥薄膜。随后将玻璃小瓶放入干燥器中，瓶盖轻轻旋紧以允许过量氯仿蒸发。</li>
		<li>将玻璃小瓶在干燥器中放置 1 小时。然后加入 0.5 mL 超纯去离子水以溶解脂质膜，并涡旋约 2 分钟。</li>
		<li>通过将两个滤膜支撑片浸泡在去离子水中，并将其放置在内部膜支撑结构的两侧，组装小型挤出装置。接着将一片 100 nm 聚碳酸酯滤膜浸泡后置于两个内部膜支撑结构之间，并用挤出器外壳和固定螺母夹紧。将此装置放入挤出器支架中。</li>
		<li>用超纯去离子水冲洗两支 1 mL 气密注射器各 3 次。</li>
		<li>将脂质-水混合样品装入其中一支 1 mL 气密注射器中，并使用摆臂夹具将其固定在微型挤出器的一端。将第二支注射器插入挤出器的另一端，并确保其完全压下。 
		注意：在将脂质-水混合物装入注射器时，确保在通过微型挤出器前注射器内无空气残留。</li>
		<li>通过微型挤出装置将脂质-水混合物从初始注射器缓慢推入空注射器中。重复此步骤 11 次以形成 SUV。将所得 SUV 转移至 1.5 mL 微量离心管中。 
		注意：SUV 溶液可在 4 °C 下保存最多 2 周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>无细胞表达（CFE）反应体系组装
	<ol>
		<li>按照制造商提供的无细胞表达方案进行 CFE 反应体系的组装，具体细节略有修改，如下所述。</li>
		<li>混合以下组分：10 µL 溶液 1（含氨基酸、NTPs、tRNAs、酶底物及必要缓冲液），1 µL 溶液 2（含蛋白质，溶于 20% 甘油），2 µL 溶液 3（核糖体（20 µM）），适量编码可溶性 sfGFP-sfCherry(1-10)27&#160;（后文简称可溶性 sfGFP）、WT-GluR0-sfGFP 或 PRSP-GluR0-sfGFP 的 DNA（每 1000 个碱基对 10–60 ng），1 µL 小鼠 RNase 抑制剂，以及 4 µL 5 mM SUV 溶液（用于膜蛋白）或 4 µL 水（用于可溶性蛋白）。</li>
		<li>加入超纯去离子水将反应体系终体积调至 20 µL。 
		注意：在组装 CFE 体系时，所有组分必须保持在冰上。所有材料对温度敏感，若升至室温可能发生降解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CFE 反应孵育与监测
	<ol>
		<li>将 CFE 溶液转移至 96 孔圆锥形 V 底板中。为防止反应过程中液体蒸发，使用密封膜覆盖板孔。</li>
		<li>将板置于酶标仪中，在 37 °C 下孵育 4–5 小时，同时每 2 分钟监测一次 GFP 信号，激发/发射波长设为 488 nm/528 nm，增益设为 100。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. GUVs 中封装的 CFE 反应
<ol>
	<li>制备 GUV 外层缓冲液
	<ol>
		<li>在 1.5 mL 微量离心管中，加入 1.5 µL 的 1 M 精胺，37.5 µL 的 100 mM ATP，25 µL 的 100 mM GTP，12.5 µL 的 100 mM CTP，12.5 µL 的 100 mM UTP，25 µL 的 1 M 磷酸肌酸，18 µL 的 1 M 醋酸镁，93.33 µL 的 3 M 谷氨酸钾，50 µL 的 1 M HEPES KOH（pH 7.4），1.15 µL 的 332 mM 亚叶酸，100 µL 的 2 M 葡萄糖，以及 50 µL 的 20 种氨基酸混合物储备液（每种氨基酸浓度为 6 mM，按 Sun 等人28描述的方案配制）。</li>
		<li>用超纯去离子水将溶液终体积补至 1 mL。 
		注意：所有组分必须保持在冰上。最后加入氨基酸混合物，以避免氨基酸降解28。该溶液可分装为 330 µL 每份，于 -20 °C 保存至使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备油相脂质混合物 
	注意：此步骤需在通风橱中进行，并遵循氯仿操作的安全说明。
	<ol>
		<li>在通风橱中，将 17.3 µL 的 25 mg/mL POPC 储备液与 1.08 µL 的 50 mg/mL 聚丁二烯-嵌段-聚环氧乙烷（PEO-b-PBD）共聚物在 15 mL 玻璃小瓶中混合。 
		注意：最终油相脂质溶液中脂质浓度为 0.5 mM，其中 POPC 和 PEO-b-PBD 分别占 95% 和 5%。PEO-b-PBD 用于增强蛋白表达过程中的膜稳定性，但保持较低摩尔比以减少共聚物自聚集形成独立于脂质分子的胶束倾向29,30。</li>
		<li>在轻轻旋转玻璃小瓶的同时，小心通入氩气流以蒸发氯仿。</li>
		<li>用移液器向含有干燥脂质的 15 mL 玻璃小瓶中加入 1.2 mL 轻质矿物油。</li>
		<li>以最大速度涡旋振荡 10–20 秒，使脂质与油充分混合。溶解后的脂质-共聚物混合物呈浑浊状。</li>
		<li>为确保油中所有可能存在的脂质聚集体完全溶解并均匀分散，将玻璃小瓶置于约 50 °C 的烘箱中加热 20 分钟，随后再次以最大速度涡旋振荡 10–20 秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CFE 反应体系组装与包封（图 1 总结了以下步骤）。
	<ol>
		<li>在 1.5 mL 微量离心管中，将 270 µL 第 2.1 步制备的 CFE 外层缓冲液、15 µL 的 5 M NaCl 和 15 µL 的 4.5 M KCl 混合，配制成 300 µL 的 GUV 外层溶液。 
		注意：在此步骤中，向 GUV 外层溶液中加入 0.45 µL 的 1 M 1,4-二硫苏糖醇（DTT）。添加 NaCl 和 KCl 的目的是调节外层溶液的渗透压，使其与内层 CFE 溶液相匹配。NaCl 和 KCl 的具体添加量取决于所需的渗透压调整值。可根据需要单独或联合使用 NaCl 或 KCl 进行调节。</li>
		<li>将 300 µL 脂质-油混合物轻轻移加至 GUV 外层溶液上方。 
		注意：添加脂质-油混合物时，应避免油相与水相外层溶液混合。加样后，脂质-油混合物与 GUV 外层溶液之间应形成清晰可见的界面。</li>
		<li>将油-水界面在室温下孵育 2 小时，使脂质单层在界面处形成并稳定。</li>
		<li>同时，按照第 1.2.1 节组装含有编码膜蛋白变体或可溶性 GFP 的质粒 DNA 的 CFE 反应体系。用 4 µL 的 1 M 蔗糖替代 4 µL 的 5 mM SUV 溶液或水。该反应液将作为 GUV 内层溶液。 
		注意：使用渗透压计测量内外溶液的渗透压，并据此通过添加 NaCl 或水调节外层溶液的渗透压。CFE 反应体系的渗透压通常约为 1600 mOsm/Kg。向反应体系中添加蔗糖可提高内层溶液密度，从而使囊泡在离心步骤中能够穿过油-水界面。可替代蔗糖的试剂为 Opti-Prep 密度梯度溶液。</li>
		<li>向含有 CFE 反应体系的微量离心管中加入 600 µL 脂质-油混合物，并剧烈吹打约 1 分钟，使反应体系在脂质-油溶液中乳化，并在合成细胞周围形成脂质单层。 
		注意：最终溶液不应含有气泡，且呈不透明状。</li>
		<li>将内层溶液乳化液轻轻移加至 1.5 mL 微量离心管中已建立油-水界面的油层上方。 
		注意：操作时应避免扰动或破坏界面。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 2,000 x g 离心 10 分钟。 
		注意：该离心速度已针对本方案优化。Adir 等人31报道了不同的离心速度。</li>
		<li>离心结束后，使用移液器小心移除微量离心管中多余的油相和外层溶液，直至剩余体积约为 100 µL。 
		注意：GUV 沉淀通常可见于微量离心管底部。然而，无可见沉淀并不一定意味着无 GUV 生成。除使用移液器外，也可通过抽吸方式去除外层溶液上方的过量油相。关键是要确保完全去除脂质-油溶液，GUV 溶液中的油污染会导致图像质量下降。</li>
		<li>通过轻柔吹打，将 GUV 沉淀重悬于剩余的 100 µL 溶液中。随后将 GUV 溶液转移至洁净的 96 孔透明平底板中进行孵育。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 包封的 CFE 反应孵育与成像
<ol>
	<li>使用封板膜覆盖培养板，防止蒸发。将培养板在 37 °C 下孵育 5–6 小时。可使用酶标仪，并按照步骤 1.3.2 的说明为孵育步骤准备酶标仪。</li>
	<li>孵育结束后，将 96 孔板置于倒置显微镜的成像台上，显微镜需配备 EMCCD 相机（或 sCMOS 相机）、DAQ-MX 控制的激光器（或集成激光合束系统）以及 CSU-X1 转盘共聚焦系统（或激光扫描共聚焦系统）。聚焦于含有 GUV 的任意 ROI 区域，并使用 Plan-Apochromat 60 x/1.4 NA 物镜，在 488 nm 激发波长下采集图像。</li>
	<li>以 .tiff 格式保存 GUV 的图像。</li>
	<li>在图像处理软件（例如 ImageJ 或 Fiji）中打开图像。打开亮度/对比度 设置面板，调节亮度和对比度至合适水平，使荧光蛋白清晰可见。</li>
	<li>若目标是比较不同表达蛋白的信号强度，首先在图像 &#62; 堆栈 子菜单下的图像合成为堆栈 面板中，将含有不同蛋白的 GUV 单张图像合并为图像堆栈。然后，使用亮度/对比度 面板统一调节所有图像的亮度和对比度。</li>
</ol>

Cell-Free Expression of Membrane Proteins in Giant Unilamellar Vesicles

<ol><li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+under+construction%3A+In+vitro+reconstitution+of+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).</li>
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<li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+cells%3A+Past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Artificial cells: Past, present and future.</a> ACS Nano. 16 (10), 15705-15733 (2022).</li>
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作者声明无利益冲突。

几乎所有依赖分子或信息跨细胞膜传递的细胞过程，例如细胞信号传导或细胞兴奋，都需要膜蛋白的参与。因此，膜蛋白的重建已成为实现各种合成细胞设计以满足不同应用需求的主要瓶颈。传统的去垢剂介导的膜蛋白在生物膜中的重建方法需要使用大单层囊泡（GUV）生成技术，例如温和溶胀法或电形成法。溶胀法通常产生尺寸较小的囊泡，而当包封复杂溶液时（这在构建合成细胞时常遇到），电形成法的产率会显著下降32。此外，去垢剂会使膜蛋白溶解，而在重建过程中去除去垢剂可能导致蛋白质错误折叠33,34。相比之下，本文所介绍的方法依赖于膜蛋白在翻译过程中的共翻译插入脂双层，这一过程更接近细胞内天然的蛋白质生物合成途径22。
从技术角度来看，与电形成法和连续液滴界面交叉封装法（cDICE）等其他常见的封装方法相比7,8,35,36，本方案具有优势，其实现更为简便，生成GUV所需的唯一实验设备仅为离心机。与电形成法不同，倒置乳液法能够封装不同组合且浓度各异的分子。此外，与原始的倒置乳液技术相比25，该方法生成的GUV更稳定，适用于封装CFE裂解物或PURE系统。GUV稳定性的提高归因于GUV膜中含有二嵌段共聚物37，以及油水界面长时间孵育，使界面被脂质分子充分饱和。最后，与微流控方法不同，本方案无需使用微小通道和管路。因此，CFE反应一旦构建完成即可立即进行封装，且由于无需流体流动并避免了可能的堵塞，GUV组装时间更短，可防止CFE反应过早启动。尽管本方案中膜蛋白表达的演示仅限于PUREfrex反应，但该方法可扩展应用于其他现有的CFE系统（如基于裂解物的细菌或哺乳动物CFE系统）进行蛋白质合成。
此处介绍的方法存在一些局限性，这些局限性源于GUV形成过程对油相的依赖性以及对获得稳定GUV的需求。由于油水界面需要较长的孵育时间以实现界面稳定并获得较高的GUV产率，该方法通常比其他方法（如cDICE或微流控技术）耗时更长。此外，脂质组成主要局限于POPC，并可添加少量其他脂质或嵌段共聚物，而其他方法（如电形成法）则更适合掺入具有不同物理和化学性质的脂质。尽管本方法中GUV膜的组成为POPC与PBD-PEO的混合物，以最大化无细胞表达（CFE）的产率，但也可尝试测试GUV膜组成的其他可能变化。然而，对于其他膜蛋白，可能需要进一步优化实验参数。由于液滴乳化过程通过手动移液完成，因此该方法生成的GUV在尺寸上呈现多分散性和显著的异质性。此外，脂质溶解于有机相中可能导致GUV膜双层之间残留油层，或使成像腔室被油污染，从而影响成像质量。针对残留油相这一挑战，一种可能的解决方案是参照Tsumoto等人的研究38，用挥发性有机溶剂（如乙醚）替代矿物油，利用溶剂在GUV形成过程中的蒸发作用结合离心步骤来减少油残留。
尽管本研究未展示通道功能的直接证据，但受先前用于检测重建的机械敏感或光敏感通道功能的实验方法启发，本文概述了一种基于荧光显微镜的检测方法。已有报道指出，GluR0通道的开放会增加细胞膜对K+离子的通透性24。由于无细胞表达（CFE）反应体系本身已含有高浓度的K+，典型的钾离子指示剂将不适用于评估通道功能。然而，由于钾离子内流会改变膜电位，因此在谷氨酸存在的情况下，可使用对膜电位敏感的染料（如DiBAC4(3)22&#160;或BeRST 139）来报告GluR0的活性。
膜蛋白在合成细胞中的成功重建为构建具有前所未有功能、更接近天然细胞的合成细胞开辟了广阔前景。目前合成细胞的一个主要缺陷是其无法自我复制和循环利用能量。然而，通过依赖膜蛋白的光驱动和化学驱动能量再生系统，有望实现持久运行的合成细胞40。利用无细胞表达系统（CFE）可实现多种膜蛋白的共同重建，使其协同完成特定功能。例如，将本文所述的类似GluR0的配体门控离子通道与不同类型的电压门控离子通道共同重建，有望构建出具有兴奋性的类神经元合成细胞。

自下而上的合成生物学在过去的十年中受到越来越多的关注，作为一个新兴领域，其在生物工程、药物递送和再生医学中具有广泛的应用前景1,2合成细胞作为自下而上合成生物学的基石，其发展尤其受到广泛科学界的关注，原因在于合成细胞具有广阔的应用前景，以及类似天然细胞的物理和生化特性，这些特性有助于 体外 生物物理研究3,4,5,6合成细胞通常在细胞大小的巨型单层囊泡（GUVs）中构建，用以重现不同的生物学过程。细胞骨架的重建7,8光依赖性能量再生9细胞通讯10,11，以及生物传感12 是人工细胞中重建类细胞行为的若干尝试实例。
尽管某些细胞过程依赖可溶性蛋白，但天然细胞的许多特性（如感知和通讯）通常利用膜蛋白，包括离子通道、受体和转运蛋白。合成细胞发展中的一个主要挑战是膜蛋白的重建。虽然传统上在脂双层中重建膜蛋白的方法依赖于去污剂介导的纯化，但这些方法费时费力，对于对表达宿主有毒性的蛋白效果不佳，且通常不适用于在GUVs中重建膜蛋白13。
一种替代的蛋白质表达方法是无细胞表达（cell-free expression, CFE）系统。CFE系统在合成生物学中已成为一种强大工具，可实现 体外 使用细胞裂解物或纯化的转录-翻译系统表达多种蛋白质14. CFE系统也可被封装在GUVs中，从而实现区室化的蛋白质合成反应，这些反应可被编程用于多种应用，例如构建具有光捕获功能的合成细胞9 或机械敏感型生物传感器15,16与重组蛋白表达方法类似，膜蛋白在无细胞表达系统中的表达在技术上具有挑战性17聚集、错误折叠以及无细胞表达系统（CFE系统）中翻译后修饰的缺失是阻碍利用CFE系统成功合成膜蛋白的主要瓶颈。使用CFE系统进行自下而上膜蛋白重构的困难，部分原因在于缺乏依赖信号肽、信号识别颗粒、转运体及分子伴侣的复杂膜蛋白生物合成途径。然而，近年来多项研究表明，在翻译过程中存在微粒体或脂质体等膜结构可促进膜蛋白的成功表达。18,19,20,21此外，Eaglesfield 等人和 Steinküher 等人发现，在膜蛋白的N端引入特定的疏水结构域（即信号肽）可显著提高其表达水平22,23综上所述，这些研究表明，如果蛋白质翻译过程在GUV膜存在的情况下进行，并且使用了适当的N端信号肽，则可以克服膜蛋白在合成细胞中重组的难题。
本文介绍了一种利用重组元件蛋白合成（PURE）无细胞表达系统（CFE）在巨大脂质体（GUVs）中重构膜蛋白的封装方案。选择细菌谷氨酸受体24（GluR0）作为模型膜蛋白，研究其N端信号肽对其膜重构的影响。通过构建一种突变型GluR0（记为PRSP-GluR0），研究了蛋白视紫红质信号肽（proteorhodopsin signal peptide）的作用——该信号肽此前已被Eaglesfield等人22证明可提高膜蛋白的重构效率，并将其表达情况及膜定位与携带天然信号肽的野生型GluR0（后文简称WT-GluR0）进行比较。本方案基于倒置乳液法25，并进行了若干改进，使其更适用于CFE系统的封装。在该方法中，首先将CFE反应体系与油相脂质溶液进行乳化，形成含有CFE系统的微米级液滴，并由单层脂质膜稳定。随后将乳化液滴铺展于另一层富含脂质单层的油-水界面之上。通过离心力驱动乳化液滴穿过油-水界面。在此过程中，液滴获得第二层脂质单层，从而形成双层脂质囊泡。含有CFE反应体系的GUVs随后被孵育，在此期间膜蛋白得以表达并整合入GUV的膜结构中。尽管本方案具体针对GluR0的无细胞表达，但也可用于其他膜蛋白的无细胞合成，或应用于不同的合成细胞研究，如细胞骨架重构或膜融合研究26。

<table><tbody><tr><td>100 nm 聚碳酸酯滤膜</td><td>STERLITECH</td><td>1270193</td><td></td></tr><tr><td>96 孔透明底板</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>BioTek Synergy H1M 杂交多模式读板仪</td><td>Agilent</td><td>11-120-533</td><td></td></tr><tr><td>磷酸肌酸</td><td>Millipore Sigma</td><td>10621714001</td><td></td></tr><tr><td>CSU-X1 共聚焦扫描单元</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>密度梯度介质（Optiprep）</td><td>Millipore Sigma</td><td>D1556</td><td>可选在内层溶液中替换为蔗糖</td></tr><tr><td>滤膜支撑片</td><td>Avanti</td><td>610014</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 微量离心管（1.5 mL）</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>亚叶酸钙盐水合物</td><td>Millipore Sigma</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Millipore Sigma</td><td>158968</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>iXon X3 相机&amp;nbsp;</td><td>Andor</td><td>DU-897E-CS0&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酸钾盐一水合物</td><td>Millipore Sigma</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>轻质矿物油</td><td>Millipore Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>四水合乙酸镁&amp;nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>M5661</td><td></td></tr><tr><td>微型挤出器套件（含注射器架和挤出支架）</td><td>Avanti</td><td>610020</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX81 倒置显微镜&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>IX21</td><td></td></tr><tr><td>Olympus PlanApo N 60x 油镜物镜&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>1-U2B933&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PEO-b-PBD</td><td>Polymer Source</td><td>P41745-BdEO</td><td></td></tr><tr><td>pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP 质粒 DNA</td><td>自制</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) 质粒 DNA</td><td>自制</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pET28b-WT-GluR0-sfGFP 质粒 DNA</td><td>自制</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>氯仿中的 POPC 脂质&amp;nbsp;</td><td>Avanti</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Millipore Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>PUREfrex 2.0</td><td>Cosmo Bio USA</td><td>GFK-PF201</td><td></td></tr><tr><td>核糖核苷酸溶液套装</td><td>New England BioLabs</td><td>N0450</td><td></td></tr><tr><td>鼠源 RNase 抑制剂</td><td>New England BioLabs</td><td>M0314S</td><td></td></tr><tr><td>RTS 氨基酸样品套装</td><td>Biotechrabbit</td><td>BR1401801</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>亚精胺</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Millipore Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>VAPRO 5600 型蒸汽压渗透压仪</td><td>ELITechGroup</td><td>VAPRO 5600</td><td></td></tr></tbody></table>

通过包封无细胞表达系统重构细菌谷氨酸受体通道

Reconstitution of the Bacterial Glutamate Receptor Channel by Encapsulation of a Cell-Free Expression System

无细胞表达（CFE）系统是合成生物学中的强大工具，可实现合成细胞中生物传感和能量再生等细胞功能的仿生模拟。然而，要重建多种细胞过程，需要成功将膜蛋白重构到合成细胞的膜中。尽管可溶性蛋白在常见的CFE系统中通常能够成功表达，但将膜蛋白重构到合成细胞的脂双层中仍具挑战性。本文展示了一种基于在合成细胞内封装并孵育CFE反应的方法，用于在作为模型合成细胞的巨型单层囊泡（GUVs）中重构模型膜蛋白——细菌谷氨酸受体（GluR0）。利用该平台，本文展示了将GluR0的N端信号肽替换为蛋白视紫红质信号肽后，对GluR0在杂合GUVs膜中成功实现共翻译转运的影响。该方法提供了一种可靠的流程，有望实现多种膜蛋白在合成细胞中的无细胞重构。

在将CFE反应进行封装之前，两种携带天然及蛋白视紫红质信号肽的GluR0-sfGFP变体（信号肽序列见原文） 补充材料 表1），可溶性sfGFP在大量反应中分别表达，并通过酶标仪检测sfGFP信号以监测其表达情况（图 2A）。膜蛋白在无或有100 nm SUVs的条件下表达。此外，利用关联sfGFP信号与其浓度的标准曲线（补充图1），合成蛋白质的浓度被估算（补充表 2）。显然，可溶性sfGFP的表达量在所有三种蛋白中最高，这表明膜蛋白的表达对无细胞表达系统（CFE）造成了负担，从而减缓了反应速度并降低了产量。此外，平均而言，在含有小单层囊泡（SUVs）的条件下表达膜蛋白的反应，其sfGFP信号高于缺乏SUVs的反应。该观察结果与Steinküher等人的研究发现一致，即膜蛋白的表达会降低CFE系统合成蛋白质的能力。23然而，鉴于在体相 CFE 反应中已成功证明蛋白质的表达，可以推断包封的 CFE 也能够在 GUVs 内部合成蛋白质。 
接下来，使用倒置乳液法将单个CFE反应封装到GUV中，以表达GluR0的不同变体，即WT-GluR0、PRSP-GluR0和可溶性sfGFP。含有GluR0天然信号肽的WT-GluR0表现出优异的表达水平和细胞膜定位（图2B，左图），而其对应物PRSP-GluR0（带有蛋白视紫红质N端信号肽）则未表现出类似的强膜定位。PRSP-GluR0更倾向于形成聚集体和点状结构（图2B，中图）。如预期所示，可溶性sfGFP在GUV中表达并保留在GUV腔内（图2B，右图；GUV群体的图像见补充图2）。
<img alt="嵌段共聚物囊泡的形成；通过离心步骤展示PEO-PBD组装的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66595/66595fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：反相乳液的实验步骤。（1）本图可视化展示了实验方案中步骤2.3.1至步骤2.3.3，以说明脂质单层在脂质-油混合物与外层缓冲液界面处的组装过程。（2）本图展示步骤2.3.5，表示包裹含有内层CFE溶液乳化液滴的脂质单层的形成。（3）步骤2.3.6显示将具有脂质单层的GUVs加入微量离心管中，脂质单层位于脂质-油混合物与外层缓冲液的界面处。（4）此处描绘了步骤2.3.7，其中通过离心在外层溶液中形成GUV沉淀。（5）此处展示了步骤2.3.8，表示去除多余的脂质-油混合物及外层溶液的过程。（6）最后，此处描绘了步骤2.3.9，其中GUV沉淀被重新悬浮于外层溶液中，GUVs即可用于孵育，随后进行成像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66595/66595fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="不同条件下的荧光生长曲线和显微镜图像；蛋白质表达情况。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66595/66595fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：在整体无细胞表达反应（CFE）及包裹CFE反应的GUV中的蛋白质表达。 （A）表达WT-GluR0-sfGFP、PRSP-GluR0-sfGFP和可溶性sfGFP的单个整体CFE反应的荧光读数。可溶性sfGFP的图表数据来自2.5 µL反应（标准反应体积为20 µL），以避免酶标仪测量信号过饱和。数据以均值±标准差表示，n = 3。（B）左图：表达WT-GluR0-sfGFP的包裹CFE反应GUV的代表性共聚焦图像。中图：表达PRSP-GluR0-sfGFP的包裹CFE反应GUV的代表性共聚焦图像。右图：表达可溶性sfGFP的包裹CFE反应GUV的代表性共聚焦图像。比例尺：10 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66595/66595fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图1：sfGFP信号校准曲线及其相应的线性回归分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66595/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图2：表达（左）WT-GluR0-sfGFP、（中）PRSP-GluR0-sfGFP 和（右）可溶性 sfGFP 的 GUV 群体的代表性共聚焦图像。 比例尺：10 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66595/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表1：野生型和蛋白视紫红质信号肽的氨基酸序列。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66595/Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表 2：大规模 CFE 反应中合成蛋白质的浓度。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66595/Supplementary%20Table%202.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案描述了使用倒置乳液法将无细胞表达（CFE）系统包裹于巨型单层囊泡（GUV）内，以研究模型膜蛋白在脂双层中的合成与整合。

无细胞表达（CFE）系统是合成生物学中的强大工具，可模拟细胞功能，如生物传感和能量转换……

本方案针对利用倒置液滴乳化法构建的合成细胞中，膜蛋白在脂双层内的重组装过程。采用倒置液滴乳化法的优势在于能够生成为无细胞表达膜蛋白提供稳定环境的合成细胞。本方案为该领域的研究人员提供了一种可靠的方法，可在合成细胞内利用无细胞表达系统合成膜蛋白。我的实验室正在通过一组明确定义的离子通道重建动作电位，以在合成细胞中重构各种离子通道。首先，将氩气的温和气流吹入含有POPC脂质的玻璃小瓶中，同时轻轻旋转小瓶。当脂质在小瓶底部干燥形成薄膜后，松松地盖上瓶盖，然后将其转移至干燥器中。一小时后，加入 0.5 毫升超纯去离子水以溶解脂质膜。将溶液涡旋振荡两分钟。接着，将两个滤膜支撑物浸泡于去离子水中。将它们放置在每个内膜支撑架上。然后将一片100纳米的聚碳酸酯滤膜置于两个内膜支撑架之间，并用挤出器外壳和固定螺母固定。将装置放入挤出器支架中，完成微型挤出装置的组装。接下来，将脂质与水的混合物装入一支1毫升气密型注射器中。使用摆臂夹具将注射器固定在微型挤出器的一端。将第二支注射器插入微型挤出器的另一端，并确保其完全压下。现在将原始注射器中的脂质水混合物通过装置推入空注射器中。重复挤出11次后，将小单层囊泡（SUVs）转移至一个1.5毫升的微量离心管中。为构建无细胞表达体系，用移液器依次加入溶液1至溶液3，以及编码可溶性sfGFP或谷氨酸受体sfGFP变体的DNA质粒。将小鼠RNA酶和SUV溶液加入一个样品瓶中。加入超纯去离子水，使反应体系总体积达到20微升。将无细胞表达溶液转移至96孔圆锥形V底板中。将酶标板置于酶标仪中，在 37 摄氏度下孵育四到五小时。设置酶标仪的增益为 100，激发波长为 485 纳米，发射波长为 528 纳米，运行时间为五小时，检测间隔为每两分钟读取一次数据。每两分钟测量一次 GFP 信号，以实时监测无细胞反应。可溶性sfGFP在所有三种蛋白中表达量最高。首先，在1.5毫升微量离心管中配制GUV外层缓冲液。将亚精胺、ATP、GTP、CTP、UTP、磷酸肌酸、醋酸镁和谷氨酸钾混合。HEPES、氢氧化钾、亚叶酸、葡萄糖和氨基酸储备液。加入超纯去离子水，定容至1毫升。接下来，在通风橱中，将17.3 µL的POPC储备液加入一个15 mL玻璃小瓶中。随后用移液器加入1.08 µL的PEO-b-PBD共聚物。一边缓慢向玻璃小瓶中通入氩气气流，一边轻轻旋转小瓶，以蒸发氯仿。然后用移液器将1.2毫升轻质矿物油加入玻璃小瓶中。以最大速度涡旋混合脂质和油10至20秒。将玻璃小瓶置于约50摄氏度的烘箱中20分钟，随后再次以最大速度涡旋10至20秒。接下来，将270微升GUV外层溶液用移液器加入1.5毫升微量离心管中。向其中分别加入15微升5摩尔氯化钠和15微升4.5摩尔氯化钾溶液。轻轻将300微升脂质与油的混合物移至GUV外层溶液上方。孵育后，通过移液将溶液1至3、编码可溶性sfGFP或小鼠谷氨酸受体sfGFP变体的DNA质粒、RNA酶以及一摩尔浓度的蔗糖加入到一个样品瓶中，组装CFE反应体系。加入超纯去离子水，使反应总体积达到20微升。将600微升脂质油混合物加入含有20微升反应混合物的微量离心管中。用力上下吹打一分钟，使反应液乳化。将内部乳化液轻柔地铺加在离心管中油层上方。在4 °C条件下，以2,000 ×g离心10分钟。接下来，小心地用移液器吸出微量离心管中多余的油层和外层溶液。轻轻混匀残留溶液中的 GOV 沉淀，使其重新悬浮。将 GOV 溶液转移至洁净的 96 孔透明平底板中，用于孵育。将密封的培养板转移至酶标仪中，在37摄氏度下孵育5至6小时。孵育结束后，将培养板置于倒置共聚焦显微镜上，聚焦于含有GUVs的感兴趣区域。然后在488纳米激发波长下采集图像。将图像以TIFF格式保存。使用图像处理软件打开图像。单击亮度/对比度设置面板以打开它，然后调节亮度和对比度，使荧光蛋白可见。包裹在GUV中的野生型谷氨酸受体无细胞表达反应表现出优异的表达水平和膜定位效果。PRSP-谷氨酸受体易于聚集并形成点状结构。可溶性sfGFP在GUVS中表达并停留在GUV腔内。

reconstitution-bacterial-glutamate-receptor-channel-encapsulation

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

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本方案描述了利用冷冻电子显微镜测定离子通道结构的技术，包括用于在哺乳动物细胞中高效表达基因且操作简便、毒性最低的杆状病毒系统，蛋白质提取、纯化及质量检测，样品载网的制备与筛选，以及数据收集与处理。...

人源脂质敏感型阳离子通道TRPC3的表达与纯化及其通过单颗粒冷冻电镜进行结构解析

本文介绍了一种在分离的原代海马神经元培养物中研究谷氨酸受体（GluR）转运的方法。该方法结合使用抗体标记技术对内源性或过表达的受体进行标记，并联合药理学手段，通过调控受体的内吞或再循环过程，从而鉴定调节GluR表面表达的分子机制。...

一种通过抗体饲喂法研究分离原代海马神经元培养中谷氨酸受体转运的方法

在有机相与水相溶剂的界面处，经设计的两亲性弹性蛋白样蛋白会响应环境参数，自组装形成囊泡、纤维和凝聚体等复杂的超分子结构。所述组装方案可制备具有可调控特性的蛋白膜基区室（PMBCs），实现多种货物分子的包封。...

弹性蛋白样蛋白的定向组装形成特定超分子结构及体外货物包封

本研究介绍了一种利用位点特异性标记技术在G蛋白偶联受体（GPCRs）上开展单分子荧光共振能量转移（smFRET）实验的详细操作流程 通过...

利用单分子FRET可视化膜受体的构象动力学

本方案描述了用于构建合成细胞的无细胞蛋白质合成（CFPS）系统。该方案概述了在不同微区室中的关键步骤及代表性结果，旨在为合成细胞研究领域的各类实验室建立最佳实践，推动合成细胞研发的进展。...

无细胞蛋白质合成系统用于构建合成细胞

学习利用反相液滴乳化法在合成细胞脂质双层中重建膜蛋白的无细胞表达技术。该方法为神经科学和膜蛋白功能研究提供了稳定的实验平台。

通过包封无细胞表达系统重构细菌谷氨酸受体通道

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