Name: 用于分析肠道粘膜免疫反应的免疫活性肠芯片模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 了解免疫活性肠芯片模型的构建方法，用于分析肠道粘膜免疫反应和微生物定植。该模型整合三维结构和多种细胞类型，为研究宿主-病原体相互作用及感染性疾病治疗靶点提供生理相关的人源化体外平台。

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本工作由合作研究中心PolyTarget 1278（项目编号316213987）为V.D.W.和A.S.M.提供资金支持。A.F.和A.S.M.还感谢德国卓越战略计划下的卓越集群“&#34;微生物组平衡&#34;”提供的额外资金支持——卓越集群EXC 2051，项目编号690 390713860。我们感谢Astrid Tannert以及耶拿生物光子学与成像实验室（JBIL）为我们提供使用其蔡司共聚焦激光扫描显微镜ZEISS LSM980的机会。图1C&#160;和图2使用Biorender.com制作。

Enhanced Intestine-on-Chip Platform for Immunological Insight

<ol><li>Alonso-Roman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-on-chip+models+for+infectious+disease+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Organ-on-chip models for infectious disease research.</a> Nat Microbiol. 9 (4), 891-904 (2024).</li>
<li>Fahrner, R., Groger, M., Settmacher, U., Mosig, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+integration+of+natural+killer+cells+in+a+microfluidically+perfused+liver+on-a-chip+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Functional integration of natural killer cells in a microfluidically perfused liver on-a-chip model.</a> BMC Res Notes. 16 (1), 285(2023).</li>
<li>Raasch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidically+supported+biochip+design+for+culture+of+endothelial+cell+layers+with+improved+perfusion+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Microfluidically supported biochip design for culture of endothelial cell layers with improved perfusion conditions.</a> Biofabrication. 7 (1), 015013(2015).</li>
<li>Deinhardt-Emmer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-infection+with+Staphylococcus+aureus+after+primary+influenza+virus+infection+leads+to+damage+of+the+endothelium+in+a+human+alveolus-on-a-chip+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Co-infection with Staphylococcus aureus after primary influenza virus infection leads to damage of the endothelium in a human alveolus-on-a-chip model.</a> Biofabrication. 12 (2), 025012(2020).</li>
<li>Kaden, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+%26+characterization+of+expandable+human+liver+sinusoidal+endothelial+cells+and+their+application+to+assess+hepatotoxicity+in+an+advanced+in+vitro+liver+model%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Generation & characterization of expandable human liver sinusoidal endothelial cells and their application to assess hepatotoxicity in an advanced in vitro liver model.</a> Toxicology. 483, 153374(2023).</li>
<li>Maurer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+immunocompetent+intestine-on-chip+model+as+in+vitro+platform+for+functional+and+microbial+interaction+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional immunocompetent intestine-on-chip model as in vitro platform for functional and microbial interaction studies.</a> Biomaterials. 220, 119396(2019).</li>
<li>Hoang, T. N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+aspergillosis-on-chip%3A+A+quantitative+treatment+study+of+human+aspergillus+fumigatus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Invasive aspergillosis-on-chip: A quantitative treatment study of human aspergillus fumigatus infection.</a> Biomaterials. 283, 121420(2022).</li>
<li>Kaden, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+intravenous+caspofungin+administration+using+an+intestine-on-chip+reveals+altered+Candida+albicans+microcolonies+and+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modeling of intravenous caspofungin administration using an intestine-on-chip reveals altered Candida albicans microcolonies and pathogenicity.</a> Biomaterials. 307, 122525(2024).</li>
<li>Shah, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidics-based+in+vitro+model+of+the+gastrointestinal+human-microbe+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface.</a> Nat Commun. 7, 11535(2016).</li>
<li>Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+human+endothelial+cells+derived+from+umbilical+veins.+Identification+by+morphologic+and+immunologic+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria.</a> J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).</li>
<li>Mosig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+functions+of+monocyte+subsets+in+familial+hypercholesterolemia%3A+Potential+function+of+cd14%2B+cd16%2B+monocytes+in+detoxification+of+oxidized+ldl%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Different functions of monocyte subsets in familial hypercholesterolemia: Potential function of cd14+ cd16+ monocytes in detoxification of oxidized ldl.</a> FASEB J. 23 (3), 866-874 (2009).</li>
<li>Peterson, M., Mooseker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+enterocyte-like+brush+border+cytoskeieton+of+the+c2bbe+clones+of+the+human+intestinal+cell+line%2C+caco-2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeieton of the c2bbe clones of the human intestinal cell line, caco-2.</a> J Cell Sci. 102, Pt 3 581-600 (1992).</li>
<li>Shin, W., Hinojosa, C. D., Ingber, D. E., Kim, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intestinal+morphogenesis+controlled+by+transepithelial+morphogen+gradient+and+flow-dependent+physical+cues+in+a+microengineered+gut-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Human intestinal morphogenesis controlled by transepithelial morphogen gradient and flow-dependent physical cues in a microengineered gut-on-a-chip.</a> iScience. 15, 391-406 (2019).</li>
<li>Kim, H. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-on-a-chip+microenvironment+induces+human+intestinal+cells+to+undergo+villus+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Gut-on-a-chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation.</a> Integr Biol (Camb). 5 (9), 1130-1140 (2013).</li>
<li>Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).</li>
<li>Karra, N., Fernandes, J., James, J., Swindle, E. J., Morgan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+membrane+properties+on+cell+growth+in+an+%27airway+barrier+on+a+chip%27%5BTitle%5D)+AND+%22Organs-on-a-Chip%22%5BJournal%5D)">The effect of membrane properties on cell growth in an 'airway barrier on a chip'.</a> Organs-on-a-Chip. 5, 10025(2023).</li>
</ol>

M.R. 是 Dynamic42 GmbH 的首席执行官，并持有该公司股权。A.S.M. 是 Dynamic42 GmbH 的科学顾问，并持有该公司股权。

本方案详细介绍了构建具有免疫活性的肠芯片模型所需的各个步骤。我们描述了具体的技术方法以及可能的检测手段，包括免疫荧光显微镜、细胞因子和代谢物分析、流式细胞术、蛋白质和基因分析，以及通透性测定。
该模型由原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs）、单核细胞来源的巨噬细胞和单核细胞来源的树突状细胞组成，并与一层三维培养的肠上皮细胞共培养，后者包含分泌黏液型、吸收型、肠内分泌型以及类似潘氏细胞的细胞群体，如先前研究所述6,14。在执行本实验方案的各个步骤时，需注意若干关键要点。在整个操作过程中，应避免微流控系统中产生气泡。因此，在操作生物芯片或管路时，始终采用反向移液法（从第二停点吸取液体，并仅释放至第一停点）。为防止对生物芯片内的细胞造成过高压力或剪切力，移液时务必轻柔操作，并在向生物芯片内加样时保持相对腔室处于封闭状态（例如，在更换上腔培养基时，应使用相应塞子封闭下腔）。该生物芯片允许在聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜的两侧接种细胞。因此，该模型可构建为在PET膜下方形成类似肠绒毛结构，或在膜表面向上生长。根据具体研究需求，细胞的某种取向可能在物理相互作用方面具有特定优势，例如借助重力促进悬浮于流动培养基中的循环细胞在膜上的黏附。
由于微流控介质流动，极化的肠细胞形成类似隐窝样和绒毛样的三维组织结构，通过紧密连接和黏附连接构成的致密网络形成强大的顶端组织屏障6此外，整合的先天免疫细胞可增强肠道屏障功能，并能够详细研究细胞因子和免疫细胞对各种刺激的反应，包括供体特异性的免疫反应3,6该模型提供了一个生理学上相关的平台，用于研究微生物共生体（例如， 鼠李糖乳杆菌6）和病原体（例如， 白色念珠菌6,8 人类肠道的模型被用于研究肠道微生物组成变化的机制以及黏膜免疫反应的调控。6在本研究中，我们展示了如何重建肠腔的生理性免疫耐受，并支持活体微生物的稳态定植。此外，通过在模型腔面预先定植益生菌 鼠李糖乳杆菌 组织侵袭能力降低 白色念珠菌 并限制其向血管区室的转位，类似于 体内 该研究证实了该模型在生理相关条件下研究肠道微生物相互作用、免疫反应及致病机制方面的潜力。 体外.
然而，该芯片平台仍存在局限性，即使用了源自癌症的肠道细胞，这些细胞无法完全代表人体肠道，以及使用了原代内皮细胞和免疫细胞。可通过在灌注条件下将模型置于低氧培养箱中培养，以建立低氧环境，从而更真实地模拟生理情况。 体内 人体肠道状况
与其他器官芯片（OoC）平台相比，例如 Kim 等人发表的&#34;肠芯片&#34;模型14,15，本研究所构建的组织模型起始细胞数量约高出10倍。例如，这使得在单次实验中可同时分析多达三个免疫荧光染色面板。较高的细胞数量还有助于简化终点分析，包括流式细胞术、蛋白质印迹分析以及其他现成的标准检测方法，如需要细胞培养上清液的细胞因子谱分析和乳酸脱氢酶（LDH）测定。单次实验获得多种读数可降低总体成本并缩短实验时间。由于该生物芯片平台采用标准化设计，具备行业通用的接口和尺寸（芯片为显微镜载玻片规格，接口为鲁尔锁（luer lock）格式，并按96孔板矩阵排列），因此可兼容来自众多制造商的现成硬件解决方案。这还包括多种不同材料和孔径大小的膜。孔径大小可影响细胞生长和组织完整性16，以及细胞迁移能力。
总之，本方案介绍了一种详细且可调节的肠芯片模型，可模拟人体肠道环境的关键要素。该模型提供了一个可扩展且高效的平台，用于深入开展肠道微生物群与肠道宿主组织的相关研究，尤其聚焦于宿主免疫反应及肠道病理生理学。因此，该模型能够弥合传统 体外 模型与人类生物学，使其成为肠道生物学深入研究的重要工具。

器官芯片（Organ-on-Chip, OoC）系统是一种新兴的三维细胞培养技术，能够弥合传统二维细胞培养与动物模型之间的差距。OoC 平台通常包含一个或多个腔室，其中在多种支架（如膜材料或水凝胶）上培养具有组织特异性的细胞1。这些模型能够模拟一种或多种明确的器官特异性功能。通过泵系统实现细胞培养基的持续微流控灌注，以清除细胞代谢废物，提供营养物质和生长因子，促进细胞分化，并重现关键的体内（in vivo）环境条件。当整合免疫细胞后，OoC 系统可在体外（in vitro）模拟人体免疫反应2。迄今为止，已有多种器官和功能单元的模型被成功构建1，包括血管3、肺4、肝2,5和肠6模型，这些系统可用于药物测试5,7和感染机制研究6,8。
本文介绍一种集成化的人体肠芯片模型，该模型结合了形成绒毛样和隐窝样类器官三维拓扑结构的人体上皮细胞，并整合了内皮细胞层以及组织驻留型巨噬细胞。该模型在一种显微镜载片规格的微流控灌注式生物芯片中进行培养。&#160;每块生物芯片包含两个独立的微流控腔室。每个腔室由一层多孔聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜分隔为上室和下室。该膜本身亦作为细胞在两侧生长的支架。膜上的孔隙可实现细胞层之间的细胞互作及细胞迁移。每个腔室均可通过两个雌性鲁尔锁接头尺寸的端口进行操作。此外，可选配一个额外的微型鲁尔锁接头尺寸端口，用于通达上室或下室（图1）。
器官芯片（OoC）平台能够从单次实验中获取多种读数。肠芯片专门设计用于结合灌注式三维细胞培养、流出液分析和荧光显微镜技术，以评估细胞标志物表达、代谢速率、免疫反应、微生物定植与感染以及屏障功能3,6,8。该模型包含组织驻留的免疫细胞，并实现了活体微生物与宿主组织的直接接触，相较于其他已发表的模型具有优势9。此外，上皮细胞可自组织形成三维结构，为活体微生物群的定植提供生理相关的界面6。

<table><tbody><tr><td>96孔板，黑色，透明底</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10000631</td><td>耗材</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Roth</td><td>3738.4</td><td>化学品</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure 山羊抗小鼠 IgG（H+L）</td><td>杰克逊免疫研究公司</td><td>715-545-150</td><td>次级抗体血管染色与上皮染色</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 AffiniPure，驴抗兔IgG（H+L）</td><td>杰克逊免疫研究公司</td><td>711-605-152</td><td>二抗上皮染色</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647，驴抗兔IgG（H+L）</td><td>赛默飞世尔科技，英坦科技</td><td>A31573</td><td>二抗血管染色</td></tr><tr><td>Axiocam ERc5s 相机</td><td>蔡司</td><td>426540-9901-000</td><td>技术设备</td></tr><tr><td>无酚红基础培养基 MV</td><td>Promocell</td><td>C-22225</td><td>细胞培养耗材</td></tr><tr><td>生物芯片</td><td>动态 42</td><td>BC002</td><td>微流控耗材</td></tr><tr><td>BSA 第 V 组分</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>细胞培养耗材</td></tr><tr><td>C2BBe1（Caco-2 克隆）</td><td>ATCC</td><td>CRL-2102</td><td>上皮细胞来源</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td>化学品</td></tr><tr><td>CO2 培养箱</td><td>Heracell</td><td>150i</td><td>技术设备</td></tr><tr><td>人胎盘IV型胶原蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533</td><td>细胞培养耗材</td></tr><tr><td>盖玻片（24 × 40 mm；#1.5）</td><td>Menzel-Gl&amp;auml;血清</td><td>15747592</td><td>耗材</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure，驴抗山羊IgG（H+L）</td><td>杰克逊免疫研究公司</td><td>705-165-147</td><td>二抗血管染色</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure，驴抗大鼠IgG（H+L）</td><td>杰克逊免疫研究公司</td><td>712-165-150</td><td>二抗上皮染色</td></tr><tr><td>德科赛普特 PUR</td><td>Dr. Schuhmacher</td><td>00-323-100</td><td>细胞培养耗材</td></tr><tr><td>DMEM高糖</td><td>Gibco</td><td>41965-062</td><td>细胞培养耗材</td></tr><tr><td>DMEM高糖无酚红培养基</td><td>Gibco</td><td>31053028</td><td>细胞培养耗材</td></tr><tr><td>DPBS (-/-)</td><td>Gibco</td><td>14190-169</td><td>细胞培养耗材</td></tr><tr><td>DPBS (+/+)</td><td>Gibco</td><td>14040-133</td><td>细胞培养耗材</td></tr><tr><td>EDTA 溶液</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td>细胞培养耗材</td></tr><tr><td>内皮细胞生长培养基</td><td>Promocell</td><td>C-22020</td><td>细胞培养耗材</td></tr><tr><td>内皮细胞生长培养基添加剂混合物</td><td>Promocell</td><td>C-39225</td><td>细胞培养耗材</td></tr><tr><td>乙醇 96%，未变性</td><td>Nordbrand-Nordhausen</td><td>410</td><td>化学品</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>invitrogen</td><td>10270106</td><td>细胞培养耗材</td></tr><tr><td>异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖（3-5 kDa）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD4-100MG</td><td>化学品</td></tr><tr><td>荧光封片剂</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td>化学品</td></tr><tr><td>庆大霉素（10 mg/mL）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1272</td><td>细胞培养耗材</td></tr><tr><td>GlutaMAX 补充剂（100 倍浓缩）</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>细胞培养耗材</td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>细胞培养耗材</td></tr><tr><td>Hoechst（双苯并咪唑）H33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14533</td><td>上皮染色</td></tr><tr><td>全转铁蛋白（5 mg/mL），转铁蛋白，全型，人血浆</td><td>默克密理博</td><td>616397</td><td>细胞培养耗材</td></tr><tr><td>人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子</td><td>Peprotech</td><td>300-30</td><td>细胞培养耗材</td></tr><tr><td>人重组 M-CSF</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td>细胞培养耗材</td></tr><tr><td>照明装置</td><td>Zeiss</td><td>HXP 120 C</td><td>荧光显微镜设置</td></tr><tr><td>激光扫描显微镜</td><td>Zeiss</td><td>CLSM980</td><td>荧光显微镜设置</td></tr><tr><td>盐酸利多卡因</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5647</td><td>细胞培养耗材</td></tr><tr><td>脂多糖（LPS）</td><td>Sigma</td><td>L2630</td><td>细胞培养耗材</td></tr><tr><td>Loftex 湿巾</td><td>Loftex</td><td>1250115</td><td>耗材</td></tr><tr><td>低吸附管（聚苯乙烯，5 mL）</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td>耗材</td></tr><tr><td>顶部盖帽用鲁尔接头（M）</td><td>Mo Bi Tec</td><td>M3003</td><td>微流控耗材</td></tr><tr><td>雄性迷你鲁尔接头塞，四联排，聚丙烯材质，不透明</td><td>微流控芯片实验室</td><td>09-0556-0336-09</td><td>微流控耗材</td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸溶液</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td>细胞培养耗材</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Roth</td><td>8388.2</td><td>化学品</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer 5</td><td>荧光显微镜设置</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Menzel</td><td>MZ-0002</td><td>耗材</td></tr><tr><td>单克隆小鼠抗人CD68抗体（KP1）</td><td>赛默飞世尔科技，英坦科技</td><td>14-0688-82</td><td>初级抗体血管染色</td></tr><tr><td>单克隆大鼠抗人E-钙黏蛋白抗体（DECMA-1）</td><td>Sigma-Aldrich，Millipore</td><td>MABT26</td><td>一抗上皮染色</td></tr><tr><td>Multiskan Go 酶标仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>51119300</td><td>技术设备</td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>Biozol</td><td>LIN-END9010-10</td><td>化学品</td></tr><tr><td>光学切片</td><td>Zeiss</td><td>ApoTome</td><td>荧光显微镜设置</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>细胞培养耗材</td></tr><tr><td>凝胶塞</td><td>Cole Parmer</td><td>GZ-45555-56</td><td>微流控耗材</td></tr><tr><td>多克隆山羊抗人血管内皮钙黏蛋白抗体</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF938</td><td>初级抗体血管染色</td></tr><tr><td>多克隆兔抗人血管性血友病因子抗体</td><td>Dako</td><td>A0082</td><td>初级抗体血管染色</td></tr><tr><td>多克隆兔抗人 ZO-1 抗体</td><td>赛默飞世尔科技，英坦科技</td><td>61-7300</td><td>一抗上皮染色</td></tr><tr><td>电源显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Eplax Vp232</td><td>荧光显微镜设置</td></tr><tr><td>Primovert 显微镜</td><td>Zeiss</td><td>415510-1101-000</td><td>技术设备</td></tr><tr><td>Reglo ICC 蠕动泵</td><td>Ismatec</td><td>ISM4412</td><td>技术设备</td></tr><tr><td>SAHA（伏立诺他）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SML0061-25MG</td><td>化学品</td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Fluka</td><td>47036</td><td>化学品</td></tr><tr><td>S-Monovette，7.5 mL Z-凝胶管</td><td>Sarstedt</td><td>01.1602</td><td>耗材</td></tr><tr><td>S-Monovette，9.0 mL K3E</td><td>Sarstedt</td><td>02.1066.001</td><td>耗材</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Gibco</td><td>11360-088</td><td>细胞培养耗材</td></tr><tr><td>4.5 mL 储液罐</td><td>ChipShop</td><td>10000079</td><td>微流控耗材</td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝染色液</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>细胞培养耗材</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Gibco</td><td>11538876</td><td>细胞培养耗材</td></tr><tr><td>导管</td><td>动态 42</td><td>ST001</td><td>微流控耗材</td></tr><tr><td>镊子（Pr&amp;auml;DUMONT 弯头镊子 Inox08，5/45，0.06 mm</td><td>Roth</td><td>K343.1</td><td>耗材</td></tr><tr><td>麦胚凝集素（WGA）</td><td>赛默飞世尔科技，英坦科技</td><td>W32464</td><td>上皮染色</td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>BE02-060F</td><td>细胞培养耗材，造血细胞培养基</td></tr><tr><td>细胞培养多孔板，24 孔，无菌</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662 160</td><td>耗材</td></tr><tr><td>细胞培养多孔板，6 孔，无菌</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657 160</td><td>耗材</td></tr><tr><td>Zen Blue 软件</td><td>Zeiss</td><td>版本 3.7</td><td>显微镜软件</td></tr></tbody></table>

用于分析肠道黏膜免疫反应的免疫健全肠芯片模型

Immunocompetent Intestine-on-Chip Model for Analyzing Gut Mucosal Immune Responses

一种先进的肠芯片模型已被开发出来，可重建上皮细胞三维类器官样绒毛结构和隐窝样结构。该具有免疫活性的模型包含人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、Caco-2 肠道上皮细胞、组织驻留型巨噬细胞以及树突状细胞，这些细胞可在组织内自发形成有序结构，模拟人类肠道黏膜的特征。该平台的一个独特之处在于能够整合循环的人原代免疫细胞，从而增强其生理相关性。该模型旨在研究肠道免疫系统对细菌和真菌定植及感染的响应。由于其腔室尺寸增大，该模型可实现多种功能性检测，包括通透性测定、细胞因子释放和免疫细胞浸润，并兼容对上皮细胞层形成的三维结构进行免疫荧光检测。因此，该模型可全面揭示细胞分化与功能特征。该肠芯片平台已展现出在微生理灌注式生物芯片系统中解析活体微生物群替代物与人类宿主组织之间复杂相互作用的潜力。

这些代表性结果展示了器官芯片模型中肠组织的不同层次结构。组织经免疫荧光染色处理，具体步骤见方案第11部分。图像采用落射荧光显微镜或共聚焦荧光显微镜进行z轴层扫采集，并处理为正交投影图。显微镜设备及软件的详细信息请参见材料表。图5显示了血管层，即由HUVECs和巨噬细胞构成的具有屏障功能的内皮单层。代表性细胞标志物包括内皮细胞的VE-钙黏蛋白（VE-Cadherin）和血管性血友病因子（von Willebrand factor），以及巨噬细胞的CD68，均已进行染色标记。图6和图7展示了由C2BBe1细胞构成的三维上皮层。通过E-钙黏蛋白（E-Cadherin）和ZO-1染色证实了组织完整性。所有预期组织标志物及组织极性的详细分析可参见Maurer等人的研究6。图8展示了一张缺乏肠绒毛样三维结构外凸生长的典型图像。与典型的三维细胞层（图6）相比，其染色细胞核数量显著减少，细胞仅以单层形式存在。该特定表型是通过在细胞培养基中添加组蛋白去乙酰化酶抑制剂以抑制细胞增殖而形成的。屏障通透性通过FITC-葡聚糖渗透实验进行评估。如图9A所示，在机会性致病菌C. albicans感染后，通透性增加。感染导致细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10在血管腔培养基上清液中的释放量增加（图9B）8。
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66603/66603fig05.jpg" /> 
图5：器官芯片中肠组织血管侧固定后的图像。 灌注五天后血管屏障的代表性免疫荧光图像。组织经甲醇固定，使用落射荧光显微镜采集1 µm切片的z轴层扫图像，并展示该z轴层扫图像的正交最大投影图。(A) 细胞核内的DNA用DAPI染色。(B) 完全分化的单核细胞来源的巨噬细胞表达CD68，并广泛分布于血管组织中。(C) 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）形成连续的单层结构，通过形成如VE-钙黏蛋白等黏附连接结构显示组织完整性。此外，(D) HUVECs高表达血管性血友病因子。最后，(E) 所有标志物的信号在叠加图像中显示。比例尺 = 100 µm。缩写：DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；HUVECs = human umbilical venous endothelial cells。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66603/66603fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66603/66603fig06.jpg" /> 
图6：器官芯片中固定后的肠上皮侧。 在灌注培养5天后，极化上皮细胞层的代表性免疫荧光图像，显示连接蛋白E-Cadherin和ZO-1的表达。组织使用甲醇固定，通过落射荧光显微镜获取1 µm切片的z轴层扫图像，并展示其正交最大投影图。(A) 细胞核中的DNA用DAPI染色。紧密的上皮屏障由以下结构形成：(B) 用E-Cadherin标记的黏附连接，以及(C) 用ZO-1标记的顶端紧密连接。如(D) 叠加图像所示，紧密连接与黏附连接在细胞顶端膜处共定位。比例尺 = 100 µm。缩写：DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66603/66603fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66603/66603fig07.jpg" /> 
图7：肠芯片上固定后的上皮侧，呈现绒毛样外凸结构。 灌注六天后三维上皮细胞层的代表性免疫荧光图像。组织使用Carnoy固定液进行固定。使用共聚焦激光扫描显微镜获取1 µm切片的z轴层扫图像，并显示（A）该z轴层扫图像的正交最大投影。细胞核中的DNA用Hoechst染色。此外，组织还用麦芽凝集素（wheat germ agglutinin, WGA）染色，该凝集素可标记人黏蛋白。（B）在z轴层扫图像的x轴和y轴切片中可观察到上皮细胞形成的绒毛样和隐窝样结构的三维生长形态。比例尺 = 50 µm。缩写：WGA = wheat germ agglutinin。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66603/66603fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66603/66603fig08.jpg" /> 
图8：芯片肠道上皮侧固定后无绒毛样突起。 经组蛋白去乙酰化酶抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸（SAHA）处理的上皮细胞层的代表性免疫荧光图像，该处理可抑制细胞增殖。组织经甲醇固定。使用落射荧光显微镜获取1 µm切片的z轴层扫图像，并展示该z轴层扫图像的正交最大投影图。(A) 细胞核中的DNA用DAPI染色。(B) 中，黏附连接用E-钙黏蛋白染色；(C) 中，紧密连接用ZO-1染色。如叠加图像(D) 所示，紧密连接与黏附连接共定位。比例尺 = 100 µm。缩写：DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66603/66603fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66603/66603fig09.jpg" /> 
图9：整合的先天免疫细胞对病原体依赖性免疫反应： 本图修改自 Kaden 等人8。对未感染（-）或感染（+）C. albicans SC5314 的肠芯片模型分析了（A）FITC-葡聚糖（3-5 kDa）的通透性以及（B）细胞因子的分泌情况。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66603/66603fig09large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>溶液/培养基</td>
			<td colspan="2">成分</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胶原蛋白储备液&#160;</td>
			<td colspan="2">0.5 mg/mL IV型胶原溶于0.5 mM乙酸</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso缓冲液&#160;</td>
			<td colspan="2">PBS&#160;-/-, 1&#160;mg/mL 牛血清白蛋白V组分, 2&#160;mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>单核细胞分化培养基</td>
			<td colspan="2">造血细胞培养基 &#160;+ 10% 人自体血清 + 10&#160;ng/mL 重组巨噬细胞集落刺激因子 (M-CSF) + 10&#160;ng/mL 重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胰蛋白酶消化试剂&#160;</td>
			<td colspan="2">0.25% 胰蛋白酶 + 1&#160;mM EDTA 溶于 PBS&#160;-/-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>单核细胞脱落试剂</td>
			<td colspan="2">4&#160;mg/mL 利多卡因 + 5&#160;mM EDTA &#160;溶于 PBS -/-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>内皮细胞条件培养基</td>
			<td colspan="2">内皮细胞培养基 +10% 人自体血清 +10&#160;ng/mL M-CSF + 10&#160;ng/mL GM-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2培养基&#160;</td>
			<td colspan="2">DMEM高糖（4.5&#160;g/L）+ 10% FBS + 1% GlutaMax + 1% MEM非必需氨基酸溶液 + 1&#160;mM 丙酮酸钠 + 10&#160;µg/mL 人全转铁蛋白</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖储备液&#160;</td>
			<td colspan="2">1&#160;mg/mL 溶于预热的无酚红C2培养基</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>封闭与通透溶液</td>
			<td colspan="2">3% 正常驴血清（NDS）+ 0.1% 皂苷溶于 PBS&#160;+/+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>染色溶液</td>
			<td colspan="2">0.3% 正常驴血清（NDS）+ 0.1% 皂苷溶于 PBS +/+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>洗涤溶液</td>
			<td colspan="2">0.1% 皂苷溶于 PBS&#160;+/+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>卡诺伊固定液</td>
			<td colspan="2">60% 乙醇，30% 氯仿，10% 冰乙酸</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：本实验方案中所用溶液的列表及成分。 缩写：PBS -/- = 不含镁和钙的杜氏磷酸盐缓冲液。

我们的详细方案概述了先进的肠芯片模型的构建与使用方法，该模型可模拟具有三维结构和多种细胞类型的肠黏膜，从而能够深入分析微生物定植引发的免疫反应和细胞功能。

一种可重建上皮三维类器官绒毛样和隐窝样结构的先进肠芯片模型已被开发出来。该免疫兼容型……

我们的研究聚焦于免疫健全的器官芯片平台的开发与应用。通过构建这些具有生理相关性的人源化体外模型，我们能够研究复杂的宿主-病原体相互作用。我们所获得的知识可用于调控并鉴定感染性疾病治疗中的分子靶点。一个关键挑战是在体外维持宿主组织与处于稳态条件下的活性微生物群共存。这包括重建隐窝和绒毛结构的器官型三维拓扑结构及其微生物定植。肠芯片平台通过利用流体流动塑造器官型结构并防止细菌过度生长，从而应对这一挑战。这可确保稳定的培养条件。与其他现有的类肠芯片平台相比，由于本模型包含了原代组织驻留免疫细胞，因此能够对人类免疫系统对病原体的反应进行详细研究。此外，该模型的尺寸允许在单次实验中获得多种检测结果，从而降低了总体实验成本和实验次数。我们的实验室致力于利用诱导性多能干细胞开发自体系统，以实现个体化医疗。首先，用含镁和钙的DPBS将胶原蛋白储备液稀释至1:100。向相应的培养腔中加入350微升稀释后的储备液，并在室温下孵育5分钟。使用 350 微升含镁和钙的 DPBS 将所有腔室冲洗两次，以洗去残留的胶原蛋白和乙酸。从一个位点取下塞子并将其切换到另一侧。再次冲洗腔室后，向其中加入 350 微升内皮细胞生长培养基。将插头从一个位点取下并切换到另一侧。然后，向每个腔室中加入 350 µL 内皮细胞生长培养基。取传代 1-3 代、在内皮细胞生长培养基中培养且细胞融合度达到 80% 至 90% 的 HUVEC。然后，从T25细胞培养瓶中移除细胞培养基，用3至5毫升不含镁和钙的DPBS轻柔洗涤细胞。去除溶液后，加入1毫升胰蛋白酶消化试剂，在37摄氏度孵育5分钟，直至细胞从培养瓶壁脱落。将脱落的细胞用9毫升含5%FBS的不含镁和钙的PBS缓冲液转移至离心管中，在室温下以350 ×g离心5分钟。转移上清液后，将细胞沉淀重悬于1毫升内皮细胞生长培养基中。将相应体积的细胞加入腔室，并将生物芯片置于37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育。24小时后，用350微升内皮细胞生长培养基更换含HUVEC的腔室中的培养基。如果微流控生物芯片中出现气泡，请关闭除受影响腔室端口外的所有端口。倾斜芯片，使气泡移向腔体一端。从另一端的端口注入700 µL细胞培养基，同时按住对侧的塞子。首先，使用消毒剂彻底清洁培养箱和蠕动泵的所有区域，以确保准无菌环境。然后，用含镁和钙的 PBS 各冲洗每根管路 700 微升，接着用 500 微升 C2 或 EC 条件培养基冲洗。将鲁尔锁接头到蠕动泵塞之间距离较短的管路用于左侧腔室，另一侧对称的管路用于右侧腔室。从培养箱中取出含有 HUVEC 和 C2BBe1 细胞的生物芯片后，对每个腔室进行培养基更换，体积为 350 微升。然后，将塞子从下部位置移至上部位置。向生物芯片的下腔室中加入 350 微升新鲜培养基。随后，移除所有堵头，并将所有端口注满至最顶端。从左侧腔室开始，将鲁尔锁接头插入生物芯片的端口，将第一根导管连接到上层腔室的右侧端口。然后，将第二根导管连接到下层腔室的左侧端口。接下来，取一个储液槽，并在储液槽底部加入一小滴细胞培养基。然后，将该储液槽插入第一根导管的对侧，并对另一个腔室重复此操作。当所有端口均连接至导管或储液槽后，向各储液槽中加入 3.5 毫升细胞培养基。然后，将管路的松动端（其上连接有盖子）放置在储液池顶部，以封闭每个腔室的微流控系统。将生物芯片转移至蠕动泵。使用蠕动泵的夹具，将每根管路连接到蠕动泵上，使培养基从储液池流入腔室，并通过泵回流。然后，以每分钟50微升的流速对每个腔室进行灌注。预灌注完成后，停止蠕动泵。取下与每个储液器管路相连的盖子，并将其放置在泵旁边的无菌纱布上。移除所有培养基后，向储液池中加入两毫升新配制的培养基。重新连接盖子中的管路，以每分钟50微升的流速继续循环灌注24小时。停止蠕动泵后，打开所有腔室的储液池，排空储液池，并将管路和储液池从生物芯片上拆下。用 500 微升含镁和钙的冷 PBS 缓冲液清洗微流控腔室，每个腔室清洗两次。向所有腔室中加入 500 微升冰甲醇。打开芯片后，剪切或移除生物芯片的封接膜。将含有PET膜的组织切成两半，以便使用不同的免疫抗体组合平行染色。用精密镊子将每块膜转移至含有封闭和通透溶液的24孔板的不同孔中。然后，将膜片转移至湿盒内的洁净玻片上。向每块膜上加入 50 µL 用染色液配制的一抗。将样品转移至 24 孔板后，用洗涤液洗涤膜两次，每次五分钟，随后用含镁和钙的 PBS 洗涤。使用荧光封片剂和盖玻片将膜片固定在洁净的载玻片上，并于 4 °C 保存，直至进行显微成像。 灌注五天后，经DAPI染色的细胞核DNA显示，单核细胞来源的巨噬细胞已完全分化，表达CD68，并广泛分布于血管组织中。人脐静脉内皮细胞（HUVECs）形成融合单层，通过形成如VE-钙黏蛋白等黏附连接结构，显示出组织完整性。此外，人脐静脉内皮细胞高表达血管性血友病因子（von Willebrand factor）。灌注五天后，C2BBe1 细胞形成了表达连接蛋白 E-Cadherin 和 ZO-1 的极化上皮细胞层。灌注六天后，可在 z-stack 的 x 和 y 截面中观察到上皮细胞形成类似绒毛和隐窝结构的三维生长。

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Research

科研

JoVE Journal

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