Name: 具有间质血流的侵袭性胶质瘤微环境的光聚合透明质酸-胶原蛋白模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 30 s
Description: 了解光聚合透明质酸-胶原蛋白三维模型如何模拟侵袭性胶质瘤微环境中的间质血流。该方法结合MRI成像与计算分析，为研究胶质母细胞瘤细胞侵袭机制提供可控体外实验平台。

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我们感谢以下机构对本工作的资助：美国国立卫生研究院国家癌症研究所（R37 CA222563，授予 J.M.），库尔特基金会（J.M.），以及弗吉尼亚理工学院 ICTAS-CEH（J.M. &amp;#38; J.H.）。本实验所用的胶质瘤干细胞（GSCs）由哈佛医学院 Jakub Godlewski 博士提供。

本方案的制定符合弗吉尼亚理工学院机构生物安全委员会所制定的指南。
注意：除非另有说明，所有操作均须在BSL-2级细胞培养柜中进行。有关人源细胞的使用，请咨询所在机构的生物安全委员会以获取指导。
1. 凝胶制备的计算
<ol>
	<li>计算实验所需的条件数量。 
	注意：“条件”由溶液的成分（例如细胞浓度、胶原蛋白浓度等）定义，而非外部施加的变量（如本示例中使用的流体压力头）。</li>
	<li>计算每种条件溶液所需的凝胶总体积。 
	注意：使用12 mm直径组织培养插件的12孔板凝胶，每个插件所需体积为100–150 µL。在定量侵袭时，建议至少设置三个技术重复。此外，为弥补移液误差导致的体积损失，每种条件溶液应额外增加一个重复所需的体积。</li>
	<li>根据步骤1.2计算实验所需凝胶溶液的总体积。</li>
	<li>计算实验所需3 mg/mL胶原蛋白溶液的总体积。为弥补移液过程中的体积损失，应在该体积基础上至少增加10%。 
	3 mg/mL胶原蛋白总体积 = 0.4 × 凝胶溶液总体积</li>
	<li>根据给定的终浓度（cf），计算高浓度大鼠尾部胶原蛋白I、无菌1 N NaOH、无菌10x PBS和无菌水在3 mg/mL胶原蛋白溶液中各组分的体积：胶原蛋白I终浓度cf = 3 mg/mL，NaOH终浓度cf = 胶原蛋白I体积的2.3%（v/v），PBS终浓度cf = 1x。使用无菌超纯水（18.2 MΩ·cm）稀释溶液。</li>
	<li>根据给定的终浓度（cf），计算每种条件溶液中3 mg/mL胶原蛋白溶液、1% w/v甲基丙烯酰化透明质酸、光引发剂17 mg/mL苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次磷酸锂（LAP）以及细胞培养基的体积：胶原蛋白终浓度cf = 1.2 mg/mL，透明质酸终浓度cf = 0.4% w/v，LAP终浓度cf = 透明质酸体积的2%（v/v）。使用含有细胞的细胞培养基稀释溶液。</li>
	<li>根据所需比例（例如，每100 µL水凝胶中含100,000个GSCs，GSCs:星形胶质细胞:小胶质细胞比例为4:1:1），计算每种条件溶液所需的细胞数量。</li>
</ol>
2. 准备材料
<ol>
	<li>实验前一周，接种GSCs、星形胶质细胞和小胶质细胞。 
	注意：接种时应使细胞数量约为凝胶所需数量的两倍，以补偿传代及操作过程中细胞的损失。</li>
	<li>将光引发剂LAP用无菌1×PBS配制成17 mg/mL的工作液。避光保存。</li>
	<li>根据生产商说明书，将甲基丙烯酰化透明质酸溶于1×PBS中。密封瓶盖，在4 °C下轻轻摇动悬浮液1小时，或直至完全溶解。 
	注意：本方案中使用的甲基丙烯酰化透明质酸在4 °C下可稳定保存约1个月。需避光保存。</li>
	<li>使用波长为385 nm、光强为50 mW/cm2的平行光LED紫外灯建立光照系统，并将灯置于细胞培养柜内。 
	警告：紫外光可能损伤眼睛。操作时应佩戴护目镜，切勿直视光源。 
	注意：应单独开展实验，确认在50 mW/cm2光照强度下暴露45秒不会对细胞活力或所测功能结果产生显著影响。</li>
	<li>准备实验用培养基（Astrobasal培养基 + 0.5% v/v N-2 + 1% v/v B-27不含维生素A）。 
	注意：混合培养基组分后，通过0.22 µm孔径的真空过滤系统过滤，以确保无菌。避免对生长因子（N-2和B-27）进行反复冻融，以防降解。</li>
	<li>在通风橱内并启用防溅罩的条件下，配制1 N NaOH溶液。 
	警告：1 N NaOH具有强腐蚀性。操作时应小心，佩戴眼部防护装备或使用防溅罩，并将溶液始终置于通风橱内。</li>
	<li>准备无菌超纯水（18.2 MΩ·cm）。</li>
</ol>
3. 细胞传代与标记 GSCs
<ol>
	<li>根据制造商说明书传代星形胶质细胞、小胶质细胞和胶质瘤干细胞。</li>
	<li>按照制造商推荐方法，用 Hoechst 33342 对胶质瘤干细胞进行标记。 
	注意：Hoechst 33342 可引起严重眼刺激，并可能诱导 DNA 损伤。操作时需谨慎。</li>
	<li>将所有细胞在室温下以 200 x g 离心 5 分钟。</li>
	<li>轻柔倾去上清液，并用移液器移除多余培养基。</li>
	<li>用 1x PBS 重悬胶质瘤干细胞。</li>
	<li>以 200 x g 离心 5 分钟，收集胶质瘤干细胞。</li>
	<li>将所有细胞重悬于实验所需培养基（astrobasal 培养基 + 0.5% N-2 v/v + 1% v/v B-27）中。</li>
	<li>对所有细胞进行计数。</li>
	<li>将每种实验条件所需的确切细胞数量分别加入对应的一个试剂瓶中，置于 37 °C、5% CO2 环境中待用。</li>
</ol>
4. 制备水凝胶
注意：打开甲基丙烯酰化透明质酸和光引发剂后，需在避光条件下进行后续操作，直至水凝胶完成光交联。
<ol>
	<li>将 8–11 mg/mL（高浓度）胶原蛋白、1 N NaOH、无菌超纯水（18.2 MΩ·cm）、无菌 10x PBS、一个微量离心管（用于配制 3 mg/mL 胶原蛋白溶液）、甲基丙烯酰化透明质酸和光引发剂置于冰上。 
	注意：所有与胶原蛋白溶液接触的材料都必须保持在冰上，以防止提前交联。</li>
	<li>将组织培养小室放入培养板中，并对培养板进行标记。</li>
	<li>根据计算值，通过混合高浓度胶原蛋白、1 N NaOH、超纯水（18.2 MΩ·cm）和 10x PBS 来配制 3 mg/mL 胶原蛋白溶液。逐滴加入各组分，并在混合时保持移液枪头浸没在液体中，以防止气泡产生。 
	注意：如果产生气泡，通常可通过离心或轻敲管壁去除气泡。此外，含酚红的培养基在 pH 过酸时会呈现黄色；此时应添加更多 NaOH。</li>
	<li>在室温下以 200 × g 离心细胞 5 分钟。</li>
	<li>轻轻移除每种细胞条件溶液表面多余的培养基，保留所需体积的培养基。将这些溶液置于冰上。 
	注意：不要将细胞转移出该离心管，以避免细胞损失。相反，应将所有凝胶条件组分直接加入此管中，然后轻轻混匀，并将凝胶分配至培养板中。</li>
	<li>向步骤 4.5 中的每种细胞条件溶液中加入计算体积的 3 mg/mL 胶原蛋白溶液，使其终浓度为 1.2 mg/mL。</li>
	<li>向步骤 4.5 中的每种细胞条件溶液中加入计算体积的 1% w/v 甲基丙烯酰化透明质酸溶液，使其终浓度为 0.4% w/v。</li>
	<li>向步骤 4.5 中的每种细胞条件溶液中加入计算体积的 17 mg/mL LAP 溶液。 
	注意：应在将凝胶分配至培养板前立即加入该溶液，以最大限度维持细胞活性；液态 LAP 具有细胞毒性。</li>
	<li>依次混匀每种条件的离心管，并向每个组织培养小室中加入 100–150 µL 混合液。保持移液枪头浸没在液体中，以避免产生气泡。</li>
	<li>打开 385 nm 紫外灯（设定为 50 mW/cm2），并保持恒定电流。</li>
	<li>依次对每个凝胶进行光交联，每个孔暴露于紫外光下 45 秒。</li>
	<li>将培养板置于 37 °C 环境中 30–45 分钟，以完成胶原蛋白的交联。</li>
	<li>使用 astrobasal + 0.5% N-2 v/v + 1% v/v B-27 培养基施加流体静压于凝胶上：
	<ol>
		<li>净零流（静态）：在培养板孔中加入 700 µL 培养基，在组织培养小室内加入 100 µL 培养基。</li>
		<li>净流动：在培养板孔中加入 100 µL 培养基，在组织培养小室内加入 700 µL 培养基。 
		注意：利用毛细作用将 100 µL 培养基加至组织培养小室下方；该体积不会充满整个培养板孔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将培养板置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育至少 18 小时，最长可达 5 天。 
	注意：根据实验需求，系统可孵育长达 5 天，但初始侵袭、细胞活性或增殖实验通常 18–24 小时的时间点已足够。</li>
</ol>
5. 用于侵袭分析的细胞固定
注意：切勿让组织培养小室的膜干燥，且不要将溶液直接加到膜上，以免细胞从膜上脱落。
<ol>
	<li>吸出组织培养小室和孔板中的培养基。</li>
	<li>使用 P1000 枪头抽吸组织培养小室中的凝胶。 
	注意：如需保留凝胶用于成像，可在本步骤中将凝胶留在孔内，并按照步骤 5.4 注释中的替代固定方案操作。</li>
	<li>用 1× PBS 轻柔清洗孔板中的每个孔，确保覆盖每个组织培养小室的膜表面。</li>
	<li>向孔板中加入含 4%（v/v）甲醛的 PBS 溶液，确保覆盖每个组织培养小室的膜，并在室温下孵育 15–20 分钟。 
	警告：甲醛为疑似致癌物，可导致严重眼损伤。使用时应在通风橱内操作，并配备防溅护具。 
	注意：此孵育时间仅能固定组织培养小室膜上的细胞。若需保留凝胶用于成像，则应在 4 °C 下以足够渗透凝胶的甲醛量固定 1 小时，并轻轻振荡。固定后，用 PBS 彻底清洗凝胶至少 20 分钟。</li>
	<li>用 1× PBS 清洗每个孔。随后，在每个孔板孔和组织培养小室内加入额外的 1× PBS。</li>
	<li>使用棉签擦拭每个组织培养小室膜的上表面，以去除凝胶碎片。擦拭后，将可能丢失的 1× PBS 重新加回各孔中，避免膜干燥。</li>
	<li>用 1× PBS 清洗每个孔及组织培养小室。 
	注意：如有需要，可将板密封后置于 4 °C 保存，但应尽快成像，以避免荧光信号损失。</li>
</ol>
6. 成像与定量分析
<ol>
	<li>在 DAPI 通道下，对每一张膜进行成像。如果可能，对整个孔进行拼接荧光成像。如果无法实现，则在 20 倍镜下，对孔的中心区域以及四个呈十字交叉分布的区域进行成像。 
	注意：应排除孔的边缘区域，以避免凝胶碎片干扰，并且各兴趣区域（ROIs）之间不得重叠。</li>
	<li>统计每张图像中的细胞数量。</li>
	<li>计算每个孔中接种的 GSCs 细胞的侵袭百分比： 
	<img alt="静态平衡：细胞密度计算。方程；用于研究的膜表面分析。" src="/files/ftp_upload/66604/66604eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 1"></li>
	<li>计算技术重复样本中侵袭百分比的平均值和标准差。</li>
</ol>
7. 替代终点：流式细胞术
注意：除了或替代侵袭分析外，未固定的凝胶可被降解，并收集细胞用于流式细胞术或其他终点分析。本文提供了一个分析细胞活力（可固定活/死染料）、增殖（Ki67 抗体）和干性（CD71 抗体）的示例方案。在验证染色效果后，可根据需要在本方案中替换其他感兴趣的标记物。特别是，已有大量靶向 GSC 的标记物可供选择（详见文献25）。本方案从步骤 4.14 之后开始。
<ol>
	<li>降解水凝胶。 
	注意：首先用实验培养基（astrobasal + 0.5% v/v N-2 + 1% v/v B-27 不含维生素A）配制2倍浓度的胶原酶和分散酶溶液，然后将其加入等体积的水凝胶中，以达到1倍的终浓度。由于不同细胞对酶解降解的反应不同，强烈建议检测细胞活力和回收率（图2）。胶原酶的终浓度范围应为0.2–0.4 mg/mL，分散酶的终浓度范围应为0.01–0.04 mg/mL；本示例中使用0.3 mg/mL胶原酶和0.02 mg/mL分散酶来降解水凝胶。
	<ol>
		<li>配制2倍浓度的胶原酶和分散酶溶液（水凝胶降解培养基溶液）。用实验培养基（astrobasal + 0.5% v/v N-2 + 1% v/v B-27 不含维生素A）将胶原酶原液稀释至0.6 mg/mL，分散酶原液稀释至0.04 mg/mL。</li>
		<li>将凝胶从组织培养插件中取出，并转移至V型底96孔板中。</li>
		<li>向每孔加入与水凝胶体积相等的水凝胶降解培养基溶液。例如，向100 µL水凝胶中加入100 µL水凝胶降解培养基溶液。</li>
		<li>将板置于摇床上，在37 °C、300–500 RPM（轨道直径：2 mm）条件下孵育15–30分钟。 
		注意：若细胞对酶解降解敏感，建议尝试最短孵育时间（15分钟）。</li>
		<li>用移液器将每个水凝胶上下吹打30–50次，以充分破碎水凝胶。 
		注意：水凝胶完全降解后易于吹打。若凝胶难以吹散，需将板在37 °C、300–500 RPM（轨道直径：2 mm）条件下继续在摇床上孵育15分钟，随后再次将每个水凝胶上下吹打30–50次。重要的是，水凝胶降解的总孵育时间不应超过1小时，否则可能导致细胞活力降低。</li>
		<li>在4 °C条件下以625 × g离心1分钟，并弃去上清液。 
		注意：可通过移液或快速将板倒置于废液盘上方的方式去除上清液。</li>
		<li>用50 µL 1× PBS重悬细胞，并将三个技术重复样本合并至同一孔中，形成一个生物学重复样本。</li>
		<li>在4 °C条件下以625 × g离心1分钟，弃去上清液，随后进行流式细胞术分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>封闭非特异性结合位点。
	<ol>
		<li>每孔加入200 µL 1× PBS洗涤细胞，在4 °C条件下以625 × g离心1分钟，并弃去上清液。除非另有说明，以下所有步骤均需在冰上操作。</li>
		<li>用200 µL封闭液（含10% v/v FBS的1× PBS）重悬细胞，在室温下孵育15分钟。</li>
		<li>每孔加入200 µL 1× PBS洗涤细胞，在4 °C条件下以625 × g离心1分钟，并弃去上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用活/死细胞染料对细胞进行标记。
	<ol>
		<li>使用可固定的近红外活/死细胞染料检测细胞活力。将活/死细胞染料用1× PBS按1:1000稀释。</li>
		<li>用200 µL 70%乙醇重悬一个孔中的细胞，作为阴性对照。</li>
		<li>用200 µL 1× PBS重悬其余孔中的细胞。</li>
		<li>将板在冰上孵育5–10分钟，在4 °C条件下以625 × g离心1分钟，并弃去上清液。</li>
		<li>向相应孔中加入50 µL活/死染色溶液，在冰上孵育15分钟。</li>
		<li>在4 °C条件下以625 × g离心1分钟，并弃去上清液。</li>
		<li>每孔加入200 µL流式缓冲液（含2% w/v BSA的HBSS），洗涤细胞两次。</li>
		<li>在4 °C条件下以625 × g离心1分钟，并弃去上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对目标细胞表面标志物（CD71抗体）进行免疫染色。
	<ol>
		<li>用流式缓冲液（含2% w/v BSA的HBSS）将CD71抗体按1:50稀释。</li>
		<li>向相应孔中加入50 µL抗体溶液，在冰上孵育15分钟。</li>
		<li>在4 °C条件下以625 × g离心1分钟，并弃去上清液。</li>
		<li>每孔加入200 µL流式缓冲液（含2% w/v BSA的HBSS），洗涤细胞一次。</li>
		<li>在4 °C条件下以625 × g离心1分钟，并弃去上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对目标细胞内标志物（Ki67抗体）进行免疫染色。
	<ol>
		<li>使用Foxp3转录因子染色缓冲液套装对细胞进行固定和通透处理。每孔加入100 µL Foxp3固定/通透工作液，通过上下吹打重悬细胞沉淀。</li>
		<li>在冰上或室温下避光孵育30–60分钟。</li>
		<li>在4 °C条件下以625 × g离心1分钟，并弃去上清液。</li>
		<li>每孔加入200 µL 1×通透缓冲液，洗涤细胞两次。</li>
		<li>在4 °C条件下以625 × g离心1分钟，并弃去上清液。</li>
		<li>加入100 µL封闭液（含2% v/v FBS的1× PBS），在室温下孵育15分钟。</li>
		<li>在4 °C条件下以625 × g离心1分钟，并弃去上清液。</li>
		<li>用封闭液（含2% v/v FBS的1× PBS）将Ki67抗体按1:25稀释。</li>
		<li>向相应孔中加入50 µL 1:25稀释的Ki67抗体溶液，在室温下避光孵育30分钟。</li>
		<li>在4 °C条件下以625 × g离心1分钟，并弃去上清液。</li>
		<li>每孔加入200 µL 1×通透缓冲液，洗涤细胞两次。</li>
		<li>用200 µL流式缓冲液重悬细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用流式细胞仪处理样本。示例性设门策略详见Cornelison等（2022）12。</li>
</ol>

Replicating Glioblastoma Invasion with Hyaluronan-Collagen I Hydrogel System

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作者没有相关利益冲突需要披露。

构建TME模型包括六个基本步骤：1）传代细胞并将细胞按相同条件分组，2）为所有条件配制浓缩的胶原蛋白溶液，3）将每种条件下的凝胶组分（细胞、胶原蛋白、甲基丙烯酰化透明质酸和光引发剂）混合，4）铺板形成凝胶，5）通过紫外照射和加热进行交联，6）施加流体静压。18小时或更长时间后，可收集凝胶用于流式细胞术、RNA提取、蛋白质提取、成像或其他下游应用，同时可固定组织培养插入膜以定量分析侵袭情况。因此，除了在实验当天前完成细胞准备外，整个流程（包括模型接种和下游应用）通常不超过2至4天即可完成。
肿瘤微环境（TME）模型可被调整以模拟不同的微环境和癌症类型。具体而言，可以改变细胞类型及其比例，或通过调整基质成分以实现不同的流速或刚度。延长凝胶在紫外光下光交联的时间，或延长胶原蛋白在37 °C条件下的交联时间，均可增加基质刚度。所使用的培养基应根据模型中新增的细胞类型进行相应调整。此外，可将细胞添加至凝胶表面的流动培养基中，以更准确地模拟免疫细胞模型中的细胞浸润过程。然而，在确立任何新参数之前，应评估细胞活力以及干细胞特性维持情况或反应性胶质增生程度等相关因素。反应性胶质增生可通过GFAP和CD68的表达水平进行评估（如文献12所述），而干细胞特性则可通过多种胶质瘤干细胞（GSC）标志物来检测25；但需注意的是，越来越多的证据表明，反应性胶质增生和干细胞特性均为短暂状态，由多种标志物的主导表达所体现，因此应选择在实验上具有相关性的标志物26,27。在我们所描述的TME模型中，分离的胶质细胞中CD68和GFAP的表达水平相对较低，但在不同GSC细胞系存在的情况下，其表达常升高或降低，且胶质细胞中CD68和GFAP的表达水平与GSCs中CD71+干细胞特性的表达呈负相关12。
目前已存在多种模型，可模拟脑微环境的某些方面，通常归属于以下一个或多个类别：自体分泌基质的微组织模型（即在液体或固体基质中的类球体和类器官）、预制基质（支架）以及微流控装置；这些模型最近已被Tate和Munson（2019）综述28。本文所述模型相较于其他类别的主要优势在于：1）可模拟脑肿瘤基质，而该基质在二维培养或液体细胞悬液中通常缺失；2）无需依赖管路、泵或其他通常与微流控模型相关的电子设备，具有自主运行能力；3）可使用无需内部制备的材料构建，不同于某些需要定制生产的支架和微流控装置29；4）采用基于脑组织、非专有的透明质酸基质，其成分明确，而非如Matrigel等基质提取物30，从而最大限度减少混杂因素。透明质酸在胶质母细胞瘤（GBMs）中含量丰富31，并通过CD44调控流体剪切力增强的胶质瘤侵袭9。更广泛而言，细胞外基质（ECM）组成、生物物理力以及三维环境的特性（例如缺氧状态和治疗药物渗透性降低）对细胞增殖、代谢、干性维持与分化、药物反应性及侵袭能力具有显著影响，相关研究已有大量综述32,33,34,35,36。
该模型的局限性包括尚无法复制复杂的组织结构，例如血管系统或神经元的排列模式。此外，由于水凝胶会导致光散射，成像通常需要使用昂贵的成像设备（例如共聚焦显微镜）。另外，文献报道中用于交联的紫外光强度及照射时间差异较大37,38,39,40，可根据需要进行调整，以优化细胞存活率和功能。特别是，高强度紫外光已被证明会因活性氧（ROS）的产生而降低敏感细胞类型的细胞活力38。如果初始的细胞活力实验结果不理想，可采用相应方案以减轻ROS对细胞活力的影响38。然而，任何调整都会改变凝胶的物理性质，并可能影响流速。
肿瘤微环境（TME）模型最直接适用于模拟胶质母细胞瘤侵袭性肿瘤微环境中的液体流动。然而，只要细胞保持活性并能够持续反映相应疾病的生理特征，该模型便可被调整以表征不同的微环境，无论是否存在流体流动或所涉及的癌症类型如何。特别是近期研究强调，神经元是驱动胶质母细胞瘤侵袭的重要因素41,42因此，在TME模型中纳入神经元可能有助于研究其对GSC侵袭的影响，但这需要进一步优化模型，超出了本方案的范围。或者，不含GSC但包含胶质细胞及其他相关细胞类型（如神经元）的模型版本，可用于模拟脑部非肿瘤性疾病的病理结果。28重要的是，在开展后续研究之前，可利用该模型轻松测试可溶性候选治疗药物。 体内 工作。

胶质母细胞瘤是一种破坏性极强的疾病，患者生存期极短1，临床上可用的治疗方法仅能适度延长生存时间2,3。有效治疗的主要障碍在于耐药性胶质瘤干细胞（GSCs）具有高度侵袭性，这些细胞无法通过手术切除清除，并可导致肿瘤复发4。同时，GSCs 具有高度可塑性，能够响应肿瘤微环境（TME）中的多种刺激，从而实现存活与侵袭5,6。具体而言，肿瘤区域细胞密集且血管通透性高，导致肿瘤边界处形成显著的压力梯度，从而在特定区域增强组织间液流（IFF），并与 GSC 的侵袭行为相关联7。这种增强的 IFF 通过可被药物靶向干预的分子通路，影响8,9,10并常常促进8,9 GSC 的侵袭。然而，TME 中胶质细胞对胶质瘤侵袭的影响使这一过程更加复杂；事实上，已有研究报道胶质细胞在多种背景下可调节胶质瘤的侵袭行为11，我们实验室的初步证据也表明胶质细胞对 IFF 增强的胶质瘤侵袭具有类似作用12。因此，我们实验室开发了一种可调节的三维 TME 模型，通过整合 IFF 和胶质细胞-GSC 相互作用，模拟这些侵袭性肿瘤边界区域，用于量化 GSC 侵袭及其他相关指标（如细胞表面或细胞内蛋白表达、RNA 表达等），从而评估 IFF、胶质细胞和/或候选治疗药物对上述过程的影响12（图 1）。
该TME模型与其他已广泛发表的基于组织培养小室的间质液流动实验（即静态/流动实验）相似8,9,10,13,14,15,16,17,18。本模型的主要特点在于采用了非专有的、可调节的胶原-透明质酸基质，将星形胶质细胞和小胶质细胞以能够代表患者TME中比例的方式引入基质12，并且整个系统完全封闭于培养板内，无需外部管路、储液槽或泵。透明质酸是脑细胞外基质的主要成分之一19，但其本身不足以支持液体流动；因此，混合物中加入了I型胶原。交联过程分为两个步骤：第一步是自由基引发的链式生长聚合反应，即在紫外光（UV）照射下，光引发剂产生自由基，从而在甲基丙烯酰化透明质酸分子之间形成化学交联20；第二步是通过中和酸保存的胶原并加热以形成胶原纤维21,22,23。
本实验所优化的各种参数已在先前发表的巯基化透明质酸-胶原蛋白水凝胶研究中有所描述8,12。具体而言，用于本实验的细胞（原代人胶质瘤干细胞24、原代人皮层星形胶质细胞以及永生化人小胶质细胞）在由astrobasal培养基添加胶质瘤干细胞生长因子、0.5% v/v N-2和1% v/v B-27（不含维生素A）组成的凝胶中，至少可维持60%的细胞活力达3天12。在需要降解凝胶的情况下（例如用于蛋白质提取或流式细胞术），可使用胶原酶和中性蛋白酶处理，并仍能保持足够的细胞活力（图2）。
为了量化侵袭性，必须在将GSCs与基质中的胶质细胞混合之前对其进行荧光标记。可通过Hoechst 33342染色（如下所述）、细胞示踪剂12、基因修饰或转导实现标记。无论采用何种方法，在将标记后的细胞引入TME模型之前，均应检测其细胞活力。或者，如果无需量化侵袭性，而仅需收集凝胶用于蛋白质提取、RNA提取或其他检测，则在凝胶制备过程中通常无需对细胞进行荧光标记。在此情况下，可选择将凝胶用甲醛固定以用于成像，或通过降解凝胶并裂解细胞以提取RNA，或使用蛋白酶降解凝胶，随后通过流式细胞术分析细胞，并用蛋白裂解缓冲液裂解细胞以进行Western blot或其他蛋白质相关实验。
本文介绍一种将人源星形胶质细胞、小胶质细胞和患者来源的胶质瘤干细胞（GSCs）以患者特异性比例 4:1:112 接种于含 1.2 mg/mL I 型胶原蛋白和 4 mg/mL 透明质酸的基质中，并在静态或流动条件下培养的实验方案。若细胞活力足够，可根据不同研究需求调整实验参数（如细胞比例、基质刚度、细胞类型等）以模拟不同生理或病理环境。
<img alt="脑细胞培养装置；静态与流动条件示意图；星形胶质细胞、小胶质细胞、胶质瘤干细胞。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66604/66604fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：在流体静压头作用下，由胶质瘤干细胞（GSCs）、星形胶质细胞和小胶质细胞组成的肿瘤微环境（TME）模型示意图。 细胞被包埋于组织培养插件内的胶原-透明质酸水凝胶中。重力驱动净向下的液体流动。组织培养插件膜上的孔允许向下侵袭的细胞附着于插件底部表面，这些细胞可被固定、成像并进行定量分析。图示使用 BioRender.com 制作。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66604/66604fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞存活率柱状图；随时间（30、45、60 分钟）的活细胞百分比；实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66604/66604fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：水凝胶降解后的细胞活力。 将 G34s（GSCs）、星形胶质细胞和小胶质细胞以 4:1:1 的比例接种于 TME 模型中，并在 37 °C 下孵育 21 小时。使用 0.3 mg/mL 胶原酶 + 0.02 mg/mL 链霉蛋白酶消化去除凝胶，总消化时间分别为 30、45 或 60 分钟，在每 15 分钟轻柔吹打混匀（30 分钟组），或在 30 分钟后开始每 15 分钟吹打一次（45 分钟和 60 分钟组）。凝胶完全降解后，使用吖啶橙（所有细胞）和碘化丙啶（死细胞）对细胞进行染色，并通过自动细胞计数仪进行计数。报告的是 TME 模型中所有细胞的存活率。细胞在 30–60 分钟内维持至少 70% 的存活率。数据以均值 ± 标准误表示；n = 3 个生物学重复。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66604/66604fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

<table><tbody><tr><td>12孔无菌细胞培养板</td><td>Celltreat 科学产品&amp;nbsp;</td><td>229112</td><td></td></tr><tr><td>250 mL 滤器&amp;nbsp; 系统，PES滤膜材料，0.22 &amp;micro;米，50 毫米，无菌</td><td>DOT Scientific</td><td>667706</td><td></td></tr><tr><td>385 nm，1650 mW（最小值）带壳LED，1700 mA&amp;nbsp;</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>M385LP1-C1</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 组织培养瓶 - 透气盖，无菌</td><td>Celltreat 科学产品</td><td>229341</td><td></td></tr><tr><td>8.0 &amp;mu;m 细胞培养板插件 12 mm 直径</td><td>Millipore小室</td><td>PI8P01250</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇，200 proof，分子生物学级</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>T038181000CS</td><td>流式细胞术死细胞对照用乙醇</td></tr><tr><td>星形胶质细胞培养基（Astrofull）</td><td>ScienCell 研究实验室</td><td>1801</td><td>含astrobasal、FBS及青霉素/链霉素&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>B-27 添加剂（50 倍浓度），不含维生素 A（Gibco）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>BSA（MACS）</td><td>Miltenyi Biotec&amp;nbsp;</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>CD71 抗体（eBioscience，Invitrogen）</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>25-0719-41</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数板载玻片</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CHT4-PD100-002</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Biologix USA&amp;nbsp;</td><td>70-1250</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer K2 荧光细胞计数仪（Nexelcom Bioscience）</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>NEXCCMK2-SK150-FCS</td><td></td></tr><tr><td>离心机 - 低速</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>5702 R</td><td>细胞培养用离心机</td></tr><tr><td>透明聚苯乙烯96孔微孔板，Corning</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-108</td><td>用于流式细胞术染色的V型底板</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;150L 培养箱，Heracell 150i（Thermo Scientific）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>50116047</td><td></td></tr><tr><td>I型胶原蛋白，高浓度，大鼠尾部</td><td>康宁</td><td>354249</td><td></td></tr><tr><td>I型胶原，大鼠尾部</td><td>康宁</td><td>354236</td><td>&quot;低&quot; 包被贴壁培养瓶的浓度。</td></tr><tr><td>胶原酶（CAS# 9001-12-1）</td><td>美国生物制品公司</td><td>C7511-30</td><td></td></tr><tr><td>奥林巴斯BX准直适配器 &amp;和 IX，抗反射涂层：350 - 700 nm</td><td>Thorlabs</td><td>COP1-A</td><td></td></tr><tr><td>棉签，Q-tips 精细尖头棉签&amp;nbsp;</td><td>亚马逊</td><td>B01KCJB3R2</td><td></td></tr><tr><td>Dispase（CAS# 9001-92-7）&amp;nbsp;</td><td>美国生物公司</td><td>D3760</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，高糖（Gibco）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL</td><td>Invitrogen</td><td>AMF4300</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（Gibco）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>26140079</td><td>用于小胶质细胞培养。</td></tr><tr><td>福尔马林溶液，中性缓冲，10%（Sigma-Aldrich）&amp;nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Foxp3 / 转录因子染色缓冲液套装（eBioscience，Invitrogen）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>00-5523-00</td><td></td></tr><tr><td>胶质瘤干细胞</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>可以是患者来源的或商业化的胶质瘤干细胞系。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Guava easyCyte HT 系统</td><td>默克生命科学</td><td>0500-4008</td><td>流式细胞仪</td></tr><tr><td>HBSS（Sigma-Aldrich）&amp;nbsp;</td><td>默克密理博</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>HEPES（1 M）（Gibco）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>高功率单通道LED驱动器，带脉冲调制，最大10.0 A，最大50.0 V&amp;nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>DC2200</td><td>紫外灯接口</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 溶液（20 mM）（Thermo Scientific）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>人星形胶质细胞</td><td>ScienCell 研究实验室</td><td>1800</td><td>源自大脑皮层的原代星形胶质细胞。</td></tr><tr><td>人EGF重组蛋白（Gibco）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>人碱性成纤维细胞生长因子（FGF-2/bFGF）（氨基酸10-155）重组蛋白（Gibco）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>PHG0021</td><td></td></tr><tr><td>永生化人小胶质细胞 - hTERT</td><td>应用生物材料&amp;nbsp;</td><td>T0251</td><td></td></tr><tr><td>Incu-mixer MP 加热型微孔板振荡器，2 位</td><td>Benchmark Scientific&amp;nbsp;</td><td>H6002</td><td></td></tr><tr><td>Ki67 REAfinity，PerCP-Vio 700 抗体</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-120-420</td><td></td></tr><tr><td>LED紫外固化计</td><td>Gigahertz-Optik</td><td>X1-RCH-116</td><td>用于测量紫外光强度的光度计</td></tr><tr><td>Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)&amp;nbsp;</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5269-100MG&amp;nbsp;</td><td>光引发剂</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 可固定近红外染料（Invitrogen）&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>L24975</td><td></td></tr><tr><td>甲基丙烯酰化透明质酸（photoHA）</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5212-100MG</td><td></td></tr><tr><td>微型离心机，Sorvall ST8R（Thermo Scientific）</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-997-203</td><td>用于流式细胞术染色的离心机</td></tr><tr><td>N-2 补充剂（100 倍浓缩）（Gibco）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A 培养基（Gibco）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10888022</td><td></td></tr><tr><td>PBS（10倍浓缩液），pH 7.4，不含Ca &amp;& Mg</td><td>高质量生物学</td><td>119-069-101</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠，ACS级颗粒（CAS# 1310-73-2）</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>97064-476</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%），酚红（Gibco）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>ViaStain AOPI染色液</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CS2-0106</td><td></td></tr></tbody></table>

一种具有间质流的光聚合透明质酸-胶原侵袭性胶质瘤微环境模型

A Photopolymerizable Hyaluronic Acid-Collagen Model of the Invasive Glioma Microenvironment with Interstitial Flow

胶质母细胞瘤的复发是治疗成功的主要障碍，其原因是胶质瘤干细胞（GSCs）侵入健康组织，这些区域无法通过手术切除，并且对现有的化疗药物具有抗性。组织层面的液体运动，即间质液流（IFF），以依赖肿瘤微环境（TME）的方式调控GSC的侵袭行为，这凸显了需要建立能够同时模拟IFF和TME的模型系统。本文介绍一种可及的方法，用于复制胶质母细胞瘤中具有侵袭性的TME：在组织培养小室中构建一种包含人源GSCs、星形胶质细胞和小胶质细胞的透明质酸-Ⅰ型胶原水凝胶。通过向水凝胶施加流体静压，可模拟升高的IFF。此外，该模型可调节以模拟不同患者之间或同一患者内部的细胞比例、流速或基质硬度的差异。该系统可用于定量分析细胞侵袭行为，同时可回收凝胶进行多种后续检测，包括GSC侵袭分析、流式细胞术、蛋白质或RNA提取以及成像。

侵袭的代表性数据（图3）、细胞活力以及通过流式细胞术检测Ki67和CD71的表达图4) 为GSC细胞系提供，如先前发表的硫代修饰透明质酸-胶原蛋白水凝胶所述12肿瘤微环境模型中星形胶质细胞和小胶质细胞的存在对胶质瘤干细胞侵袭的影响因细胞系而异图4）。具体而言，GSC细胞系G44和G6224 在TME模型中接种，分别含有或不含星形胶质细胞和小胶质细胞，并暴露于流体压力梯度（流动）或净零流动（静态）条件下。
在静态条件下，TME 模型中星形胶质细胞和小胶质细胞的有无与 G44 侵袭能力的降低相关（图 3；p &lt; 0.05）。相比之下，无论是流体作用，还是星形胶质细胞和小胶质细胞的存在，均未对 G62 的侵袭产生显著影响。肿瘤微环境和流体作用对侵袭行为的这种差异性影响，在其他细胞系中已有报道12，因此对于新引入模型系统的细胞系也应进行相应研究。
为了分析肿瘤微环境（TME）模型中胶质瘤干细胞（GSCs）的存活率、Ki67+ 增殖能力以及 CD71+ 干性特征，将 GSC 细胞系 G3424 与荧光染料标记的星形胶质细胞和小胶质细胞共同接种，并施加静态或流动条件。随后，降解水凝胶以分离细胞并进行流式细胞术分析。细胞经可固定型活/死细胞染料染色后，固定并用 Ki67 或 CD71 抗体进行标记12。图 4A 展示了在区分活细胞、CD71+、Ki67+ G34 细胞与星形胶质细胞及小胶质细胞时所采用的通用设门策略。当 G34 单独存在于水凝胶中时，流动条件下的 G34 增殖（Ki67）显著高于静态条件（p &lt; 0.001）；在静态条件下，与无胶质细胞共培养相比，存在胶质细胞时 G34 增殖也显著升高（p &lt; 0.05）（图 4B）。尽管统计学上无显著差异，当 G34 单独存在于水凝胶中时，流动条件下 CD71 表达呈上升趋势；但在存在胶质细胞的情况下，该趋势未被观察到（图 4C）。该方法可用于定量分析 TME 模型中各类细胞的其他感兴趣标志物。
值得注意的是，由于多种因素可能引入变异，从而影响胶质瘤的侵袭性（如凝胶刚度、反应性胶质增生、因筛选和传代导致的表型变化等），通常建议报告效应量，并且在检测新的细胞系之前，必须生成技术重复并针对生物学重复进行功效分析。一般而言，3-6个生物学重复是可接受的。为了最大限度地减少变异并提高统计功效，所有条件应尽可能在同一次实验中完成，包括不同胶质瘤干细胞系之间的比较。
<img alt="比较静态和流动条件下侵袭率的柱状图，突出显示显著差异。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66604/66604fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：肿瘤微环境对两种GSC细胞系在流动刺激下侵袭行为的差异性影响。 将荧光标记的GSCs（G44和G62）单独接种于水凝胶中（-A/M），或与星形胶质细胞和小胶质细胞共同接种（+A/M）。对“流动”条件施加流体压力梯度；对“静态”条件则不施加净流体流动。侵袭后的GSCs在组织培养插件膜上固定，计数，并在技术重复之间取平均值。每个生物学重复的平均侵袭率被绘制出来。在静态条件下，A/M的存在显著降低了G44的侵袭能力（p &lt; 0.05）。相比之下，流动条件或A/M的存在对G62的侵袭均无显著影响。已侵袭的接种GSCs比例以均值±标准误表示；n = 3个生物学重复；*p &lt; 0.05，采用配对双因素方差分析，随后进行Tukey多重比较检验。数据经重新整理并获准转载自Cornelison等，202212。统计分析已修订，仅包含感兴趣的细胞系。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66604/66604fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术分析、胶质瘤分布、Ki67/CD71标志物、活细胞百分比柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66604/66604fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：在TME模型中测量GSCs的存活率、增殖（Ki67）和干性（CD71）。在TME模型中，将GSCs与或不与荧光染料标记的星形胶质细胞（绿色）和小胶质细胞（深红色）共同接种，并暴露于净零流体流动（静态）或净流动（流动）条件下。随后降解凝胶，并使用活/死近红外染料以及Ki67或CD71抗体染色，进行流式细胞术分析。同型对照以灰色显示。（A）对细胞类型设门，并通过活/死近红外染料定量活细胞比例。（B）当G34细胞单独存在于水凝胶中时，在流动条件下其Ki67增殖水平显著高于静态条件（p &lt; 0.001）；在静态条件下，当存在星形胶质细胞和小胶质细胞（A/M）时，Ki67增殖也显著升高（p &lt; 0.05）。（C）相比之下，尽管统计学上不显著，但在TME模型中加入星形胶质细胞和小胶质细胞可维持G34细胞的干性（以CD71表达为代表）在静态条件下保持稳定。数据表示为均值 ± 标准误（SEM）；n = 3个生物学重复。*p &lt; 0.05，***p &lt; 0.0001，经双因素方差分析（two-way ANOVA）后进行Tukey多重比较检验。本图经Cornelison等202212许可重新格式化并重印；附加数据展示了B和C图中的静态条件结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66604/66604fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们介绍一种用于模拟胶质瘤侵袭前沿肿瘤微环境并包含间质液流的方法。该模型采用透明质酸-胶原蛋白I水凝胶，并置于组织培养插入式装置中，可施加流体压力。该系统可用于定量分析细胞侵袭行为，并可对细胞进行分离或裂解。

胶质母细胞瘤复发是治疗成功的主要障碍，其发生机制主要由胶质瘤干细胞（GSCs）向健康组织的侵袭所驱动，这些细胞……

本研究探讨肿瘤微环境如何驱动胶质母细胞瘤（最致命的脑癌类型）中的肿瘤细胞侵袭。具体而言，我们关注由瘤内压力升高所驱动的间质液流动如何促使肿瘤细胞向周围脑实质侵袭。目前，我们采用三维透明质酸-胶原系统构建类肿瘤模型，结合磁共振成像（MRI）和计算分析方法，研究间质液流动所介导的胶质瘤侵袭过程。在体外实验方法中，通过在肿瘤微环境（TME）模型顶部施加压力产生流体流动，以模拟脑组织中的间质液流动。提供恰当的物理刺激以重现组织微环境始终是一项持续的挑战。我们的三维模型采用透明质酸和胶原蛋白——二者均为脑基质中天然存在的成分，并实现了持续的间质液流动。这些因素共同为正常细胞和癌细胞提供了关键的物理信号。我们近期的研究表明，脑内常驻细胞会影响胶质瘤细胞对间质流的响应方式，但这种响应依赖于患者的特异性因素。为了研究这些因素对胶质瘤侵袭的影响，我们开发了一种基于患者数据的胶质瘤侵袭前沿模型，该模型可模拟天然脑组织。这种患者肿瘤模型能够在体外实现高度可控的实验，同时仍能反映影响胶质瘤侵袭的组织层面因素。此外，与其他类似的胶质瘤侵袭和间质液流模型相比，该模型更具可及性，因为它无需使用管路或泵。并且使用市售材料。首先将胶原蛋白、氢氧化钠、无菌超纯水、10 倍浓度 PBS、一个微量离心管、甲基丙烯酰化透明质酸以及光引发剂置于冰上。然后将组织培养小室放入培养板中并做好标记。为制备3毫克/毫升的胶原蛋白溶液，将高浓度胶原蛋白、1摩尔/升氢氧化钠、超纯水和10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）混合。将各组分加入微量离心管中，混合时保持移液器吸头浸没在液体中，以防止气泡产生。随后，在室温下以200 ×g离心细胞5分钟。然后轻轻吸去每种细胞处理溶液表面多余的培养基，保留该处理条件所需的培养基体积。将这些溶液置于冰上。向每种细胞处理溶液中加入计算好的胶原蛋白溶液体积。接下来，向每种细胞条件溶液中加入计算体积的1%甲基丙烯酰化透明质酸，随后加入光引发剂LAP至终浓度为17毫克/毫升。逐个混匀各条件的离心管，混匀过程中保持移液枪头浸没在液面下，以避免产生气泡。然后，向每个组织培养插入物中加入100至150微升溶液。现在，以恒定电流开启385纳米紫外灯。为进行光交联，依次对每个凝胶的每孔施加紫外光照射45秒。随后将培养板置于37摄氏度环境中30至45分钟，以完成胶原蛋白的交联。使用含有0.5%（体积比）和两倍体积比以及1%（体积比）不含维生素A的B27的星形胶质细胞基础培养基，对凝胶施加流体静压。向培养板和组织培养插入物中加入培养基，以实现净零流速。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中，孵育至少18小时或长达5天。

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了解光聚合透明质酸-胶原蛋白三维模型如何模拟侵袭性胶质瘤微环境中的间质血流。该方法结合MRI成像与计算分析，为研究胶质母细胞瘤细胞侵袭机制提供可控体外实验平台。

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