以分枝杆菌生物膜的培养作为研究抗菌耐药性的模型

我们的研究聚焦于细菌代谢，特别是对生长和存活至关重要的能量代谢。尽管已有大量生化与结构数据，但在系统层面的理解及其适应性机制仍不明确。我们的目标是深入认识这些过程，并应对抗菌素耐药性问题。

本方案通过使用生物膜来增强实验室实验的生理相关性，相较于浮游培养方法，生物膜能更好地模拟细菌的自然生长状态。结核分枝杆菌生物膜的建立将为理解该属细菌的生活方式提供理想体系，同时也可作为抗微生物药物的筛选平台。我们并非首次构建分枝杆菌生物膜的研究者。

已有多个研究团队将此作为模型使用。我们制定本实验方案的目的是尽可能简化操作流程，以便更多实验室能够采用该系统作为模型。首先，在超净工作台内，使用血清移液管将两毫升高压灭菌的LB培养基分装至两支无菌的14毫升试管中。

用微量移液器向试管中加入 20 微升经滤膜除菌的 5% 吐温 80。接着，用接种环将耻垢分枝杆菌的冻存菌种加入试管中。将试管置于摇床培养箱中，在 300 转/分钟、37 摄氏度条件下培养 48 小时。

为制备次级培养物，将两毫升高压灭菌的LB培养基分装至两支无菌的14毫升试管中。然后使用微量移液器向试管中加入20微升经滤膜除菌的5%吐温80。接着，用微量移液器将20微升初级培养物转移至其中一支试管中。

将培养物置于摇床培养箱中，在300转/分钟、37摄氏度条件下培养，直至其OD600达到0.6至0.8。首先，在超净工作台内，向6孔板的各孔中加入6毫升添加了2%葡萄糖的Sauton培养基。然后，向各孔接种120微升耻垢分枝杆菌的二次培养物。

保留一个未接种的孔作为培养基对照。接下来，使用1毫升微量移液器将菌液上下吹打，以确保混合均匀。盖上盖子，并用石蜡膜小心地将培养板密封。

将培养板置于37摄氏度的静置培养箱中孵育七天。为直观评估生物膜生长情况，将培养板置于凝胶成像系统中，在透射白光照明下观察。为测定干重，称量一张滤纸的重量。

用刮勺将六孔板中的生物膜取出，并转移至滤纸上。小心收集培养物中的大部分生物膜，将其置于吸水纸上。

将滤纸放入培养箱中，直至生物膜完全干燥。然后测量滤纸和生物膜的总重量。从第三天开始可观察到生物膜菌膜。

在Sauton培养基中添加2%葡萄糖后，菌落的网状结构得到改善。生物膜的形成在第3至第6天之间可见。第3天观察到具有轻微网状结构的膜。

该薄膜在第五天成熟，并从第六天开始解体。