Name: 生长分枝杆菌生物膜作为研究抗菌素耐药性的模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T13:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 26 s
Description: 学习使用耻垢分枝杆菌建立浮膜生物膜模型以研究细菌代谢与抗菌素耐药性。该简化方案通过模拟自然生长状态，为筛选抗微生物药物提供可靠的实验系统。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由授予 Amitesh Anand 的 DBT-Ramalingaswami 研究员项目资助。

本研究中使用的所有试剂和设备的详细信息均列在材料表中。
1. 索森培养基的制备
<ol>
	<li>通过精确称取1.25 g磷酸二氢钾，溶于50 mL去离子水中，配制50 mL的2.5%磷酸二氢钾溶液。</li>
	<li>称取2.56 g硫酸镁，溶于50 mL去离子水中，配制50 mL的2.5%硫酸镁溶液。</li>
	<li>称取0.5 g柠檬酸铁铵，溶于10 mL去离子水中，配制10 mL的5%柠檬酸铁铵溶液。将其储存于棕色试管中。</li>
	<li>称取20 g葡萄糖，溶于100 mL去离子水中，配制100 mL的20%葡萄糖溶液。使用50 mL无菌注射器和0.2 µM PVDF针头滤器在试管中进行过滤除菌。</li>
	<li>精确称取0.1 g硫酸锌，溶于10 mL去离子水中，配制10 mL无菌的1%硫酸锌溶液。在超净台中使用10 mL无菌注射器和0.2 µM PVDF针头滤器进行过滤除菌。</li>
	<li>按照表1所述，将上述配制好的组分加入750 mL去离子水中。测定溶液pH值，并调节至7。再用去离子水定容至900 mL。</li>
	<li>将培养基在15 PSI、121 °C条件下高压灭菌15–20分钟。待其冷却后，加入100 µL过滤除菌的1%硫酸锌溶液，再加入100 mL过滤除菌的20%葡萄糖溶液，并充分溶解。</li>
</ol>
2. 过滤除菌的5%吐温-80溶液的制备
<ol>
	<li>将 0.5 mL 吐温-80 溶解于 9.5 mL 去离子水中。</li>
	<li>在超净工作台中，使用 10 mL 无菌注射器和 0.2 µM 聚偏二氟乙烯（PVDF）针头滤器对溶液进行过滤除菌。</li>
</ol>
3. 原代培养的制备
<ol>
	<li>在超净工作台中，使用刻度移液管将 2 mL 经高压灭菌的 LB 培养基加入两个无菌的 14&#160;mL 试管中。</li>
	<li>使用微量移液器向试管中加入 20 µL 经滤膜灭菌的 5% 吐温-80。</li>
	<li>用接种环取 M. smegmatis 冻存菌液，接种至其中一支试管中；另一支试管作为空白培养基对照。</li>
	<li>将试管置于摇床培养箱中，在 300 rpm、37 °C 条件下培养 48 小时。 
	注意：空白培养基对照管不应出现任何菌体生长。</li>
</ol>
4. 准备二次培养
<ol>
	<li>在超净工作台中，使用刻度移液管将 2 mL 经高压灭菌的 LB 培养基加入两个无菌的 14 mL 试管中。</li>
	<li>使用微量移液器向试管中加入 20 µL 经滤膜除菌的 5% Tween-80。</li>
	<li>使用微量移液器将 20 µL 初始培养物加入其中一支试管中，另一支试管作为空白培养基对照。</li>
	<li>将培养物置于摇床&#160;培养箱中，在 300 rpm、37 °C 条件下振荡培养，直至其 OD600 达到 0.6 至 0.8。 
	注意：通常需要 12 至 14 小时达到 OD600 0.6 至 0.8。也可使用其他细胞密度，但设定明确的 OD600 值有助于进行比较研究。</li>
</ol>
5. 建立生物膜
<ol>
	<li>在超净工作台中，使用血清移液管将6 mL添加了2%葡萄糖的Sauton培养基加入6孔板的每个孔中。</li>
	<li>使用微量移液器向各孔接种120 µL（即2%）的继代接种物。保留一个未接种的孔作为培养基对照。</li>
	<li>用1 mL微量移液器反复吹打，混匀培养基和菌液。盖上盖子，并用封口膜小心密封6孔板。</li>
	<li>将6孔板置于37 °C的静止培养箱中，静置培养7天。</li>
</ol>
6. 为特定阶段观察建立生物膜
注意：总体生物膜实验设置与步骤5中所述相同。若需在不同时间点收集或成像生物膜，建议在多个独立的培养板上分别设置相同的生物膜实验组。
<ol>
	<li>为观察第3天至第6天的生物膜，需准备四块条件相同的培养板，每天使用其中一块进行成像。 
	注意：自培养板制备的第三天起，空气-培养基界面处开始出现生物膜层。</li>
</ol>
7. 生物膜发育的评估
<ol>
	<li>目测法
	<ol>
		<li>使用凝胶成像系统在透射白光照明下对平板进行成像（图1）。 
		注：成像可对形成的生物膜进行粗略的定性与定量评估。也可使用任何高质量的相机作为替代。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>干重法
	<ol>
		<li>通过干重测定实现更精确的定量分析。</li>
		<li>测量干重时，首先称量一张吸水纸的重量。 
		注：也可使用滤纸代替吸水纸。</li>
		<li>用刮铲从6孔板中取出生物膜，并将其转移至纸上。</li>
		<li>小心收集培养物中的大部分生物膜，注意避免将过多培养基转移到纸上。</li>
		<li>将生物膜置于吸水纸上。</li>
		<li>将样品置于50 °C培养箱中0.5–1小时，直至生物膜完全干燥。</li>
		<li>测量纸张与生物膜的总重量。 
		注：生物膜干重 =（生物膜 + 纸张重量）－（纸张重量）</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 生物膜中抗生素耐受性检测
<ol>
	<li>根据 Irith Wiegand 等人描述的方案，使用 Sauton 培养基测定利福平对浮游培养的 M. smegmatis 的 MIC9011。当培养物的 OD600 达到 0.2 时加入抗生素。</li>
	<li>按照方案第 5 步所述设置用于生物膜生长的培养板。</li>
	<li>在培养的第四天，使用移液器在超净台中从孔的侧边向培养物中加入 MIC90 浓度（64 µg/mL）的利福平。 
	注意：操作时需小心，避免过度扰动生物膜。保留一个含有生物膜的孔不作处理作为对照。</li>
	<li>缓慢摇动培养板以混匀抗生素。</li>
	<li>用石蜡膜封住培养板边缘，并将其放回培养箱中继续培养。</li>
	<li>24 小时后，从超净台中取出培养板，并向所有含生物膜的孔中加入 Tween-80，使其终浓度为 0.2%。</li>
	<li>再次用石蜡膜封住培养板，置于 4 °C、100 rpm 条件下孵育 12 小时。</li>
	<li>在超净台中取出培养板，使用 1 mL 移液器充分混匀各组分。</li>
	<li>按照 Anand 等人所述方案，使用 Sauton 培养基洗涤各组分12。</li>
	<li>最后，将细胞重悬于 6 mL Sauton 培养基中，并稀释至终浓度分别为 10-4、10-5、10-6 和 10-7。</li>
	<li>使用经高压灭菌的玻璃珠，将每种稀释液各 100 µL 涂布于 LB-琼脂平板上。</li>
	<li>用石蜡膜密封所有平板，并置于 37 °C 培养箱中培养。</li>
	<li>培养 3 天后，计数每个平板上的菌落。仅统计菌落数在 30 至 300 之间的平板。</li>
	<li>使用提供的公式计算每毫升菌落形成单位（CFU/mL）以及 CFU/mL 的相对减少率13。 
	注意：CFU/mL =（菌落数 × 稀释倍数）/（涂布体积（mL）） 
	CFU/mL 相对减少率 =（（未处理组 CFU/mL - 处理组 CFU/mL）/（未处理组 CFU/mL））× 100</li>
</ol>

Developing and Assessing Pellicle Biofilms in Mycobacteria

<ol><li>Davey, M. E., O'toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilms%3A+From+ecology+to+molecular+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilms: From ecology to molecular genetics.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64 (4), 847-867 (2000).</li>
<li>Rumbaugh, K. P., Sauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+dispersion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm dispersion.</a> Nat Rev Microbiol. 18 (10), 571-586 (2020).</li>
<li>Davies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+biofilm+resistance+to+antibacterial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Understanding biofilm resistance to antibacterial agents.</a> Nat Rev Drug Discov. 2 (2), 114-122 (2003).</li>
<li>Hernández-Jiménez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+vs.+planktonic+bacterial+mode+of+growth%3A+Which+do+human+macrophages+prefer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Biofilm vs. planktonic bacterial mode of growth: Which do human macrophages prefer.</a> Biochem Biophys Res Commun. 441 (4), 947-952 (2013).</li>
<li>Nadell, C. D., Drescher, K., Foster, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+structure%2C+cooperation+and+competition+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial structure, cooperation and competition in biofilms.</a> Nat Rev Microbiol. 14 (9), 589-600 (2016).</li>
<li>Jo, J., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradients+and+consequences+of+heterogeneity+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Gradients and consequences of heterogeneity in biofilms.</a> Nat Rev Microbiol. 20 (10), 593-607 (2022).</li>
<li>Keating, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+modifies+cell+wall+carbohydrates+during+biofilm+growth+with+a+concomitant+reduction+in+complement+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Surf%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis modifies cell wall carbohydrates during biofilm growth with a concomitant reduction in complement activation.</a> Cell Surf. 7, 100065(2021).</li>
<li>Ojha, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Mycobacterium+tuberculosis+biofilms+containing+free+mycolic+acids+and+harbouring+drug-tolerant+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria.</a> Mol Microbiol. 69 (1), 164-174 (2008).</li>
<li>Dietrich, L. E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+community+morphogenesis+is+intimately+linked+to+the+intracellular+redox+state%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Bacterial community morphogenesis is intimately linked to the intracellular redox state.</a> J Bacteriol. 195 (7), 1371-1380 (2013).</li>
<li>Kulka, K., Hatfull, G., Ojha, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Mycobacterium+tuberculosis+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms.</a> J Vis Exp. (60), e3820(2012).</li>
<li>Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agar+and+broth+dilution+methods+to+determine+the+minimal+inhibitory+concentration+%28MIC%29+of+antimicrobial+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances.</a> Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).</li>
<li>Anand, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyketide+quinones+are+alternate+intermediate+electron+carriers+during+mycobacterial+respiration+in+oxygen-deficient+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Polyketide quinones are alternate intermediate electron carriers during mycobacterial respiration in oxygen-deficient niches.</a> Mol Cell. 60 (4), 637-650 (2015).</li>
<li>Growth Curves: Generating Growth Curves Using Colony Forming Units and Optical Density Measurements. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/v/10511/growth-curves-cfu-and-optical-density-measurements">https://www.jove.com/v/10511/growth-curves-cfu-and-optical-density-measurements</a> (2019).</li>
<li>Høiby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+personal+history+of+research+on+microbial+biofilms+and+biofilm+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Pathog+Dis%22%5BJournal%5D)">A personal history of research on microbial biofilms and biofilm infections.</a> Pathog Dis. 70 (3), 205-211 (2014).</li>
<li>Rajewska, M., Maciąg, T., Jafra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+source+and+surface+type+influence+the+early-stage+biofilm+formation+by+rhizosphere+bacterium+Pseudomonas+donghuensis+P482%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Carbon source and surface type influence the early-stage biofilm formation by rhizosphere bacterium Pseudomonas donghuensis P482.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+dish+biofilm+formation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+exp%22%5BJournal%5D)">Microtiter dish biofilm formation assay.</a> J Vis exp. (47), e2437(2011).</li>
<li>Chakraborty, P., Bajeli, S., Kaushal, D., Radotra, B. D., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+in+the+lung+contributes+to+virulence+and+drug+tolerance+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation in the lung contributes to virulence and drug tolerance of Mycobacterium tuberculosis.</a> Nat Comm. 12 (1), 1606(2021).</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

微生物的多细胞生活方式几乎在一个世纪前就已被描述；然而，相关的临床研究仍然较少，主要原因是缺乏可靠的方法14。有关生物膜生物学的研究中所描述的方法往往难以适应实际应用。本文提供的详细方法结合关键步骤的演示，有望提高实验方案的可重复性。
本文所述的生物膜制备方法具有可扩展性，需要按比例增加培养基体积和接种量。对于代谢物提取等应用，需要较大的培养体积，而抗菌药物敏感性试验则需要较少的生物量12。此外，可通过调整接种量大小来调控生物膜形成的速率。这种灵活性使研究人员能够适当地控制实验持续时间。
生长条件和微环境在生物膜生理学中起着至关重要的作用15。值得注意的是，葡萄糖的存在并非形成生物膜的必要条件；然而，添加2%葡萄糖已被观察到可增强生物膜的网状结构及其稳定性。另一个有趣的发现是，在培养孔底部放置玻璃盖玻片具有促进生物膜形成的作用。在初代和继代培养中加入Tween-80对于减轻细胞聚集至关重要。
生物膜的发育包含不同的生长阶段，如附着、成熟和扩散。尽管此处描述的生物膜培养通常孵育7天，但菌膜在第3天起即可肉眼观察到。rd 从第1天开始。该设置可用于研究生物膜发育的时间动态。本文虽以干重估测法来评估生物膜生物量，但该实验体系同样适用于传统的结晶紫染色法或基于显微镜的定量分析。12,16.
分枝杆菌形成生物膜的能力在其致病性中起着重要作用，并赋予其更强的药物抗性8,17。我们观察到，与摇瓶培养相比，生物膜培养物的抗生素耐受性高出七到八倍。多个研究团队已将生物膜作为研究细菌生理学的模型系统；若分枝杆菌研究领域更广泛地采用这种生长模式，将有助于深入理解该属内多种致病菌的病理生理机制。

细菌可以单细胞形式存活；然而，在大多数具有生理相关性的条件下，它们会组织形成群落模拟结构。生物膜是一种广为人知的细菌群落组织形式，由聚集的细胞及其自身产生的胞外基质包裹而成1。这种结构具有早期多细胞性的特征，并赋予细菌系统更强的抗逆能力。生物膜通常对微生物抑制剂具有耐受性，据估计，约80%的微生物感染与生物膜相关2,3。
传统上，摇瓶培养和平板培养一直是细菌培养的常用方法。这些方法之所以被广泛接受并取得巨大成功，主要归因于其操作简便、可重复性强以及易于放大。然而，由于缺乏生理学背景，利用这些系统所获得的知识在转化应用方面受到一定限制4。因此，生物膜正逐渐成为研究细菌病理生理学的有吸引力的模型系统。生物膜提供了一种动态的模型系统，能够高度模拟自然环境，使研究人员得以重现诸如营养梯度和空间异质性等生理特征5,6。
生物膜生活方式在分枝杆菌研究中尤为重要，因为包括臭名昭著的Mycobacterium tuberculosis在内的分枝杆菌均具有很强的生物膜形成能力7。它们在生物膜内旺盛生长的能力有助于在感染期间持续存在于宿主组织中，这给分枝杆菌病的治疗带来了巨大挑战，因为生物膜生活方式本身具有固有的抗生素耐药性8。此外，生物膜也为研究分枝杆菌的代谢提供了理想的模型系统，使其能够在复杂的微生物群落中探究分枝杆菌所采用的独特代谢适应机制和营养利用策略9。
尽管生物膜正逐渐被接受为研究分枝杆菌的更佳模型系统10，但仍需要建立一致且可重复的标准操作程序，特别是在不同实验室开展的研究之间进行比较时尤为必要。本文所述方法描述了一种分枝杆菌物种——M. smegmatis的生物膜形成操作流程。M. smegmatis由于无致病性且生物膜形成动力学较快，是研究分枝杆菌生物膜的更易操作的模型。该方法可根据需要进行调整，适用于抗分枝杆菌药物筛选、代谢物提取以及组学研究等应用。

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;micro;M PVDF 注射器滤器</td><td>Axiva</td><td>SFNY04 R</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 吸头</td><td>Genetix</td><td>GXM-611000 C</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L 吸头</td><td>Genetix</td><td>GXM-6110 C</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L 吸头</td><td>Genetix</td><td>GXM-61200C</td><td></td></tr><tr><td>6 孔聚丙烯板</td><td>Tarsons</td><td>980010</td><td></td></tr><tr><td>棕色管</td><td>Tarsons</td><td>546051</td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌器</td><td>Hospharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜 A II 级</td><td>MSET</td><td></td><td></td></tr><tr><td>吸水纸</td><td>任何合适的供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Sigma</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>比色皿</td><td>Bio-Rad</td><td>2239955</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸铁铵</td><td>Sigma</td><td>F5879</td><td></td></tr><tr><td>凝胶成像系统</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃珠</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>49139</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>接种环</td><td>Genaxy</td><td>HS81121C</td><td></td></tr><tr><td>L-天冬酰胺</td><td>Sigma</td><td>A0884</td><td></td></tr><tr><td>LB-琼脂</td><td>Himedia</td><td>M1151</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基</td><td>Himedia</td><td>M575</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;M. smegmatis&lt;/em&gt; mc2155 冻存菌种</td><td>ATCC</td><td>700084</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>封口膜</td><td>Tarsons</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Tarsons</td><td>460020</td><td></td></tr><tr><td>pH 计</td><td>Labman Scientific Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯试管</td><td>Genaxy</td><td>GEN-14100-PS</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>利福平</td><td>MedchemExpress</td><td>HY-B0272</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管</td><td>SPL Life Sciences</td><td>95210</td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>药匙</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>恒温培养箱</td><td>CARON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌 10 mL 注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>309642</td><td></td></tr><tr><td>无菌 50 mL 注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>吐温-80</td><td>Sigma</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>电子天平</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫酸锌</td><td>Sigma</td><td>Z0251</td><td></td></tr></tbody></table>

以分枝杆菌生物膜的培养作为研究抗菌耐药性的模型

Growing Mycobacterial Biofilm as a Model to Study Antimicrobial Resistance

许多细菌在复杂的自然群落中繁衍生息，表现出多细胞生物的关键特征，如细胞间通讯、协作与竞争。细菌多细胞行为最常见的表现形式是生物膜的形成，这一过程常与致病性相关。生物膜为细菌提供了抵御抗菌剂的庇护所，从而促进了耐药性的产生。传统的摇瓶液体培养方法无法真实反映细菌在自然环境中的生理生长状态，因而限制了我们对其复杂生命活动的理解。值得注意的是，生物膜中细菌的代谢和转录谱与自然生长状态下的细胞高度相似。这种相似性凸显了生物膜作为基础研究和转化研究理想模型的重要意义。本文以Mycobacterium smegmatis为模式生物，重点介绍一种用于培养浮膜型生物膜的技术。该方法可适用于不同体积的培养体系，便于针对多种实验目标（如抗菌研究）进行灵活应用。此外，通过微小调整，该方法还可用于定性或定量评估不同分枝杆菌物种的生物膜形成能力。

从第三天开始，生物膜菌膜可肉眼可见。尽管在不含2%葡萄糖的Sauton培养基上生物膜仍能生长，但添加葡萄糖后其网状结构明显改善。在24孔板中，每孔加入1.5 mL添加2%葡萄糖的Sauton培养基，培养四天后，我们获得每孔生物膜干重为10.48 mg ± 3.13 mg（n = 4）。在图2中，可观察到生物膜从第3天至第6天的发育过程：第3天开始形成具有轻微网状结构的薄膜，到第5天完全成熟；从第6天起，生物膜开始解体。利福平的MIC90（64 µg/mL）仅使生物膜的菌落形成单位（CFU）减少了25% ± 12%（n = 3）。
<img alt="多孔板上的细胞培养分析，显微镜图像显示细胞生长模式。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66607/66607fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：M. smegmatis 在 Sauton 培养基中培养 4 天后的生物膜形成情况。 （1）不含葡萄糖，接种量为 2%；（2）不含葡萄糖，接种量为 4%；（3）含 2% 葡萄糖，接种量为 2%；（4）含 2% 葡萄糖，接种量为 4%；（5）和（6）为培养基对照。本实验使用标准的 6 孔板。照片未进行任何放大拍摄。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66607/66607fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="细胞培养4天的生长情况，显微镜图像，实验时间序列，生物学分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66607/66607fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2: M. smegmatis 3型生物膜形态rd 接种后第6天th 天。 此处，样品置于标准的24孔板中。照片拍摄时未进行任何放大。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66607/66607fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>序号</td>
			<td colspan="3">组分</td>
			<td colspan="2">工作浓度 (w/v)</td>
			<td colspan="2">储备液浓度</td>
			<td colspan="2">储备液体积/重量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td colspan="3">磷酸二氢钾</td>
			<td colspan="2">0.05%</td>
			<td colspan="2">2.50%</td>
			<td colspan="2">20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td colspan="3">硫酸镁</td>
			<td colspan="2">0.05%</td>
			<td colspan="2">2.50%</td>
			<td colspan="2">20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td colspan="3">柠檬酸铁铵</td>
			<td colspan="2">0.01%</td>
			<td colspan="2">5%</td>
			<td colspan="2">1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td colspan="3">甘油</td>
			<td colspan="2">6%</td>
			<td colspan="2">100%</td>
			<td colspan="2">60 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td colspan="3">L-天冬酰胺</td>
			<td colspan="2">0.40%</td>
			<td colspan="2">NA</td>
			<td colspan="2">4 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td colspan="3">柠檬酸</td>
			<td colspan="2">0.20%</td>
			<td colspan="2">NA</td>
			<td colspan="2">2 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：Sauton培养基制备所需组分。

本方案描述了一种用于形成浮膜型生物被膜的可靠方法。该方法可适用于不同的培养体积，便于针对多种实验目的进行应用。本方法的设计可实现对多种分枝杆菌物种形成生物被膜能力的定性或定量评估。

许多细菌在复杂的自然群落中繁衍生息，表现出多细胞生物的关键特征，例如细胞间通讯、协作与竞争。

我们的研究聚焦于细菌代谢，特别是对生长和存活至关重要的能量代谢。尽管已有大量生化与结构数据，但在系统层面的理解及其适应性机制仍不明确。我们的目标是深入认识这些过程，并应对抗菌素耐药性问题。本方案通过使用生物膜来增强实验室实验的生理相关性，相较于浮游培养方法，生物膜能更好地模拟细菌的自然生长状态。结核分枝杆菌生物膜的建立将为理解该属细菌的生活方式提供理想体系，同时也可作为抗微生物药物的筛选平台。我们并非首次构建分枝杆菌生物膜的研究者。已有多个研究团队将此作为模型使用。我们制定本实验方案的目的是尽可能简化操作流程，以便更多实验室能够采用该系统作为模型。首先，在超净工作台内，使用血清移液管将两毫升高压灭菌的LB培养基分装至两支无菌的14毫升试管中。用微量移液器向试管中加入 20 微升经滤膜除菌的 5% 吐温 80。接着，用接种环将耻垢分枝杆菌的冻存菌种加入试管中。将试管置于摇床培养箱中，在 300 转/分钟、37 摄氏度条件下培养 48 小时。为制备次级培养物，将两毫升高压灭菌的LB培养基分装至两支无菌的14毫升试管中。然后使用微量移液器向试管中加入20微升经滤膜除菌的5%吐温80。接着，用微量移液器将20微升初级培养物转移至其中一支试管中。将培养物置于摇床培养箱中，在300转/分钟、37摄氏度条件下培养，直至其OD600达到0.6至0.8。首先，在超净工作台内，向6孔板的各孔中加入6毫升添加了2%葡萄糖的Sauton培养基。然后，向各孔接种120微升耻垢分枝杆菌的二次培养物。保留一个未接种的孔作为培养基对照。接下来，使用1毫升微量移液器将菌液上下吹打，以确保混合均匀。盖上盖子，并用石蜡膜小心地将培养板密封。将培养板置于37摄氏度的静置培养箱中孵育七天。为直观评估生物膜生长情况，将培养板置于凝胶成像系统中，在透射白光照明下观察。为测定干重，称量一张滤纸的重量。用刮勺将六孔板中的生物膜取出，并转移至滤纸上。小心收集培养物中的大部分生物膜，将其置于吸水纸上。将滤纸放入培养箱中，直至生物膜完全干燥。然后测量滤纸和生物膜的总重量。从第三天开始可观察到生物膜菌膜。在Sauton培养基中添加2%葡萄糖后，菌落的网状结构得到改善。生物膜的形成在第3至第6天之间可见。第3天观察到具有轻微网状结构的膜。 该薄膜在第五天成熟，并从第六天开始解体。

growing-mycobacterial-biofilm-as-model-to-study-antimicrobial

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

生长分枝杆菌生物膜作为研究抗菌素耐药性的模型

本文介绍了在培养的人气道上皮细胞上培养Pseudomonas...

铜绿假单胞菌 生物膜与活体人呼吸道细胞共培养模型

Mycobacterium tuberculosis 在特定培养条件下会形成耐药性生物膜。本文介绍了培养 M. tuberculosis 生物膜并测定耐药持留菌频率的方法。这些实验方案将有助于进一步研究 M. tuberculosis...

结核分枝杆菌 生物膜的培养

该方案可实现对能够形成生物膜的细菌菌株的浮游状态与生物膜状态耐药性的直接比较 体外...

建立抗菌剂对浮游细胞（MBC-P）和生物膜细胞（MBC-B）的最小杀菌浓度

本方案描述了利用载玻片培养室模型，在暴露于宿主因子后对生物膜形成过程进行可视化观察的方法。该模型可实现对生物膜发育过程的直接观察，并可利用计算机软件对生物膜参数进行分析。...

利用腔室盖玻片模型可视化痰液对生物膜形成的影响

抗菌剂诱导的变化 铜绿假单胞菌 不同临床分离株在囊性纤维化及慢性肺部感染患者培养物中的生物膜结构存在差异。经共聚焦显微镜观察后，可利用 COMSTAT...

量化抗菌剂的影响 体外 使用 COMSTAT 软件分析生物膜结构

该实验流程可用于对囊性纤维化患者肺部细菌生物膜的既定 体外模型进行抗生素敏感性检测。使用该模型可提高MBEC（最小生物膜清除浓度）检测的临床有效性。...

囊性纤维化肺部中Pseudomonas aeruginosa和Staphylococcus aureus生物膜的离体模型抗生素疗效检测

本方案介绍了利用自组装深孔PCR板装置进行生物膜生长及生物量测定的方法，适用于高通量96孔带钉盖静态生物膜筛选。...

利用PCR板深孔微孔板装置生成更多的细菌生物膜生物量

本方案描述了一种与囊性纤维化（CF）肺部相关的四物种多微生物生物膜模型，可用于探究细菌种间相互作用的影响。...

培养与囊性纤维化相关的多微生物生物膜以研究群落表型

该方法可用于建立囊性纤维化中的多微生物生物膜模型，以供科研和临床实验室进行抗菌敏感性测试。该模型在多种检测指标下均能提供准确且可靠的结果。...

开发一种多微生物菌落生物膜模型以测试囊性纤维化中的抗菌药物

本研究概述了一种构建多微生物聚集性生物膜模型的框架，并优化了RNA提取方案，以评估反映囊性纤维化肺部环境的铜绿假单胞菌（Pseudomonas...

用于研究感染相关基因表达的囊性纤维化聚集生物膜模型

学习使用耻垢分枝杆菌建立浮膜生物膜模型以研究细菌代谢与抗菌素耐药性。该简化方案通过模拟自然生长状态，为筛选抗微生物药物提供可靠的实验系统。

以分枝杆菌生物膜的培养作为研究抗菌耐药性的模型

探索更多视频