通过差示扫描荧光法检测CD40蛋白与伞形酮的相互作用

本方案具有显著优势，无需使用专业设备即可开展实验。与传统的氟化物定量 PCR 方法不同，该方法简化了实验流程，避免了繁琐的数据处理步骤，降低了整体操作复杂性，因而更加简便易行。本实验要求操作者必须非常熟悉实验步骤及荧光酶标仪的使用，在溶液加热和荧光检测过程中避免浪费过多时间。

我们将重点关注伞形酮通过CD40蛋白产生免疫效应的分子机制。首先，将500倍浓度的橙色染料加入PBS溶液中，以获得不同的染料比例。启动桌面上的数据采集软件。

单击仪器，然后选择相应的微孔板型号并单击“确定”。单击采集设置并选择荧光模式。在波长界面下，将激发波长设置为470纳米，发射波长设置为570纳米，然后按“确定”。将每种浓度的橙色染料各100 µL用移液器加入96孔板的孔中。

将培养板放入荧光酶标仪的检测位置。在软件中点击读数图标，于室温下以两分钟间隔对每种染料浓度的荧光值连续测量13次。每次测定后，点击导出图标，然后选择导出为 XML、XLS 或 TXT 格式。

选择所有孔板，然后在输出格式中选择孔板，点击“确定”以XLS格式保存数据，用于后续分析。现在打开数字加热振荡干燥浴。将加热温度设置为35摄氏度，加热时间为2分钟。

在1.5毫升微量离心管中配制染料的最佳稀释比例，然后将其置于数字加热振荡干浴仪中孵育2分钟。随后，向板的各孔中分别加入100微升PBS和染色溶液。

将培养皿放入仪器的检测阶段。在数据采集软件中点击读取图标。设置加热温度为40摄氏度，加热时间为2分钟。

现在将孔板中的染料溶液重新用移液器转移回1.5毫升微量离心管中。在数字加热振荡干浴仪中加热2分钟。重复加入染料溶液，并导出结果数据，以检测染料溶液在35至95摄氏度之间每升高5摄氏度时的吸光度。

将CD40蛋白溶液与PBS混合，配制终浓度分别为5、10、15和20微克/微升的溶液。接着，将橙色染料与PBS混合，配制终浓度为1:500的溶液。在35至95摄氏度范围内，以每5摄氏度为增量测定CD40蛋白溶液的吸光度。

将数据保存为 XLS 文件，然后使用数据分析软件计算熔点或 TM 值。接着，将 CD40 和伞形酮加入 PBS 溶液中。然后用移液器将橙色染料加入 PBS 中，得到 1:500 的溶液浓度。

在35至95摄氏度范围内，以每5摄氏度为增量，测定CD40伞形酮复合物溶液的吸光度。橙色染料在室温及高温条件下均表现出稳定的荧光激发特性。确定最佳稀释比例为1:500。

在15微克/毫升的浓度下可检测到51.82摄氏度的稳定TM值，随着CD40蛋白浓度的增加，该值下降至45.79摄氏度。