Name: 液相色谱串联质谱法在天然产物研究中的应用:以莨菪烷生物碱为例 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-08T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 学习液相色谱串联质谱法快速鉴定莨菪烷生物碱的技术，用于植物化学中天然产物的去重复化与新生物碱发现。该方法可在60至90分钟内完成样品分析，为药物研发提供高效筛选工具。

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本工作由北密歇根大学教师研究资助（授予 M.A.C.）、北密歇根大学本科生研究奖学金（授予 J.C）以及化学系资助。作者感谢 John Berger（NMU）在植物组织制备方面的协助，感谢 Hannah Hawkins（NMU）在液相色谱-质谱（LC-MS）仪器维护和故障排除方面的帮助，感谢 Ryan Fornwald 博士及其 CH 495（天然产物合成）课程的学生们制备乙酰托品混合物。作者还感谢 Daniel Jones 博士（密歇根州立大学）协助获取高分辨 MS/MS 谱图。

警告：使用所列化学品前，请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。
1. 样品制备
警告：液氮可导致冻伤。请在通风良好的区域使用低温防护手套和眼部保护装置。含生物碱的植物样品可能对皮肤有刺激性；操作时务必佩戴手套。甲醇具有毒性和易燃性，应在通风橱中操作，并远离潜在的点火源。
注意：理论上可使用栽培或野生植物组织（干燥或新鲜研磨）；以下步骤仅为方法开发过程中所采用的流程。
<ol>
	<li>若所用植物组织为新鲜材料，将其放入聚丙烯锥形管中，并浸入液氮中冷冻2-3分钟。</li>
	<li>将冷冻后的植物组织转移至预冷的研钵中（置于盛有液氮的聚苯乙烯保温盒内），用预冷的研杵将组织研磨成均匀的粉末。</li>
	<li>用预冷的刮勺迅速称取所需量的组织至已去皮重的聚丙烯微量离心管中，并立即加入20%甲醇（室温[RT]），每100 mg组织加入1 mL。 
	注意：20%甲醇常用于提取TAs25。有时会添加0.1%甲酸，但在本方法及其他方法的开发过程中未观察到提取效率的差异。</li>
	<li>将盖好的离心管置于摇床（中等速度）上，室温下至少振荡3小时。</li>
	<li>在9464 × g 条件下离心10分钟。用移液器吸取上清液至液相色谱-质谱（LC-MS）自动进样瓶中；若上清液仍浑浊，需先经0.45 µm针头滤器过滤。 
	注意：此步骤可作为暂停点，但处理后的植物新鲜样品及提取物在分析前应保存于-80 ˚C冰箱中，以避免生物碱可能发生降解。</li>
</ol>
2. 液相色谱-质谱仪配置与数据采集
警告：乙腈具有毒性和易燃性；应远离点火源，并在通风橱中控制其蒸气。甲酸具有腐蚀性；避免接触皮肤和眼睛，佩戴适当的个人防护装备。
<ol>
	<li>使用配备电喷雾电离（ESI）源和反相高效液相色谱柱（C18，4.6 × 100 mm）的液相色谱-质谱联用仪。</li>
	<li>对于高效液相色谱，使用含0.1%甲酸的H2以水作为溶剂A，乙腈中含0.1%甲酸作为溶剂B；用99% A和1% B平衡色谱柱。设置30分钟梯度洗脱程序：在26分钟内B相从1%线性增加至50%，在26.01分钟时返回至1% B，并在1% B条件下保持4分钟。色谱柱温度设为45 ˚C，流速为0.5 mL/min。</li>
	<li>在LC-MS方法中，质谱仪的操作参数如下：接口电压：4.0 kV，雾化气体流速：3 L/min，加热气体流速：10 L/min，DL温度：250 ˚C，加热块温度：400 ˚C，接口温度：300 ˚C，干燥气体流速：10 L/min，碰撞诱导解离（CID）气体（氩气）压力：17 kPa。</li>
	<li>在ESI正离子模式下建立一种质谱方法，该方法包含Q3扫描和Q1扫描（100–1000 Da），其中Q1扫描作为普查事件（持续时间与液相色谱方法一致），并启用自动同位素排除功能。将产物离子扫描作为Q1扫描的依赖事件（DD分析），设置质量窗口为50–1000 Da，碰撞池能量为-20 V，事件时间为 &#60;0.2 秒。 
	注意：触发Q1的DD产物离子扫描的计数阈值可以有所不同，但通常采用7,000–10,000计数的水平。在某些仪器上（例如本方法开发所用的仪器），Q3扫描比Q1具有更高的质荷比准确性和灵敏度，因此被纳入以确认在Q1扫描中观察到的离子，但即使省略步骤2.4中的Q3扫描也不会产生问题。</li>
	<li>向上述质谱方法中添加正离子模式的PrISs，其长度与液相色谱方法相同，碰撞池能量为-20 V，事件时间为0.75 s。确保在所有情况下， 自动同位素排除，或 脱同位素 功能已启用。确保 m/z TA片段感兴趣值（单位：Da，参见 图1A分别为124.1（单取代TAs，质量窗口为125–1000 Da）、122.1和140.1（双取代TAs，质量窗口起始值分别为123和141 Da），以及156.1和138.1（三取代TAs，质量窗口起始值分别为157和139 Da）。 
	注意：在方法开发过程中，PrIS 被分为两种不同的方法，一种用于单取代和二取代的 TAs，另一种用于三取代的 TAs，尽管它们可根据需要进行拆分或合并。</li>
	<li>构建第二个质谱方法，包含步骤2.4中的参数。
	<ol>
		<li>在该MS/MS方法中，添加正离子模式的NLS，其长度与LC方法一致，碰撞池能量为-20 V，事件时间为0.75 s。在所有情况下均需确保， 自动同位素排除 或 脱同位素 功能已启用。</li>
		<li>确保关注TA上酯类的中性丢失质量（以Da为单位，参见 图1B分别为100.05（来自惕各酸的酯类，质荷比范围110–1000 Da）、60.03（乙酰基，质荷比范围100–1000 Da）和166.06（苯乳酸或扁桃酸酯类，质荷比范围170–1000 Da）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>下载LC-MS方法，并为感兴趣的样品创建数据文件。当HPLC色谱柱在45 ˚C下平衡后，将感兴趣的样品以批次或项目文件形式进样，不同物种或组织类型之间应插入适当的提取溶剂空白。典型的进样体积为10–20 µL。 
	注意：在样品体积特别大时，质谱检测器可能会饱和。若运行浓度很高的样品，务必确保电喷雾离子源已清洁，并定期对仪器进行调谐。在所有数据采集完成后，可在此暂停实验方案。</li>
</ol>
3. 数据分析
<ol>
	<li>检查 Q1 和 Q3 扫描（以及 DD 产物离子扫描）的总离子色谱图，注意具有托烷生物碱（TA）特征的丰度较高离子的母离子质量：a) [M+H]+ 离子的质量&#60;500 Da，通常为偶数质量，b) 使用上述液相色谱方法时典型的保留时间（r.t.）在 2–22 分钟之间，c) 来自以下列表的碎片离子：m/z 93、124、142、140、122、138、156、174、110 或 128 Da。</li>
	<li>检查 m/z 124 的前体离子选择（PrIS）色谱图/通道，记录在哪些保留时间（在步骤 3.1 中已记录）的峰/离子会产生该碎片。逐次点击扫描色谱图，并结合依赖性解离（DD）产物离子扫描获得的完整二级质谱图进行分析，尤其针对低丰度物种。 
	注意：真正含有该碎片的化合物会在多个扫描中出现，并同时在 Q1 和 Q3 扫描中被检测到（如果使用了后者）。支持信息中附有一个电子表格（补充文件 1），以辅助进行&#160;注释。</li>
	<li>对其他 PrIS 色谱图重复步骤 3.2。由于 m/z 122 和 140 均提示存在二取代托烷生物碱，而 m/z 138 和 156 均提示存在三取代托烷生物碱，因此应将这些色谱图/通道合并分析。</li>
	<li>检查中性丢失扫描（NLS）色谱图/通道中 m/z 100、60 和 166 的信号，记录在哪些保留时间（在步骤 3.1 中已记录）的峰/离子会产生这些中性丢失。与 PrIS 分析类似，逐次点击扫描色谱图，并与 DD 产物离子扫描中获得的裂解谱图进行比较，尤其针对低丰度物种。</li>
	<li>结合 PrIS 和 NLS 数据，并以 DD 产物离子扫描结果作为支持，通过将最小的托烷骨架质量（例如 124、122 或 138）与中性丢失质量相加，再计算剩余质量，对观测到的生物碱进行初步注释。 
	注意：常见取代基团及其质量（Da）包括羟基（18）、乙酰基（60）、丙酰基（74）、异丁酰基（88）、惕各酰基（100）、饱和惕各酰基/2-甲基丁酰基（102）以及苯乳酸/扁桃酸（166）。</li>
	<li>将生物碱的注释结果与文献17和数据库（如 MoNA）26中报道的结果进行比较，以确定哪些托烷取代模式已有报道，哪些可能是新化合物。此外，可使用市售的常见托烷生物碱标准品（如阿托品、勒托林、东莨菪碱）进行验证。</li>
	<li>对于低丰度样品，为进一步获取结构信息（PrIS 和 NLS 可能检测到低于依赖事件阈值的离子），应对更浓缩的样品采集针对目标质量作为前体离子的特异性产物离子扫描。 
	注意：本方法基于低分辨率三重四极杆（QQQ）仪器开发。对于所有初步鉴定的新化合物，应使用高分辨率质谱仪获取精确质量谱图。</li>
</ol>

Classification of Tropane Alkaloids from Plant Metabolites Using LC-MS/MS

<ol><li>Newman, D. J., Cragg, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+products+as+sources+of+new+drugs+over+the+30+years+from+1981+to+2010%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nat+Prod%22%5BJournal%5D)">Natural products as sources of new drugs over the 30 years from 1981 to 2010.</a> J Nat Prod. 75, 311-335 (2012).</li>
<li>Newman, D. J., Cragg, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+products+as+sources+of+new+drugs+over+the+nearly+four+decades+from+01%2F1981+to+09%2F2019%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nat+Prod%22%5BJournal%5D)">Natural products as sources of new drugs over the nearly four decades from 01/1981 to 09/2019.</a> J Nat Prod. 83 (3), 770-803 (2020).</li>
<li>Kohnen-Johannsen, K., Kayser, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropane+alkaloids%3A+Chemistry%2C+pharmacology%2C+biosynthesis+and+production%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Tropane alkaloids: Chemistry, pharmacology, biosynthesis and production.</a> Molecules. 24 (4), 796(2019).</li>
<li>Shim, K. H., Kang, M. J., Sharma, N., An, S. S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beauty+of+the+beast%3A+anticholinergic+tropane+alkaloids+in+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Prod+Bioprospect%22%5BJournal%5D)">Beauty of the beast: anticholinergic tropane alkaloids in therapeutics.</a> Nat Prod Bioprospect. 12 (1), 33(2022).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

尽管&#160;本方案中提供的仪器参数可实现良好的运行效果，但该方法的成功应用可能需要对若干关键步骤予以仔细关注或优化。尽管步骤2.2中提供的高效液相色谱（HPLC）溶剂梯度通常适用于托烷类生物碱，但其可能需要根据待测样品或植物物种的托烷类生物碱谱型进行调整。样品进样体积也可根据仪器的灵敏度及方法的具体应用情况进行调整。 &#34;深度&#34; 代谢谱分析或去重复化应使用较大的进样体积（本研究中使用了15–20 µL），而仅对生物碱进行简单检测时可使用较小的体积。使用大体积样品时需注意：（a）定期清洁离子源；（b）监测高效液相色谱柱的压力变化或堵塞情况（应始终使用合适的保护柱）；（c）防止样品间的交叉污染；（d）检查色谱图中可能存在的 &#34;同位素泄漏&#34; 如上所述。为避免过早发生源内碎裂，接口温度和电压不应显著偏离方法中规定的数值。此外，尽管建议碰撞池电压为20 V，但该参数可能无法对所有萜类生物碱（TAs）均提供最佳的色谱信号（或特征性DD产物离子扫描碎片）。某些质谱仪及其功能具有 &#34;碰撞能量梯度&#34; 特征，或在多种或优化的碰撞能量下采集扫描数据的能力，这一功能在此类方法中也可能具有应用价值30.
该质谱方法本身也易于修改：尽管惕各酸、乙酸以及苯乳酸/托品酸酯在 曼陀罗 物种之间，TA酯基取代模式可能在其他植物或样品中有所不同。可通过改变NLS质荷比来检测其他酯基（例如，丙酸酯失去74 Da）或潜在地检测糖基化修饰（例如，己糖失去162 Da）。PrIS的质荷比也可相应调整。例如，某种TA在两者中均存在 曼陀罗 样品（保留时间 = 12.5 分钟；参见 补充文件 1 和 补充文件 2被注释为去甲基莨菪碱或去甲基 littorine（莨菪碱/littorine 减去托品烷） N-甲基）的DD产物离子扫描碎片m/z 110 和 93）并与文献图谱进行比对31；该TA未在任何莨菪烷片段PrIS通道中出现。可为这两个质量数增设一个通道，以检测去甲莨菪烷类物质。 m/z 93 片段也存在于大多数单取代的 TAs 中17；添加该通道可为单取代TA的存在提供额外确认，并有助于减少假阳性结果。
除了适用于不同类型的托烷类生物碱（TAs）外，本方案相较于现有的生物碱注释方法，另一个主要优势在于其速度。根据质谱（MS）方法的配置（以及所用的高效液相色谱运行时间），一个样品的所有二级质谱（MS/MS）数据可在60至90分钟内完成采集。例如，在我们的研究中，单取代和双取代TAs的前体离子扫描（PrIS）被整合为一个方法，三取代TAs的PrIS为另一个方法，中性丢失扫描（NLS）为第三个方法（所有方法均包含DD产物离子扫描），共计三次进样，每次30分钟。利用整合的MS/MS数据对样品进行全面注释，远比手动检查每一个色谱峰或对多个目标峰逐一进行单独的产物离子扫描更为高效。该方法可在任何具备产物离子扫描、PrIS和NLS模式的仪器上实施，可用于快速定性评估（即：样品中是否存在TAs？），用于区分或&#34;指纹图谱分析&#34;不同植物属、种、变种或栽培品种、器官或生长阶段，以及将检测到的TAs与已有文献报道的成分进行比对（作为去重复化工作流程的一部分）。如本研究所示，该方法还可用于发现新的TAs，作为后续分离、纯化或生物活性测试的先导化合物，并有助于识别可用于分离这些化合物的候选物种和组织。该方法可广泛应用于天然产物和代谢组学领域，包括辅助解析植物生物化学机制以及早期药物发现研究。此外，该方法还可拓展应用于食品安全或法医学领域（例如：检测食品、膳食补充剂或生物流体中的TAs）。
该方法确实存在若干缺点，值得讨论。首先，根据所用仪器及采用该方案的目的，可能需要较大的样品进样体积，这可能导致仪器性能问题，并在某些情况下增加假阳性结果的风险（如上所述）。其次，该方法是在一台低分辨率的三重四极杆（QQQ）仪器上开发的，低分辨率可能导致假阳性结果（例如，含有某一特征的组分可能因分辨率不足而被误判）。 m/z 阴性中的124片段&#160;对照组并非TA）。更高分辨率的仪器可提供更强的诊断能力，且应对任何提出的新生物碱获取准确质量的MS/MS谱图。该方法的其他缺点仅仅是MS/MS分析整体所固有的局限性。尽管MS/MS在结构推定方面具有实用价值（&#34;注释&#34; 由代谢组学标准倡议组织指定32），但它无法提供分子连接性的具体指认&#34;鉴定&#34;）。例如，在两者中 曼陀罗 样本，我们发现&#160;多种异构体 m/z 306 TA，似乎同时具有两者 m/z 124 和 m/z 140个片段（补充文件 2），因此难以明确确定取代模式。这可能代表了一种尚未发现的裂解机制，而另一种技术（如核磁共振波谱法）可能有助于解决这些不确定性。基于串联质谱（MS/MS）的方法在处理异构现象时常常存在困难：苯乳酸酯类化合物 littorine（或其衍生物）难以与托品酸酯类化合物莨菪碱（hyoscyamine）相区分，而其他茄科植物中含有被异构体惕各酰基（tigloyl）、千里光酰基（senecioyl）和当归酰基（angeloyl）取代的托烷类生物碱（TAs）。33,34；在缺乏标准品的情况下，这些化合物可能难以甚至无法区分。该方法也无法区分对映异构体（例如，3,6-与3,7-二羟基托烷；参见 图1 用于编号）或区域异构体（例如，在无标准品情况下区分3-乙酰基与7-乙酰基）。我们依据该属先前报道的规律，将大多数单取代托烷类化合物指定为3-取代产物 曼陀罗 及其他茄科植物17,35.&#160;因此，在进行仪器分析的同时，应始终参考所研究生物体的任何生化知识或相关文献（如有）。

尽管全合成分子在近几十年的药物发现中变得越来越重要，但过去39年中获批的所有药物中仍有近三分之二为天然产物或受天然产物启发而开发的药物1,2&#160;，这凸显了天然产物研究持续的重要性。生物碱是一类含氮的天然产物，因其药用价值而备受重视。托烷类生物碱（TAs）含有[3.2.1.]双环含氮结构，主要由茄科（茄科植物）、古柯科（Erythroxylaceae）和旋花科（Convolvulaceae）植物产生。代表性化合物包括阿托品、东莨菪碱和可卡因；此外，多种半合成或全合成的托烷类化合物也已应用于临床治疗3。TAs及其衍生物可用于治疗多种疾病3,4，其中一些药物被列入世界卫生组织2023年基本药物清单5。由于其强效的药理活性，TAs也被用于娱乐性用途（作为兴奋剂或致幻剂），并可能因摄入含此类成分的植物（或其制剂）而导致中毒6,7。TAs在人和动物食品中属于有害物质8，可能污染茶、香料、谷物、蜂蜜及草本补充剂9,10。&#160;鉴于其潜在的药用价值和毒性风险，能够辅助发现新托烷类生物碱（以及鉴定已知TAs）的分析方法具有重要意义。
在串联质谱法（MS/MS）中，&#34;质量过滤器&#34;（例如四极杆、飞行时间管）在物理上相互连接（&#34;空间串联&#34;），或仪器采用额外的&#34;时间串联&#34;反应/分离步骤。空间串联MS/MS在不同的质量过滤器上使用不同模式，以选择和碎裂不同的离子（例如三重四极杆或QQQ仪器中的四极杆）。这些不同模式可用于确定特定离子产生的具体碎片（产物离子扫描）、样品中哪些离子产生特定碎片（前体离子扫描或PrIS）或发生特征质量的中性丢失（中性丢失扫描或NLS），以及特定化合物是否含有特定碎片（多反应监测）。因此，MS/MS提供的碎片信息可用于推断新化合物的结构或确认已知化合物的存在。MS/MS在药物发现、天然产物化学和代谢组学领域中的应用日益广泛11,12&#160;，并已被用于分析含生物碱物种的化学成分（用于植物化学表征或化学分类学分析），以及在食品或药用植物中检测和定量特定生物碱10,13,14,15,16。
尽管已有多种质谱技术可用，发现新生物碱仍面临诸多挑战。除了需要筛选合适的候选生物体外，对生物碱进行完整的结构确证也是一个艰巨的过程，可能涉及多种不同的分析技术。此外，研究人员可能分离出已知化合物，从而浪费人力、时间和资源。这一问题在萜类生物碱（TAs）中尤为突出，据报道已有数百甚至数千种TAs，其中许多互为同分异构体。该过程的 &#34;识别已知因素并将其与未知因素区分开来&#34; 被称为去重（dereplication）。已发表的不同生物碱（TAs）及其他化合物的保留时间（r.t.s）和质谱碎片数据库，可辅助这一过程17,18.&#160;尽管如此，去重复化过程十分耗时；仅对样品完整LC-MS/MS色谱图中生物碱进行注释（即指认其可能结构）就需耗费大量时间。近年来，分子网络分析19,20 以及人工去重18,21,22 已用于苯基异喹啉、单萜吲哚和托烷类生物碱，而PrISs已被用于 &#34;结构过滤&#34; 通过光谱分析鉴定吡咯里西啶类和茄啶型生物碱23,24.&#160;目前尚无针对含生物碱（TA）样品的基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的快速去重方法或工作流程，尽管生物碱具有共同且易于识别的碎片离子图1）。本文所述方法结合了数据依赖型（DD）产物离子扫描、前体离子扫描（PrISs）和中性丢失扫描（NLSs），通过一取代、二取代和三取代托烷类化合物特有的碎裂模式，对植物中托烷类生物碱（TA）结构进行注释与分类。图1A）以及这些生物碱中常见酯基团的丢失（图1B）。研究对象为茄属中的多个物种 曼陀罗. 多样化萜类生物碱的丰富来源， 曼陀罗 已被使用&#160;在世界历史上被用于医药和文化目的17- 由于其含有大量结构相似的TAs，是一种难以去重的复杂基质，为我们提供了用于测试方法的理想样品。

<table><tbody><tr><td>乙腈，用于超高效液相色谱，适用于质谱分析</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>900667</td><td>HPLC溶剂</td></tr><tr><td>氩气</td><td>AirGas</td><td>AR UHP300</td><td>CID气体</td></tr><tr><td>甲酸，99% 分析纯</td><td>Thermo Scientific</td><td>AC270480010</td><td>HPLC添加剂</td></tr><tr><td>保护柱柱套</td><td>Restek</td><td>25812</td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱仪，Shimadzu LC-2030C 3D Plus</td><td>Shimadzu</td><td>228-65802-58</td><td>HPLC色谱柱</td></tr><tr><td>液相色谱-质谱联用仪，Shimadzu LCMS-8045</td><td>Shimadzu</td><td>225-31800-44</td><td>质谱仪；我们使用LabSolutions软件，该软件为Shimadzu仪器的标准配置</td></tr><tr><td>液氮</td><td>AirGas</td><td>NI 180LT22</td><td></td></tr><tr><td>甲醇，用于HPLC/UHPLC/LCMS</td><td>VWR</td><td>BDH 85800.400</td><td>用于配制提取溶剂</td></tr><tr><td>微量离心机&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>2400-37</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管，1.5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>研钵&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB961C</td><td>用于研磨植物组织</td></tr><tr><td>研杵</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB961M</td><td>用于研磨植物组织</td></tr><tr><td>移液器 1000 µL</td><td>Gilson&amp;nbsp;</td><td>F144059M</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 1000 µL</td><td>Fisher scientific</td><td>02-707-404</td><td></td></tr><tr><td>植物组织</td><td>多种来源</td><td>N/A</td><td>可为野生或栽培植物材料</td></tr><tr><td>聚丙烯圆锥形离心管，15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-4</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯保温箱</td><td>ULINE</td><td>S-18312</td><td>适用于分子生物学试剂运输所用的保温箱类型</td></tr><tr><td>Roc C18 3 &amp;micro;m, 100 mm x 4.6 mm</td><td>Restek</td><td>9534315</td><td>HPLC色谱柱</td></tr><tr><td>Roc C18, 10 mm x 4 mm</td><td>Restek</td><td>953450210</td><td>保护柱</td></tr><tr><td>摇床振荡器</td><td>Themo Scientific</td><td>11-676-680</td><td></td></tr><tr><td>螺口小瓶便捷套装（9 mm）</td><td>Fisher scientific</td><td>13-622-190</td><td>LCMS自动进样器小瓶</td></tr><tr><td>注射器，3 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-377-27</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器，0.45 &amp;micro;m&amp;nbsp;</td><td>Avantor/VWR</td><td>76479-008</td><td></td></tr><tr><td>水，用于液相色谱和质谱分析</td><td>JT Baker</td><td>9831-03</td><td>用于配制提取溶剂</td></tr><tr><td>水溶液，含0.1% v/v甲酸，用于超高效液相色谱，适用于质谱分析</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>900687-1L</td><td>HPLC溶剂</td></tr></tbody></table>

液相色谱-串联质谱在天然产物研究中的应用：以托烷生物碱为例

Applications of Liquid-Chromatography Tandem Mass Spectrometry in Natural Products Research: Tropane Alkaloids as a Case Study

尽管当今使用的许多药物均为合成来源，天然产物仍为新颖的化学多样性和生物活性提供了丰富来源，并可为耐药性或新发疾病提供有前景的先导化合物。然而，这一领域面临双重挑战：研究人员不仅需要发现天然产物并阐明其结构，还必须确定哪些成分值得分离和检测（同时排除已知化合物，这一过程称为去重复化）。随着现代分析仪器的发展，天然产物的发现与去重复化进程已显著加快。液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）已成为识别和分类化学结构的特别有价值的技术。托烷类生物碱（TAs）是一类具有重要药理和毒理意义的植物源性化合物。在本研究中，我们开发了一种基于LC-MS/MS的筛选工作流程，利用三重四极杆（QQQ）质谱仪上可用的多种MS/MS模式，根据其特有的碎片化模式对TAs结构进行注释和分类。通过结合使用数据依赖型（DD）产物离子扫描、前体离子扫描（PrIS）和中性丢失扫描（NLS），我们将该方法应用于富含托烷类生物碱的茄科植物Datura stramonium和Datura metel的提取物分析。该方法快速、灵敏，成功用于含复杂TAs样品的初步去重复化，并发现了一个新的候选化合物，可用于后续的分离、纯化及最终的生物活性检测。

我们提出了一种基于质谱（MS）/质谱（MS）的快速标注与分类莨菪烷类生物碱的方法，该方法既可用于含莨菪烷样品的初步去重，也可用于发现需分离的新生物碱。

尽管如今使用的许多药物均为合成来源，天然产物仍为新颖的化学多样性和生物活性提供了丰富的来源，且……

在我们研究的最简单形式中，我们正试图发现植物中的新分子。植物在化学上具有复杂性，而其中一些化学物质可能具有药用价值。我们尤其感兴趣的是寻找新的生物碱，这是一类含氮的特定分子。近年来，我们拥有了大量新型且多样的生物碱分析仪器和技术，使得人们每天都能发现越来越多的新分子。借助这些仪器，我们可以回答诸如：存在哪些化学物质、它们在何时出现、在植物的哪个部位可以找到等问题。作为一项分析技术，质谱法在过去50年中得到了显著发展。仪器的性能更强、成本更低，且分辨率更高。这些技术不仅使我们能够鉴定出更多的植物分子（如生物碱），还能更准确地进行鉴定。该方法快速且灵敏。我们能够在60至90分钟内收集到包含多种托烷类生物碱的茄科植物的完整数据集，并为即使丰度较低的生物碱提出可能的结构。我们非常感兴趣于开发基于串联质谱的筛选方法，用于其他类别的生物碱，并利用此类方法研究植物化学成分在不同物种、不同植物部位以及不同生长阶段之间的差异。首先，使用预冷的刮勺将100毫克植物组织粉末加入分层的聚丙烯微量离心管中。然后，立即向试管中加入1毫升20%甲醇。将盖好的试管置于摇床中，室温下振荡3小时。接着，在9,464 ×g条件下离心10分钟，收集上清液至液相色谱-质谱（LC-MS）自动进样瓶中。使用配备电喷雾离子源和反相高效液相色谱柱的液相色谱-质谱联用仪。在高效液相色谱中，以含0.1%甲酸的水溶液作为流动相A，含0.1%甲酸的乙腈溶液作为流动相B。将色谱柱温箱温度调节至45摄氏度，流速调节至0.5毫升每分钟。用99%A和1%B的流动相平衡色谱柱。设置30分钟梯度，使溶剂B的浓度在26分钟内从1%升至50%。然后在26.01分钟时迅速降至1%B，并维持4分钟。配置质谱仪的操作参数。将接口电压设为4千伏，雾化气体流速设为3升/分钟，加热气体流速设为10升/分钟。调节脱溶剂管温度至250摄氏度，加热块温度至400摄氏度，接口温度至300摄氏度。设定干燥气体流速为10升/分钟，碰撞诱导解离气体压力为17千帕。在电喷雾离子化源正离子模式下建立质谱方法。包括 Q3 和 Q1 扫描，Q1 扫描的质量范围为 100 至 1,000 道尔顿，作为带有自动同位素排除功能的全扫描事件。添加与 Q1 扫描关联的产物离子扫描，质量窗口为 50 至 1,000 道尔顿，碰撞池能量为 20 伏特，事件时间小于 0.2 秒。接下来，调整质谱方法，添加正离子模式前体离子扫描，其长度与液相色谱方法一致，碰撞池能量设为 20 伏特，事件时间设为 0.75 秒。确保在所有情况下均启用自动同位素排除或去同位素功能。设定单取代、二取代和三取代托烷生物碱碎片的主电荷值。接下来，在MS-MS方法中，添加正离子模式下的中性丢失扫描，其扫描时长与LC方法一致，碰撞池能量设为20伏特，事件时间为0.75秒。确保在所有情况下均启用自动同位素排除或去同位素功能。针对托烷类生物碱酯类化合物，设置感兴趣的中性丢失质量，包括由惕各酸、乙酰基以及苯乳酸或扁桃酸形成的酯类。下载液相色谱-质谱（LC-MS）方法，并为感兴趣的样品创建数据文件。当高效液相色谱（HPLC）柱温平衡至45摄氏度后，进样10至20微升样品。完成植物根系提取物的LC-MS运行后，分析Q1和Q3扫描的总离子色谱图，包括数据依赖性产物离子扫描。观察具有托烷类生物碱特征的显著离子峰，包括带正电荷的 M+H 离子质荷比低于 500 道尔顿（通常为偶数）、保留时间为 2 至 22 分钟，以及与托烷类生物碱一致的碎片离子，其母离子电荷值符合特征碎片标准。特别针对母离子电荷值为 124 的前体离子扫描色谱图或通道进行检查，确定在哪些保留时间出现产生该特定碎片的色谱峰或离子。逐次点击扫描色谱图，逐个查看数据依赖性产物离子扫描所获得的完整二级质谱图，尤其关注丰度较低的组分。接下来，分别对母离子电荷为122和140的前体离子扫描色谱图进行联合分析，这两者提示为二取代托烷类生物碱；同时分析母离子电荷为138和156的色谱图，这两者提示为三取代托烷类生物碱。检查母离子电荷为160和166的中性丢失扫描色谱图或通道，确定哪些峰或离子产生了中性丢失，并记录其保留时间。逐个扫描色谱图，并与数据依赖性产物离子扫描碎裂结果进行比较，尤其针对丰度较低的组分。结合前体离子扫描和中性丢失扫描数据，并以数据依赖性产物离子扫描结果作为支持，对观测到的生物碱进行初步注释。从最小的托品烷质量开始，逐步加上中性丢失，并解释任何剩余的质量。将生物碱的注释结果与文献报道的数据进行比对，以确定托烷类生物碱的取代模式。此外，可使用市售的常见托烷类生物碱标准品进行验证。Datura metel 根提取物的完整 Q1 扫描色谱图显示出多种丰度不同的托烷类生物碱。主电荷124、122、140、138和156的特征峰表明存在托烷类生物碱。许多此类托烷类生物碱被乙酰化、惕各酰化，或来源于苯乳酸或扁桃酸，中性丢失扫描色谱图中的信号为此提供了证据。通过利用质谱数据，可对特定生物碱进行注释，尤其鉴定出一种表观质量为主电荷224的化合物。该方法通过化合物的碎片化模式和中性丢失推导出其结构，证实了惕各酰基团作为取代基的存在。对曼陀罗种子甲醇水提取物的检测获得了完整的Q1扫描基峰色谱图，鉴定出一种丰度较高的单取代托烷类生物碱，可能为莨菪碱。高分辨串联质谱还能够鉴定出曼陀罗种子中的新生物碱。

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