从共培养中生长三维促结缔组织增生性胰腺癌球体
2024年9月27日
胰腺癌仍然是最难治疗的癌症之一。因此，用于评估治疗效果的临床前模型必须具有可重复性和临床相关性，这一点至关重要。本方案描述了一种简单的共培养方法，用于生成可重复且具有临床相关性的纤维化球状体。
三维球状体培养物正越来越多地用于研究肿瘤生长的机制性问题，并用于筛选新的治疗方法。因此，这些模型的临床代表性至关重要。我们采用该技术，重点模拟在包括胰腺癌在内的多种癌症中观察到的间质纤维化（desmoplasia）现象。
类球体培养已发展到可整合患者来源的细胞、包含免疫细胞的复杂共培养体系以及血管等生理结构。此外，微流控技术被用于高通量筛选和构建器官芯片系统。目前，类球体中的多组学分析也被用于深入揭示其作用机制。
该方法可用于构建具有稳定细胞外基质（ECM）且不含合成基质材料的可重复三维共培养类球体。其优势在于，该细胞外基质能够紧密模拟临床肿瘤，且不会因相关合成基质干扰治疗药物的筛选应用。该模型将有助于评估细胞外基质对治疗药物的响应，并解答关于多种癌症中细胞外基质所构成的动态屏障的重要机制性问题。
我们计划扩展该模型，以纳入免疫细胞和巨噬细胞组分，此外还将拓展该模型的应用，用于研究细胞外基质（ECM）作为治疗屏障在癌症以外疾病（如结核病肉芽肿）中的作用。首先，获取 PANC-1 细胞培养物，用九毫升 Hanks' 平衡盐溶液，以每次三毫升的增量洗涤细胞。将细胞与两毫升胰蛋白酶共同孵育约 10 分钟。
为了中和悬浮液，加入3毫升添加了10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基。用1毫升培养基将细胞洗涤七次后，每次中和的等分试样均收集至15毫升离心管中。类似地，使用胰蛋白酶中和溶液和星状细胞培养基，获取经胰蛋白酶消化的人胰腺星状细胞（HPaSteC）。
将两种细胞悬液按所需量加入11毫升含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中，混匀时避免产生气泡。轻柔地将100微升细胞悬液混合物加入培养板孔中，于37°C、5%二氧化碳条件下孵育。第3天时，沿孔壁向每孔加入50微升含10%FBS的DMEM培养基。
在第10天或第11天，吸出用过的培养基，注意不要扰动晕圈附近的溶液，然后沿每个孔的孔壁加入100 µL新鲜培养基。在第14天或第17天，使用1 mL移液器从每个孔中移除培养基，直至到达晕圈位置。将培养板紧贴生物安全柜背景，以便观察并定位底部的类球体。
轻轻吹打类球体周围的培养基约50微升，以扰动类球体使其聚集。第14天获得的类球体平均体积可达0.048立方毫米。
概述
本方案概述了一种共培养方法，用于构建具有临床相关性和可重复性的胰腺癌研究用促结缔组织增生性球状体。利用三维球状体培养可进行肿瘤生长机制研究及治疗药物筛选。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 肿瘤学
- 细胞生物学
背景
- 由于胰腺癌具有侵袭性强的特点，其治疗颇具挑战性。
- 间质纤维化是包括胰腺癌在内的多种癌症的常见特征。
- 三维球状培养可整合患者来源的细胞和免疫细胞。
- 微流控技术可增强高通量筛选能力。
研究目的
- 建立一个可重复的胰腺癌研究模型。
- 在具有临床相关性的背景下评估治疗效果。
- 模拟肿瘤的促结缔组织增生微环境。
使用的方法
- 用于生成球状体的共培养步骤。
- 整合患者来源细胞与免疫细胞。
- 利用微流控技术进行筛选。
- 通过多组学分析获得机制性见解。
主要结果
- 成功生成促结缔组织增生性球状体。
- 证实了其与临床胰腺癌微环境的相关性。
- 实现了治疗药物的高通量筛选。
- 揭示了肿瘤生长机制的相关见解。
结论
- 共培养方法是胰腺癌研究中的重要工具。
- 三维球状模型有助于深入理解肿瘤生物学特性。
- 该方法可能有助于优化治疗策略。
常见问题
行业重要性概要
通过共培养生成的富含间质的三维胰腺癌类球体提供了一种临床相关且可重复的模型，能够紧密模拟肿瘤微环境，包括细胞外基质（ECM）屏障。该体系可实现治疗筛选的机制性降风险和预测可信度，解决了临床前模型常难以转化为临床疗效的关键瓶颈。该模型与临床肿瘤特征高度一致，有助于在早期发现和临床前研究中做出基于风险评估的项目组合决策。
生物制药研发中的策略应用
早期发现与靶点验证
- 可在与疾病相关的细胞外基质环境中验证治疗假设。
- 通过模拟临床纤维化反应，支持靶点的功能性验证。
- 有助于揭示靶向肿瘤微环境的候选疗法的作用机制，降低研发风险。
- 提高化合物在研发管线中推进的预测可靠性。
筛选与检测方法开发
- 提供一种标准化的、无支架的三维系统，用于定量评估药物反应。
- 确保高通量筛选应用的可重复性和可扩展性。
- 生成稳定的细胞外基质（ECM）组分，从而可靠地评估靶向ECM的药物。
- 制备经过验证的生物系统，用于后续的机制研究和功效评估。
转化与临床前研究
- 将临床前模型与临床肿瘤细胞外基质（ECM）特征相匹配，以实现转化研究的连续性。
- 在生理相关环境下支持生物标志物的发现与验证。
- 基于具有临床预测价值的数据，实现风险调整后的研发推进决策。
- 促进将细胞外基质（ECM）作为治疗屏障的机制研究。
流程与工作流整合
这种共培养球状模型通过提供一个具有临床相关性的平台用于假设验证和药物筛选，从而连接了早期发现、先导化合物鉴定和临床前验证。
- 发现生物学：支持在致密基质微环境中进行假设验证和通路解析。
- 筛选：针对富含细胞外基质的球状体，提供可重复、定量的结果，用于化合物评价。
- 分析：可测量球状体体积和细胞外基质组成，以比较不同治疗方案的响应效果。
- 转化研究：保持与临床肿瘤特征的一致性，适用于生物标志物和疗效研究。
- 企业级复用：提供可重复使用、标准化的平台，可适配于其他细胞类型和疾病模型。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶向细胞外基质（ECM）治疗开发的预测可信度，并减少机制上的模糊性。
- 操作价值：增强跨职能研发团队在标准化、可重复性和可扩展性方面的表现。
- 战略价值：通过将临床前模型与临床结果相匹配，优化决策流程，提升资本使用效率。
- 项目组合影响：支持基于风险调整的候选项目优先排序与推进，促进具有更高转化潜力的项目发展。
实施注意事项
- 需要具备三维细胞培养及共培养技术的专业知识。
- 需要具备用于类球体评估的成像和定量分析基础设施。
- 要求跨团队标准化，以确保不同筛选项目间的可重复性。
- 通过优化实验方案，可适用于其他细胞类型或疾病模型。
- 根据现有验证数据，目前仅限于细胞外基质丰富的肿瘤环境。
