量化铁饥饿和厌氧生长后假 结核耶尔森 菌 III 型分泌系统活动
May 31st, 2024
细菌定植于氧和铁生物利用度不同的宿主组织，但大多数研究细菌的方法都使用通气的丰富培养基。该方案描述了在不同铁浓度和氧分压下培养人类病原体 假结核耶尔森 菌，并量化 III 型 耶尔森菌 分泌系统的活性，这是一个重要的毒力因子。
细菌病原体使用毒力因子在宿主生物体内的不同生态位定植。我们正在努力了解细菌病原体如何感知宿主组织中的特定环境线索以调节毒力因子表达。人类病原体假结核耶尔森菌 （Yersinia pseudotuberculosis） 利用 3 型分泌系统毒力因子将效应蛋白注射到宿主细胞中。
3 型分泌系统允许细菌破坏宿主防御机制并在宿主组织中定植。然而，耶尔森菌 III 型分泌系统的表达在代谢上是繁重的，因此 3 型分泌系统基因的表达受到严格调节，以响应温度等环境线索。我们之前的出版物表明，耶尔森菌 III 型分泌系统的表达受铁可用性和氧张力通过称为 ISCR 的转录因子控制。
这些发现很重要，因为耶尔森菌定植于铁含量和氧张力不同的宿主组织。例如，肠腔含有足够的铁，适合耶尔森菌的生长，但氧分压较低。相比之下，像血液这样的组织具有非常低的铁可用性，但氧张力较高。
我们的方法使我们能够在可用铁和氧量不同的培养条件下培养耶尔森菌，以研究这些环境线索如何影响 3 型分泌系统的表达。这种方法将帮助我们确定铁和氧的可用性控制 3 型分泌系统表达的分子机制，并帮助我们了解这如何控制耶尔森菌感染的结果。首先，在 Lysogeny 肉汤琼脂平板上划线 Yersinia Pseudo tuberculosis。
将板在室温下孵育 48 小时。一旦形成可见的菌落，将单个分离的菌落接种到 4 mL M9 培养基中。在 26 摄氏度下培养过夜，并以 250 RPM 的转速曝气。
将含有培养物的比色皿放入光谱仪中，然后在 14 毫升无菌螯合 M9 培养基中稀释培养物，无需补铁，以达到 0.1 的 OD 600 值。将培养瓶放入 26 摄氏度的摇床中，孵育 8 小时。孵育完成后，使用培养物开始三种新鲜培养物;两个用于厌氧生长，一个用于有氧生长。
对于需氧培养，在 14 毫升无菌螯合 M9 培养基中将培养物稀释至 OD600 值为 0.1，无需补铁。然后，在 26 摄氏度下通气培养 12 小时。对于厌氧培养，将 14 毫升无菌螯合 M9 培养基中的培养物稀释到两个酸洗玻璃管中。
在第一管中，加入过滤灭菌的硫酸铁，最终浓度为 1 毫克/升。在第二根试管中，加入硫酸铁，终浓度为 0.01 毫克/升。将两支试管在室温下在厌氧室中孵育 12 小时。
然后，通过将厌氧培养物转移到 37 摄氏度并继续孵育 4 小时来诱导 3 型分泌系统活性。接下来，通过将 14 毫升螯合的 M9 培养基添加到两个酸洗烧瓶中，将有氧生长的培养物稀释至 OD 600 值为 0.2。将所需最终浓度的硫酸铁添加到培养瓶中。
将两个培养瓶在 26 摄氏度下以 250 RPM 的通气孵育 2 小时。2 小时后，将培养物转移到 37 摄氏度，以 250 RPM 的转速通气 4 小时，以诱导 3 型分泌系统活性。在假结核耶尔森菌中诱导 3 型分泌系统后，将孵育的这种培养物的标准化体积转移到 15 毫升试管中。
向每管中加入 4 微升牛血清白蛋白作为蛋白质沉淀对照。将培养物在 3， 200 G 和 4 摄氏度下离心 15 分钟。使用连接到注射器的 0.22 微米 PVDF 过滤器将上清液过滤到新鲜的 15 毫升试管中。
然后，加入相当于上清液体积 10% 的三氯乙酸。用力涡旋试管一分钟。将试管在 4 摄氏度的冷藏室中在冰上孵育过夜。
接下来，将每种样品 2 毫升加入 2 毫升试管中，然后在 4 摄氏度下以 21， 000 G 离心 15 分钟。使用真空附件吸出上清液。重复将两毫升样品移液到同一管中，离心并吸出上清液。
将沉淀反应物合并到一个 2 ml 试管中。用 1 毫升冰冷的 100% 丙酮洗涤沉淀，然后离心并吸出上清液。最后一次去除上清液后，在工作台上干燥沉淀 1 小时。
沉淀的蛋白质应看起来像管侧面的雾状物。然后，将每个沉淀重悬于 50 微升 F-S-B-DTT 溶液中。彻底涡旋 1 分钟。
接下来，将样品放在 95 摄氏度的加热块上煮沸 15 分钟。然后，在室温下以最大速度短暂离心。将 15 微升每个厌氧样品和 10 微升每个需氧样品加载到 12.5% SDS-PAGE 凝胶中进行分析。
凝胶电泳完成后，使用银染观察凝胶上的蛋白质。首先，将含有假结核耶尔森菌分离需氧样品的 SDS-PAGE 凝胶置于成像系统中。在软件中，选择代表所有孔中 3 型分泌系统效应蛋白 YopE 的条带。
将参考 YopE 条带设置为适当的样品。导出所有 YopE 条带的软件计算的相对定量值。然后，选择所有孔中的所有 BSA 条带。
确保参比 BSA 波段与参比 YopE 波段的样品匹配。导出所有 BSA 波段的相对定量值。将每个条件的 YopE 值除以 BSA 值，以产生标准化结果。
银染 SDS-PAGE 凝胶显示，在厌氧样品中，与高铁样品相比，低铁样品中的 YopE 多 38 倍。在需氧样品中，这些蛋白质的分泌量几乎相似。
概述
这项研究探讨了人类病原体假结核耶尔森菌如何调节其毒力因子——Ⅲ型分泌系统，以响应环境线索，如铁的可用性和氧气张力。该研究突出了表达这种毒力因子的代谢负担以及其调节机制。
研究的主要组成部分
科学领域
- 微生物学
- 致病机制
- 宿主-病原体相互作用
背景
- 细菌病原体利用毒力因子来定植在宿主组织中。
- Ⅲ型分泌系统对于向宿主细胞注入效应蛋白至关重要。
- 毒力因子的表达受环境条件的调节。
- 铁的可用性和氧气张力显著影响假结核耶尔森菌中Ⅲ型分泌系统的表达。
研究目的
- 了解假结核耶尔森菌如何感知环境线索。
- 研究在不同条件下Ⅲ型分泌系统的调节。
- 探索表达毒力因子的代谢影响。
使用的方法
- 在不同铁浓度下培养假结核耶尔森菌。
- 在细菌生长过程中调整氧气张力。
- 量化Ⅲ型分泌系统的活动。
- 分析毒力因子表达的调节机制。
主要结果
- 假结核耶尔森菌根据铁和氧气水平调节其Ⅲ型分泌系统。
- Ⅲ型分泌系统的表达在代谢上成本高且受到严格控制。
- 环境线索显著影响病原体的毒力。
- 研究结果有助于理解细菌在宿主环境中的适应性。
结论
- 该研究提供了对细菌毒力因子调节机制的见解。
- 理解这些机制可以为对抗细菌感染的策略提供信息。
- 未来的研究可能探索影响毒力的其他环境因素。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of Yersinia pseudotuberculosis T3SS activity under iron starvation and anaerobic growth provides a robust framework for interrogating pathogen virulence regulation in host-relevant conditions. This approach enables mechanistic de-risking of antimicrobial targets by linking environmental cues to effector protein secretion, directly informing early-stage target validation and screening strategies. The method supports predictive confidence for antimicrobial discovery campaigns focused on T3SS inhibition.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of T3SS regulatory mechanisms in response to iron and oxygen, clarifying virulence pathway control.
- Supports functional target validation by quantifying effector secretion under defined environmental conditions.
- Facilitates mechanistic de-risking for T3SS as an antimicrobial target.
- Provides a platform for hypothesis-driven evaluation of virulence factor modulation.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized protocols for inducing and quantifying T3SS activity in vitro.
- Enables reproducible measurement of secreted effector proteins using SDS-PAGE and silver staining.
- Supports assay readiness for compound screening targeting T3SS function.
- Allows normalization and quantitative comparison across experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro conditions with host-relevant iron and oxygen environments encountered during infection.
- Facilitates translational continuity by modeling pathogen adaptation to mammalian tissue niches.
- Enables risk-adjusted advancement of T3SS-targeted candidates based on functional readouts.
- Provides a framework adaptable to other pathogens with robust iron uptake systems.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies through assay development and preclinical validation for anti-virulence strategies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on environmental regulation of T3SS and virulence factor expression.
- Screening: Provides quantitative, reproducible readouts for effector secretion under defined conditions.
- Analytics: Enables normalization and statistical comparison of protein secretion across iron and oxygen gradients.
- Translational Research: Models pathogen behavior in host-like environments, informing preclinical candidate selection.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable protocol for evaluating T3SS activity in diverse Gram-negative pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in T3SS as a drug target by linking environmental cues to functional output.
- Operational Value: Standardizes effector quantification and assay conditions for cross-study comparability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for T3SS-targeted programs by providing robust, quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of anti-virulence candidates based on mechanistic evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial culturing under controlled iron and oxygen conditions.
- Needs access to acid-washed glassware, chelated media, and protein quantification infrastructure.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and quantification protocols.
- Adaptable to other pathogens with similar iron uptake systems, pending optimization.
- Dependent on accurate normalization and statistical analysis of effector protein outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:06
Yersinia pseudotuberculosis Culture Under Varying Oxygen Tension and Iron Levels
4:51
Trichloroacetic Acid Precipitation of T3SS Effector Proteins from Yersinia pseudotuberculosis Culture
7:19
Relative Quantification of T3SS Activity in Yersinia pseudotuberculosis Cultured in Varying Iron Levels and Oxygen Tension
8:14
Representative Results
