量化铁饥饿和厌氧生长后 Yersinia pseudotuberculosis Ⅲ型分泌系统活性

细菌病原体利用毒力因子在宿主生物体内定植于不同的生态位。我们致力于研究细菌病原体如何感知宿主组织中的特定环境信号，从而调控毒力因子的表达。人类病原体 Yersinia pseudotuberculosis 利用III型分泌系统这一毒力因子将效应蛋白注入宿主细胞。

III型分泌系统使细菌能够破坏宿主的防御机制并定植于宿主组织。然而，耶尔森菌III型分泌系统的表达具有较高的代谢负担，因此其基因表达受到严格调控，以响应温度等环境信号。我们之前的研究表明，耶尔森菌III型分泌系统的表达通过一种名为ISCR的转录因子，受到铁可用性和氧张力的调控。

这些发现具有重要意义，因为耶尔森菌定植的宿主组织在铁含量和氧张力方面各不相同。例如，肠道腔内含有足以支持耶尔森菌生长的铁，但氧张力较低；相反，血液等组织中铁的可利用性极低，但氧张力较高。

我们的方法允许在铁和氧含量不同的培养条件下培养耶尔森菌，以研究这些环境信号如何影响III型分泌系统的表达。该方法将有助于我们确定铁和氧的可利用性调控III型分泌系统表达的分子机制，并帮助我们理解这种调控如何影响耶尔森菌感染的结果。首先，将假结核耶尔森菌划线接种于LB琼脂平板上。

将培养皿在室温下孵育48小时。待可见菌落形成后，挑取单个分离菌落接种至4毫升M9培养基中。在26摄氏度、250 RPM振荡条件下过夜培养。

将含有培养物的比色皿放入分光光度计中，然后用14毫升无铁补充的无菌螯合M9培养基稀释培养物，使OD600值达到0.1。将烧瓶置于26°C摇床中，培养8小时。培养完成后，用该培养物接种三个新鲜培养物：两个用于厌氧生长，一个用于需氧生长。

进行有氧培养时，将培养物用14毫升无铁补充的无菌螯合M9培养基稀释至OD600值为0.1，随后在26摄氏度条件下振荡培养12小时。进行厌氧培养时，将培养物用14毫升无菌螯合M9培养基分别稀释至两支经酸洗处理的玻璃试管中。

在第一个试管中，加入经滤膜除菌的硫酸亚铁，使其终浓度为每升1毫克。在第二个试管中，加入硫酸亚铁，使其终浓度为每升0.01毫克。将两个试管置于厌氧培养箱中，室温下孵育12小时。

然后，通过将厌氧培养物转移至37摄氏度以诱导III型分泌系统活性，并继续培养4小时。接着，向两个经酸洗处理的锥形瓶中各加入14毫升螯合M9培养基，将好氧培养物稀释至OD600值为0.2。向锥形瓶中加入硫酸亚铁，使其达到所需的终浓度。

将两个烧瓶在26摄氏度、250 RPM条件下有氧培养两小时。两小时后，将培养物转移至37摄氏度、250 RPM条件下继续有氧培养四小时，以诱导III型分泌系统的活性。在诱导假结核耶尔森菌（Yersinia pseudotuberculosis）的III型分泌系统后，将经过归一化处理的培养物体积转移至15毫升离心管中。

每管中加入 4 µL 牛血清白蛋白作为蛋白质沉淀对照。在 4 °C 条件下，以 3,200 ×g 离心 15 分钟，收集菌液。使用连接在注射器上的 0.22 µm PVDF 滤膜将上清液过滤至新的 15 mL 离心管中。

然后，加入相当于上清液体积10%的三氯乙酸。将试管剧烈涡旋振荡一分钟。在4°C的冷室中将试管置于冰上过夜孵育。

接下来，将每种样品各2毫升加入一个2毫升离心管中，然后在4°C下以21,000 G离心15分钟。使用真空装置吸除上清液。重复向同一管中移取2毫升样品，离心并吸除上清液的操作。

将沉淀反应合并至一个2毫升离心管中。用1毫升预冷的100%丙酮洗涤沉淀，随后离心并吸除上清液。最后一次去除上清液后，在室温下干燥沉淀1小时。

沉淀的蛋白质应呈现为沿管壁的雾状物。然后，将每个沉淀物重悬于50 µL F-S-B-DTT溶液中。充分涡旋振荡1分钟。

接下来，将样品置于95摄氏度的加热块上煮沸15分钟。然后在室温下以最大速度短暂离心。将每种厌氧样品各15微升和每种需氧样品各10微升上样至12.5% SDS-PAGE凝胶中进行分析。

凝胶电泳完成后，使用银染法对凝胶上的蛋白质进行显色观察。首先，将含有分离好的假结核耶尔森菌需氧样品的SDS-PAGE凝胶放入成像系统中。在软件中，选择所有加样孔中代表III型分泌系统效应蛋白YopE的条带。

将参考YopE条带设置为适当的样品。导出软件计算的所有YopE条带的相对定量值。然后，选择所有孔中的全部BSA条带。

确保参考BSA条带与参考YopE条带的样品一致。导出所有BSA条带的相对定量值。将每种条件下的YopE值除以相应的BSA值，以获得标准化结果。

银染SDS-PAGE凝胶显示，在厌氧样品中，低铁样品中的YopE含量比高铁样品高出38倍。在需氧样品中，这些蛋白质的分泌量几乎相近。