Name: 揭示髓母细胞瘤的铁死亡表型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-15T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 1 s
Description: 探索髓母细胞瘤的铁死亡表型，通过单细胞基因组学和流式细胞术分析脂质过氧化物含量，揭示治疗耐药细胞群体的遗传背景，为开发更有效、更安全的儿童癌症治疗策略提供新思路。

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本工作得到了摩纳哥公国政府、“摩纳哥企业抗癌联盟”（GEMLUC）以及弗拉维安基金会的支持，后者为购买BD FACS Melody提供了资金支持。

本研究采用DAOY野生型（WT）髓母细胞瘤细胞系进行，细胞在37 °C、5% CO₂条件下培养2 在添加了8% FBS的DMEM培养基中培养。xCT基因敲除细胞系在相同条件下维持培养，实验所用培养基中额外添加1 mM N-乙酰半胱氨酸（NAC）。细胞定期使用 commercially available Mycoplasma Detection Kit（见 材料表）并培养至第10代th 传代
1. 细胞的收获与接种
注意：所有步骤均在组织培养超净工作台中使用无菌无菌技术进行。DAOY 髓母细胞瘤细胞为贴壁细胞，因此可通过不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤弃去所有未贴壁细胞。
<ol>
	<li>取含有细胞的储备培养皿（直径100 mm的培养皿），使用移液器去除培养皿中的悬浮细胞和培养基。</li>
	<li>向培养皿中加入5–10 mL磷酸盐缓冲液（PBS），通过旋转培养皿清洗底部，然后使用移液器将PBS从培养皿中移除。</li>
	<li>向培养皿中加入1 mL胰蛋白酶（10倍稀释），将培养皿孵育至轻敲培养皿可使细胞脱落。取10 mL添加了8%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基，通过机械方式将细胞从培养皿上收集下来。</li>
	<li>将细胞悬液转移至15 mL离心管中。</li>
	<li>取500 µL细胞悬液放入比色皿中进行细胞计数，测定每毫升细胞悬液中的细胞数量。本研究使用自动细胞计数仪进行计数（见材料表）。</li>
	<li>计算从细胞悬液中获取100,000个细胞所需的体积。</li>
	<li>取一个6孔板，将计算好的细胞悬液体积加入每个孔中，然后向每孔加入含8% FBS的DMEM培养基，使总体积达到2 mL。</li>
</ol>
2. 细胞处理
注意：对照组和处理组均设置三个重复。分组如下：对照组（DMSO）、1 µM erastin、0.3 µM RSL3、250 µM FAC、2 µM Ferrostatin 1、1 µM erastin + 2 µM Ferrostatin 1、0.3 µM RSL3 + 2 µM Ferrostatin 1、250 µM FAC + 2 µM Ferrostatin 1。本实验需要四个6孔板，如表1所示。所有必需试剂的商业信息列于材料表中。
<ol>
	<li>接种后24小时，向含有细胞的孔中加入相应的处理试剂。</li>
	<li>将培养皿置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育。</li>
</ol>
3. 使用 BODIPY 581/591 C11 探针染色检测处理后细胞中的脂质氢过氧化物
注意：脂质氢过氧化物特异性探针的储存液用DMSO配制，浓度为1 mM。将储存液分装后，置于-20 °C避光管中保存。染色时，将探针用含8% FBS的DMEM培养基稀释成2 µM的工作液。
<ol>
	<li>处理后6小时，在光学显微镜下观察细胞（应可见细胞变圆）。</li>
	<li>将培养皿从培养箱中取出，置于组织培养超净工作台中。 
	使用移液器吸除培养基及悬浮（死亡）细胞。</li>
	<li>每孔轻轻加入2 mL PBS，通过旋转6孔板的方式清洗孔底，然后使用移液器吸除孔中的PBS。</li>
	<li>每孔加入2 mL探针工作液（终浓度为2 µM，溶于添加FBS的DMEM中）。</li>
	<li>将培养皿置于37 °C、5% CO2培养箱中避光孵育30分钟（可用铝箔包裹培养板）。</li>
</ol>
4. 流式细胞术分析处理细胞中的脂质氢过氧化物含量
注意：以下所有步骤均在黑暗中进行（超净工作台内不开启灯光）。
<ol>
	<li>从培养箱中取出培养皿，放入组织培养用超净工作台中。 
	使用移液器吸除染色液。</li>
	<li>向每个孔中轻柔加入 2 mL PBS，通过旋转 6 孔板清洗孔底，然后使用移液器吸除孔中的 PBS。</li>
	<li>重复洗涤步骤一次，并使用移液器吸除孔中残留的 PBS。</li>
	<li>在每个孔底部加入 150 µL 商业化的细胞解离试剂（参见 材料表），将培养板孵育至轻敲培养板可使细胞脱落。取 250 µL FACS 缓冲液（PBS，2 mM EDTA，0.5% BSA），通过机械方式将细胞从孔中收集。</li>
	<li>将细胞转移至相应（预先标记）的带滤帽 FACS 管中。将装有细胞的管置于冰上避光保存，直至进行分析（染色后应在一小时内完成分析）。 
	注意：FACS 仪器的设置和校准取决于所使用的仪器型号（参见 材料表）。</li>
	<li>创建新实验并命名（例如：DAOY 细胞中的铁死亡——脂质氢过氧化物）。</li>
	<li>在 实验设计 中，选择 激光器（488 nm） 和 滤光片（FITC）。</li>
	<li>在 查看数据 界面中，选择合适的 细胞大小（&#62;12 µm），设置 PMT 电压（细胞群应出现在 SSC-H/FSC-H 散点图的第一象限），并对散点图进行设门。</li>
	<li>添加新的图表——直方图，Y 轴为 FITC-A，采用对数刻度。</li>
	<li>将 FACS 管中的样品涡旋混匀，放入 FACS 仪器中并加载样品。记录 10,000 个 FSC 单细胞事件，并为文件命名（例如：DAOY WT CTL 6h）。将文件导出为 .fcs 格式。</li>
</ol>
5. 处理后对死亡细胞进行碘化丙啶（PI）染色
注意：实验设计与脂质氢过氧化物测定完全相同（见步骤1和步骤2）。
<ol>
	<li>接种后24小时，将培养皿从培养箱中取出，并置于超净台内。</li>
	<li>收集培养基（含死亡细胞）至15 mL离心管中。</li>
	<li>向每个孔中加入1 mL PBS，通过6孔板的圆形移动清洗孔底，然后将PBS收集至对应含有培养基的离心管中。</li>
	<li>在每个孔底部加入200 µL胰蛋白酶（10倍稀释），孵育培养板直至轻敲培养板可使细胞脱落。使用相应的培养基加PBS将细胞从孔中收集下来。</li>
	<li>将细胞悬液在室温下以180 × g 离心10分钟。用抽吸装置去除上清液。</li>
	<li>用300 µL FACS缓冲液重悬细胞沉淀，并置于冰上直至进行分析。</li>
	<li>分析前立即加入PI溶液（见材料表），使其终浓度为2 µg/mL。</li>
</ol>
6. 处理后24小时死细胞的流式细胞术分析
注意：FACS 仪器的设置和校准按先前所述进行（见步骤 4）。
<ol>
	<li>创建一个新实验并为其命名（例如：DAOY细胞中的铁死亡）。</li>
	<li>在实验设计中，选择激光（488 nm）和滤光片（PE）。</li>
	<li>在查看数据时，选择合适的细胞大小（&#62;12 µm），设置光电倍增管电压（细胞群应出现在SSC-H/FSC-H散点图的第一象限），并对散点图进行设门。</li>
	<li>添加一个新的直方图，以PE-A为纵坐标，采用对数刻度。</li>
	<li>将FACS管中的样品涡旋混匀，放入FACS仪器中并加载样品。</li>
	<li>记录10,000个FSC单细胞事件，并为文件命名（例如：DAOY WT CTL 6h），将文件导出为.fcs格式。</li>
</ol>
7. DAOY xCT-/- 细胞中脂质氢过氧化物含量的流式细胞术分析
注意：xCT-/- 细胞的构建方法此前已有描述24。
<ol>
	<li>本实验中，按步骤2所述接种细胞，但不进行处理，而是于培养基中补充1 mM NAC，过夜培养。</li>
	<li>次日，一组继续保留NAC，另一组则去除NAC。</li>
	<li>按照步骤6中所述完全相同的方法，进行脂质氢过氧化物含量的流式细胞术分析。</li>
</ol>
8. 流式细胞仪结果的分析
<ol>
	<li>在 FlowJo 软件中打开 .fcs 文件（参见材料表）。</li>
	<li>双击单个文件以打开该样本中记录的所有事件（不仅限于 FCS 单细胞事件）（SSC-A/FSC-A 点图）。由于设置原因，仪器上已有的设门未被保留，因此需要重新设门并命名该细胞群（例如，DAOY WT）。</li>
	<li>双击设门后的细胞群，以打开包含直方图的新窗口。</li>
	<li>将 Y 轴更改为所用的荧光滤光片（Comp-FITC/PE-A）。</li>
	<li>将 X 轴更改为众数模式（将每个峰归一化至其众数，即特定区间内细胞最大数量的百分比）。</li>
	<li>将直方图复制到布局编辑器中。对所有样本重复此操作，每次在布局编辑器中粘贴新的直方图时，将其拖动至前一个直方图上方，使直方图叠加显示（半偏移）。</li>
</ol>

FACS Analysis of Lipid Hydroperoxides in Ferroptotic Medulloblastoma Cells

<ol><li>Dixon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferroptosis%3A+An+iron-dependent+form+of+nonapoptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ferroptosis: An iron-dependent form of nonapoptotic cell death.</a> Cell. 149, 1060-1072 (2012).</li>
<li>Yang, W. S., Stockwell, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+lethal+screening+identifies+compounds+activating+iron-dependent%2C+nonapoptotic+cell+death+in+oncogenic-ras-harboring+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic lethal screening identifies compounds activating iron-dependent, nonapoptotic cell death in oncogenic-ras-harboring cancer cells.</a> Chem Biol. 15 (30), 234-245 (2008).</li>
<li>Yang, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ferroptotic+cancer+cell+death+by+GPX4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4.</a> Cell. 156, 317-331 (2014).</li>
<li>Meister, A., Anderson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Glutathione.</a> Annu Rev Biochem. 52, 711-760 (1983).</li>
<li>Lewerenzm, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cystine%2Fglutamate+antiporter+system+xc-+in+health+and+disease%3A+From+molecular+mechanisms+to+novel+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">The cystine/glutamate antiporter system xc- in health and disease: From molecular mechanisms to novel therapeutic opportunities.</a> Antioxid Redox Signal. 18 (5), 522-555 (2013).</li>
<li>Yang, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ferroptotic+cancer+cell+death+by+GPX4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4.</a> Cell. 156, 317-331 (2014).</li>
<li>Bersuker, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CoQ+oxidoreductase+FSP1+acts+parallel+to+GPX4+to+inhibit+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CoQ oxidoreductase FSP1 acts parallel to GPX4 to inhibit ferroptosis.</a> Nature. 575, 688-692 (2019).</li>
<li>Doll, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FSP1+is+a+glutathione-independent+ferroptosis+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">FSP1 is a glutathione-independent ferroptosis suppressor.</a> Nature. 575, 693-698 (2019).</li>
<li>Hu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+GCH1%2FBH4+axis+activates+ferritinophagy+to+mitigate+the+resistance+of+colorectal+cancer+to+erastin-induced+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Blockade of GCH1/BH4 axis activates ferritinophagy to mitigate the resistance of colorectal cancer to erastin-induced ferroptosis.</a> Front Cell Dev Biol. 10, (2022).</li>
<li>Lei, G., Zhuang, L., Gan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+ferroptosis+as+a+vulnerability+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting ferroptosis as a vulnerability in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 22, 381-396 (2022).</li>
<li>Viswanathan, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependency+of+a+therapy-resistant+state+of+cancer+cells+on+a+lipid+peroxidase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dependency of a therapy-resistant state of cancer cells on a lipid peroxidase pathway.</a> Nature. 547, 453-457 (2017).</li>
<li>Lee, J., You, J. H., Kim, M. S., Roh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+reprogramming+of+epithelial-mesenchymal+transition+promotes+ferroptosis+of+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Epigenetic reprogramming of epithelial-mesenchymal transition promotes ferroptosis of head and neck cancer.</a> Redox Biol. 37, 101697(2020).</li>
<li>Hangauer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-tolerant+persister+cancer+cells+are+vulnerable+to+GPX4+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drug-tolerant persister cancer cells are vulnerable to GPX4 inhibition.</a> Nature. 551, 247-250 (2017).</li>
<li>Zhang Tuo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombin+induces+ACSL4-dependent+ferroptosis+during+cerebral+ischemia%2Freperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Thrombin induces ACSL4-dependent ferroptosis during cerebral ischemia/reperfusion.</a> Signal Transduct Target Ther. 7, 59(2022).</li>
<li>Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+ferroptosis+and+emerging+links+to+the+pathology+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of ferroptosis and emerging links to the pathology of neurodegenerative diseases.</a> Front Aging Neurosci. 14, (2022).</li>
<li>Zhuo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+ferroptosis+in+glioblastoma%3A+Therapeutic+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Emerging role of ferroptosis in glioblastoma: Therapeutic opportunities and challenges.</a> Front Mol Biosci. 9, (2022).</li>
<li>Bisaro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+extracellular+vesicles+from+medullospheres+reveals+a+role+for+iron+in+the+cancer+progression+of+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Ther%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of extracellular vesicles from medullospheres reveals a role for iron in the cancer progression of medulloblastoma.</a> Mol Cell Ther. 3, 8(2015).</li>
<li>Schonberg, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+iron+trafficking+characterizes+glioblastoma+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Preferential iron trafficking characterizes glioblastoma stem-like cells.</a> Cancer Cell. 28 (4), 441-455 (2015).</li>
<li>Werbowetski-Ogilvie, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+sorting+to+sequencing+in+the+molecular+era%3A+the+evolution+of+the+cancer+stem+cell+model+in+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">From sorting to sequencing in the molecular era: the evolution of the cancer stem cell model in medulloblastoma.</a> FEBS J. 289 (7), 1765-1778 (2022).</li>
<li>Dixon, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+inhibition+of+cystine-glutamate+exchange+induces+endoplasmic+reticulum+stress+and+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Pharmacological inhibition of cystine-glutamate exchange induces endoplasmic reticulum stress and ferroptosis.</a> Elife. 3, e02523(2014).</li>
<li>Bauckman, K. A., Haller, E., Flores, I., Nanjundan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+modulates+cell+survival+in+a+Ras-+and+MAPK-dependent+manner+in+ovarian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Iron modulates cell survival in a Ras- and MAPK-dependent manner in ovarian cells.</a> Cell Death Dis. 4, e592(2013).</li>
<li>Drummen, G. P. C., Van Liebergen, L. C., Op den Kamp, J. A. F., Post, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C11-BODIPY581%2F591%2C+an+oxidation-sensitive+fluorescent+lipid+peroxidation+probe%3A+%28Micro%29spectroscopic+characterization+and+validation+of+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">C11-BODIPY581/591, an oxidation-sensitive fluorescent lipid peroxidation probe: (Micro)spectroscopic characterization and validation of methodology.</a> Free Radic Biol Med. 33 (4), 473-490 (2002).</li>
<li>Miotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+mechanism+of+ferroptosis+inhibition+by+ferrostatin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Insight into the mechanism of ferroptosis inhibition by ferrostatin-1.</a> Redox Biol. 28, 101328(2020).</li>
<li>Daher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+ablation+of+the+cystine+transporter+xCT+in+PDAC+cells+inhibits+mTORC1%2C+growth%2C+survival%2C+and+tumor+formation+via+nutrient+and+oxidative+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic ablation of the cystine transporter xCT in PDAC cells inhibits mTORC1, growth, survival, and tumor formation via nutrient and oxidative stresses.</a> Cancer Res. 79 (15), 3877-3890 (2019).</li>
<li>Shimada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+survey+of+cell+death+mechanisms+reveals+metabolic+regulation+of+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Global survey of cell death mechanisms reveals metabolic regulation of ferroptosis.</a> Nat Chem Biol. 12, 497-503 (2016).</li>
<li>Yang, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxidation+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+lipoxygenases+drives+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Peroxidation of polyunsaturated fatty acids by lipoxygenases drives ferroptosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), E4966-E4975 (2016).</li>
<li>Gaschler, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FINO2+initiates+ferroptosis+through+GPX4+inactivation+and+iron+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">FINO2 initiates ferroptosis through GPX4 inactivation and iron oxidation.</a> Nat Chem Biol. 14, 507-515 (2018).</li>
<li>Bogacz, M., Krauth-Siegel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tryparedoxin+peroxidase-deficiency+commits+trypanosomes+to+ferroptosis-type+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Tryparedoxin peroxidase-deficiency commits trypanosomes to ferroptosis-type cell death.</a> Elife. 7, e37503(2018).</li>
<li>Cheloni, G., Slaveykova, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+C11-BODIPY581%2F591+dye+for+the+determination+of+lipid+oxidation+in+Chlamydomonas+reinhardtii+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytom+Part+A%22%5BJournal%5D)">Optimization of the C11-BODIPY581/591 dye for the determination of lipid oxidation in Chlamydomonas reinhardtii by flow cytometry.</a> Cytom Part A. 83 (10), 952-961 (2013).</li>
<li>Itoh, N., Cao, J., Chen, Z. H., Yoshida, Y., Niki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+limitation+of+BODIPY+as+a+probe+for+the+evaluation+of+lipid+peroxidation+and+its+inhibition+by+antioxidants+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Advantages and limitation of BODIPY as a probe for the evaluation of lipid peroxidation and its inhibition by antioxidants in plasma.</a> Bioorganic Med Chem Lett. 17 (7), 2059-2063 (2007).</li>
<li>Sato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ferroptosis+inducer+erastin+irreversibly+inhibits+system+xc%E2%88%92+and+synergizes+with+cisplatin+to+increase+cisplatin%27s+cytotoxicity+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The ferroptosis inducer erastin irreversibly inhibits system xc− and synergizes with cisplatin to increase cisplatin's cytotoxicity in cancer cells.</a> Sci Rep. 8, 968(2018).</li>
<li>Cheff, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ferroptosis+inducing+compounds+RSL3+and+ML162+are+not+direct+inhibitors+of+GPX4+but+of+TXNRD1%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">The ferroptosis inducing compounds RSL3 and ML162 are not direct inhibitors of GPX4 but of TXNRD1.</a> Redox Biol. 62, 102703(2023).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+degradation+mechanism+of+GPX4+degrader+in+induction+of+ferroptosis+exerting+anti-resistant+tumor+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Dual degradation mechanism of GPX4 degrader in induction of ferroptosis exerting anti-resistant tumor effect.</a> Eur J Med Chem. 247, 115072(2023).</li>
<li>Vucetic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Together+we+stand%2C+apart+we+fall%3A+how+cell-to-cell+contact%2Finterplay+provides+resistance+to+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Together we stand, apart we fall: how cell-to-cell contact/interplay provides resistance to ferroptosis.</a> Cell Death Dis. 11, 789(2020).</li>
<li>Meira, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cystine-cysteine+intercellular+shuttle+prevents+ferroptosis+in+xctko+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A cystine-cysteine intercellular shuttle prevents ferroptosis in xctko pancreatic ductal adenocarcinoma cells.</a> Cancers (Basel). 13 (6), 1434(2021).</li>
</ol>

我们声明，本研究不存在利益冲突。

铁死亡（ferroptosis）的主要特征是细胞质膜中脂质氢过氧化物不受控制地累积。这种氧化损伤可能以酶促或非酶促的方式发生，但无论哪种情况，该反应都依赖于铁或由铁催化，这也是这种细胞死亡类型名称的由来。脂质氢过氧化作用通常通过检测其降解产物（如4-羟基-2,3-反式壬烯醛（4-HNE）或丙二醛（MDA））进行间接评估。这些产物由多不饱和脂肪酸的过氧化分解产生，可与多种大分子发生反应，导致多种病理状态，例如神经退行性疾病、糖尿病和慢性心力衰竭等。然而，这些仅仅是脂质过氧化事件的后果，目前已有大量研究致力于开发特异性针对脂质氢过氧化物的优良探针。
一种常用的探针是BODIPY 581/591 C11，但它也存在一些缺点，需加以考虑。具体而言，BODIPY 591/581的荧光颜色具有两个发射峰，分别对应其还原态（590 nm）和氧化态（510 nm）。若目标是实现精确定量，则这两个波长处荧光强度的比值尤为重要。然而，在已有文献中，BODIPY 591/581单发射荧光强度的测量已被广泛采用1,25,26,27,28，尤其是因为在510 nm处还原态的红色荧光强度常被氧化分子荧光的溢出信号所掩盖22,29。这正是BODIPY 591/581的荧光通常以单波长（绿色）荧光强度作为函数进行定性表征的主要原因之一。
该探针的另一个重要局限性是其荧光发射会以浓度依赖性方式被抗氧化剂抑制30。因此，染色应在不含抗氧化剂添加物的培养基中进行。在本实验方案中使用了强效脂质过氧化物清除剂ferrostatin 1；然而，在加入探针前，需去除ferrostatin 1，并用PBS洗涤细胞，以确保探针不受其抗氧化活性的影响。
关于铁死亡的诱导，可使用多种市售药物。此处采用了erastin，一种xCT转运蛋白的不可逆抑制剂31。由于其与转运蛋白共价结合，因此即使使用较高浓度（最高达100 µM）也仅需较短作用时间（5分钟），随后进行洗涤步骤31。为了评估xCT完全抑制后铁死亡的确切动力学过程，在无NAC条件下使用了xCT-/-细胞。接种后6小时即可检测到脂质氢过氧化物的大量累积，24小时后几乎无法检测到存活细胞。至于RSL3，其为纳摩尔浓度范围内高效诱导铁死亡的化合物，其动力学特征与xCT-/-细胞中观察到的相似。RSL3的作用机制仍存在较大争议，但似乎并不影响GPx4酶的活性，而是诱导该酶的降解32,33。
体外诱导铁死亡的一个重要方面是细胞汇合度。长期以来观察到，汇合的细胞层对半胱氨酸饥饿、xCT或GPx4抑制、谷胱甘肽（GSH）耗竭等情况具有更强的抗性34。主要原因在于物理接触（即细胞汇合）会激活Hippo信号通路，进而下调代谢活性以及细胞内活性氧（ROS）的生成。此外，还原型半胱氨酸的转运也可能有助于在xCT不完全抑制的情况下产生抗性35。在本研究中，每孔（6孔板）接种100,000个细胞，以维持较低的汇合度，并适用于体积较大且形态扁平的细胞。然而，对于体积较小且呈圆形的细胞（如HD-MB03），每孔（6孔板）接种数量可增加至150,000–200,000个细胞。
本研究的最后一个局限性在于采用碘化丙啶（PI）方法检测细胞死亡。该方法易于使用，可检测任何类型的细胞死亡，通过使用铁死亡特异性抑制剂（如ferrostatin-1），可将铁死亡与其他类型的细胞死亡区分开来。PI染色的原理是基于死亡细胞丧失细胞膜完整性，从而使PI进入细胞，插入DNA碱基之间并发出荧光信号。然而值得注意的是，脂质氢过氧化会引发细胞膜&#34;渗漏&#34;，导致PI在细胞真正死亡之前即可进入细胞。因此，仅依靠该方法来评估铁死亡的动力学过程具有挑战性。

铁死亡是一种新近被定义的、依赖活性氧（ROS）的细胞死亡类型1。除了ROS之外，铁在此类细胞死亡中也发挥着关键作用，因此得名2。铁死亡的最终执行步骤是由铁催化的质膜脂质氧化损伤的累积，最终导致膜完整性与选择性通透性受损，并通过出泡方式引发细胞死亡。脂质过氧化物的生成是一种自然发生的现象；然而，其在细胞膜中的传播通常被细胞的抗氧化防御系统所抑制。在这一过程中起主要作用的是含硒蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4（GPx4），它能够靠近膜结构并将脂质氢过氧化物转化为毒性较低的醇类衍生物3。GPx4所需的还原力主要（但不仅限于）由谷胱甘肽（GSH）提供，GSH是由三种非必需氨基酸——甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸组成的三肽。半胱氨酸是GSH生物合成的限速氨基酸4。尽管半胱氨酸被归类为非必需氨基酸，但在高度增殖的细胞（如癌细胞）中，其需求量往往超过细胞内源性合成能力，因此已被重新归类为条件必需氨基酸。细胞摄取半胱氨酸主要通过Xc-系统完成，该系统以胞内谷氨酸外排为代价，实现氧化态（主要存在形式）半胱氨酸（即胱氨酸）的摄入5。Xc-系统由一个不依赖Na+、依赖Cl-的转运亚基xCT和一个伴侣亚基CD98组成。直到最近，xCT-GSH-GPx4轴的抗铁死亡功能一直被认为具有独特性和不可替代性6。然而，2019年发现了一条替代性的抗铁死亡通路，由辅酶Q10（泛醇）及其再生酶——铁死亡抑制蛋白1（FSP1）构成7,8。不久之后，又报道了另一条涉及GTP环化水解酶1/四氢生物蝶呤（GCH1/BH4）的脂质氢过氧化物解毒系统9。尽管如此，xCT-GSH-GPx4轴在抑制铁死亡中的核心地位似乎仍未受到挑战。
在过去十年中，铁死亡（ferroptosis）已在多种肿瘤类型中得到广泛研究，展现出作为抗癌策略的巨大潜力（Lei 等人综述10）。此外，已有研究报道，对传统化疗药物具有高度耐药性或易于转移的癌细胞，出乎意料地对铁死亡诱导剂（如 GPx4 抑制剂）高度敏感11,12,13。然而，在脑肿瘤背景下，铁死亡诱导剂的潜力仍远未得到充分研究。尽管这种细胞死亡方式与脑缺血-再灌注损伤14及神经退行性疾病15密切相关，其在脑肿瘤中的研究主要局限于胶质母细胞瘤——最常见的恶性颅脑肿瘤（Zhuo 等人综述16）。另一方面，髓母细胞瘤——最常见的儿童恶性脑肿瘤，也是儿童死亡的主要原因之一——对铁死亡诱导剂的敏感性仍基本未被探索。据我们所知，目前将铁死亡与髓母细胞瘤关联的同行评审文献极为稀少。尽管如此，一些研究已表明，铁在髓母细胞瘤和胶质母细胞瘤的肿瘤干细胞（CSCs）的存活、增殖及致瘤潜能中发挥关键作用17,18，这可能使其更易受到铁死亡诱导的影响。这一点尤为重要，因为髓母细胞瘤以其CSC亚群（即肿瘤起始/传播细胞）而著称，这些细胞似乎在肿瘤的化疗耐药性、播散和复发中起主要作用19。
通常通过检测脂质氢过氧化物的含量或积累情况来研究细胞对铁死亡诱导的敏感性，这种积累可能导致细胞死亡，也可能不会。最常用的铁死亡诱导剂包括：(1) erastin，一种xCT转运蛋白抑制剂20；(2) RSL3，一种GPx4酶抑制剂2；和/或(3) 铁供体，如柠檬酸铁铵（FAC）21。脂质氢过氧化物的含量可通过特异性探针BODIPY 581/591 C11进行评估22，该探针在还原状态下激发和发射波长最大值分别为581 nm和591 nm。当探针与脂质氢过氧化物发生相互作用并被其氧化后，其激发和发射波长最大值会转移至488 nm和510 nm。通常情况下，脂质氢过氧化物含量的显著增加先于铁死亡性细胞死亡的发生。由于铁死亡不属于程序性细胞死亡，因此不存在导致其执行的分子信号级联反应。因此，确认铁死亡的唯一方法是监测脂质氢过氧化物的含量，并使用针对此类细胞死亡的特异性抑制剂，例如ferrostatin 123。Ferrostatin 1是一种脂溶性抗氧化剂，能够穿透细胞的脂质区域，清除脂质氢过氧化物，从而阻止铁死亡事件的发生。

<table><tbody><tr><td>BODIPY 581/591 C11</td><td>Thermo Fisher</td><td>D3861</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数仪</td><td>Beckman</td><td>Coulter Z1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培养基&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10569010</td><td></td></tr><tr><td>Erastin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7781-5MG</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸铁铵</td><td>Acros Organics</td><td>211842500</td><td></td></tr><tr><td>铁死亡抑制剂-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0583-25MG</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>Dominique Dutcher</td><td>500105N1N</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Melody</td><td></td></tr><tr><td>Gibco StemPro Accutase 细胞解离试剂</td><td>Thermo Fisher</td><td>11599686</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7250</td><td></td></tr><tr><td>PlasmoTest 支原体检测试剂盒</td><td>InvivoGen</td><td>rep-pt1</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Invitrogen</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>RSL3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML2234-25MG</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶 - EDTA 10X - 100 mL</td><td>Dominique Dutcher</td><td>X0930-100</td><td></td></tr></tbody></table>

揭示髓母细胞瘤的铁死亡表型

Revealing the Ferroptotic Phenotype of Medulloblastoma

铁与氧的相互作用是地球生命演化过程中的一个基本组成部分。然而，这种独特的化学反应至今仍令人着迷并带来诸多谜题，推动着新的生物学探索。2012年，哥伦比亚大学的一个研究团队认识到这一相互作用是导致一种新型调控性细胞死亡的关键事件，并将其命名为&#34;铁死亡（ferroptosis）&#34;。铁死亡的主要特征是脂质氢过氧化物的累积，其原因包括：(1) 抗氧化防御系统功能障碍和/或 (2) 过度的氧化应激，后者通常伴随着细胞内游离可溶性铁含量的升高。这一过程通常由经典的抗铁死亡通路加以抑制，该通路包括胱氨酸转运体xCT、谷胱甘肽（GSH）以及谷胱甘肽过氧化物酶4（GPx4）。由于铁死亡并非程序性细胞死亡类型，因此不涉及凋亡所特有的信号通路。验证此类细胞死亡最常用的方法是使用亲脂性抗氧化剂（如维生素E、ferrostatin-1等）进行抑制。这些分子能够进入细胞膜并清除其中的氧化损伤。揭示铁死亡表型的另一个重要方面是检测脂质氢过氧化物的前期累积，为此可使用特异性染料BODIPY C11。本文将展示如何通过不同诱导剂——erastin、RSL3和铁供体——在野生型髓母细胞瘤细胞中诱导铁死亡。同样，将在含有NAC条件下生长的xCT基因敲除（xCT-KO）细胞中进行实验，当去除NAC后，这些细胞会发生铁死亡。在铁死亡触发后12–16小时内，可在光学显微镜下观察到典型的&#34;起泡&#34;表型。此外，将采用BODIPY C11染色结合流式细胞术（FACS）分析，以显示脂质氢过氧化物的累积，并利用碘化丙啶（PI）染色法检测随之发生的细胞死亡。为证实细胞死亡的铁死亡性质，将使用ferrostatin-1作为特异性的铁死亡抑制剂进行验证。

将髓母细胞瘤细胞系 DAOY 在含 8% FBS 的标准 DMEM 培养基中培养，直至细胞融合度达到约 60%。实验当天，收集细胞，并根据表 1将每孔 100,000 个细胞接种于 6 孔板中。次日，细胞（设三个重复）分别用 1 µM 的 erastin、0.3 µM 的 RSL3 或 250 µM 的 FAC 处理。随后将培养板置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中。处理 6 小时后，在显微镜下观察细胞，检测出现气泡的细胞（如图 1中箭头所示）。该现象表明药物在细胞进行脂质氢过氧化物染色及后续流式细胞术分析前，已有效诱导了铁死亡。
为了检测脂质氢过氧化物含量，使用特异性染料 BODIPY 581/591 C11 在终浓度为 2 µM 的条件下染色 30 分钟。由于该染料对氧化还原状态敏感，因此必须去除细胞中的任何处理试剂，并用预热的 PBS 洗涤细胞。染色半小时后，细胞用 PBS 洗涤两次，随后使用细胞解离液将细胞脱离，并准备进行流式细胞术（FACS）分析。此步骤获得的数据表明，经三种药物处理的样品中染料的绿色荧光均增强（图 2）。然而，在处理 6 小时后，0.3 µM 的 RSL3 诱导的效果最为显著（图 2B），而 1 µM 的 erastin（图 2A）和 250 µM 的 FAC（图 2C）产生的效应相对较弱。
为了证实检测到的脂质过氧化氢积累导致细胞死亡，特别是铁死亡，采用与表1中所述相同的处理方法处理细胞24小时。通过流式细胞术分析死亡细胞时，同时收集细胞和上清液。将活细胞和死细胞通过离心沉淀后，重悬于FACS缓冲液中，用于后续流式细胞术分析。图3所示数据表明，三种处理均诱导了大量细胞死亡，而该过程可被铁死亡特异性抑制剂ferrostatin-1完全阻断。这明确支持在髓母细胞瘤细胞中，当xCT受到抑制、GPx4受到抑制或铁过载时，会发生铁死亡性细胞死亡。
鉴于这三种药物对脂质氢过氧化物累积的影响略有不同，可能是由于其效力存在差异，因此采用遗传学方法来研究铁死亡诱导剂的完全效力。先前获得的DAOY xCT-/-细胞（补充图1A）与其野生型（WT）细胞在相同培养基中培养，但额外添加NAC。这种正向筛选使得xCT-/-细胞能够在培养中生长。然而，在培养基中去除NAC后6小时，这些细胞开始累积脂质氢过氧化物，其水平与经RSL3处理的WT细胞相当（图4）。与药物抑制类似，在去除NAC后6小时，xCT-/-细胞表现出典型的起泡现象（补充图1B）。
<img alt="细胞活力检测，显微镜图像；铁死亡抑制剂作用比较；50 µm 比例尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66645/66645fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：髓母细胞瘤细胞的铁死亡表型。 DAOY WT 细胞经 1 µM erastin (ERA)、0.3 µM RSL3 或 250 µM 柠檬酸铁铵 (FAC) 处理（或未处理）6 小时的代表性显微图像，部分样本同时加入或未加入 2 μM 铁死亡抑制剂 Ferrostatin-1 (Ferro-1)。白色箭头指示呈圆形、“起泡”状的细胞，提示在光学显微镜下可见的铁死亡表型。放大倍数：20x，插图：40x。比例尺：50 µm，插图比例尺：10 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/66645fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="显示 ERA、RSL3、FAC 作用的流式细胞术分析；包括散点图和直方图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66645/66645fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：脂质氢过氧化物作为髓母细胞瘤细胞铁死亡的关键标志物。 髓母细胞瘤细胞经 1 µM 铁死亡诱导剂 Erastin (ERA)（A,B）、0.3 µM RSL3（C,D）或 250 µM 柠檬酸铁铵 (FAC)（E,F）处理 6 小时后，通过流式细胞术检测脂质氢过氧化物染色的代表性数据，处理过程中有或无 2 µM 铁死亡抑制剂 Ferrostatin-1 (Ferro-1)。(A,C,E) 记录事件的散点图；(B,D,F) 脂质氢过氧化物含量的直方图表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/66645fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术散点图；细胞活力分析，处理方式比较；化合物效应研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66645/66645fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：通过药理学方法诱导铁死亡。 经1 µM erastin (ERA)、0.3 µM RSL3 或 250 µM 柠檬酸铁铵 (FAC) 处理6小时后，经碘化丙啶染色的细胞的代表性流式细胞术散点图，处理过程中有或无2 µM 铁死亡抑制剂Ferrostatin-1 (Ferro-1)。设门区分活细胞（Q4）和死细胞（Q3）群体。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/66645fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术分析，使用xCT抑制剂处理的DAOY细胞，直方图和点图，细胞分化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66645/66645fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：通过基因手段诱导铁死亡。 DAOY野生型（WT）和xCT-/-细胞在有或无2 µM铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Ferro-1）条件下培养6小时后，通过流式细胞术检测脂质过氧化物染色的代表性数据。左侧为脂质过氧化物含量的直方图表示，右侧为记录事件的点图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/66645fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>平板 I </td>
			<td>对照组 I</td>
			<td>对照组 II </td>
			<td>对照组 III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1 µM erastin I</td>
			<td>1 µM erastin II</td>
			<td>1 µM erastin III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>平板 II </td>
			<td>0.3 µM RSL3 I</td>
			<td>0.3 µM RSL3 II</td>
			<td>0.3 µM RSL3 III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>250 µM FAC I</td>
			<td>250 µM FAC II</td>
			<td>250 µM FAC III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>平板 III </td>
			<td>2 µM Ferro-1 I</td>
			<td>2 µM Ferro-1 II</td>
			<td>2 µM Ferro-1 III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1 M erastin + 2 M Ferro-1 I</td>
			<td>1 M erastin + 2 M Ferro-1 II</td>
			<td>1 M erastin + 2 M Ferro-1 III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>平板 IV </td>
			<td>0.3 M RSL3 + 2 M Ferro-1 I</td>
			<td>0.3 M RSL3 + 2 M Ferro-1 II</td>
			<td>0.3 M RSL3 + 2 M Ferro-1 III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>250 M FAC + 2 M Ferro-1  I</td>
			<td>250 M FAC + 2 M Ferro-1 II</td>
			<td>250 M FAC + 2 M Ferro-1 III</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：对照细胞与实验细胞的处理细节。
补充图 1：DAOY xCT-/- 细胞的铁死亡。 （A）在添加或不添加 2 µM Ferrostatin-1 的 DMEM 培养基中培养的 DAOY WT 和 xCT-/- 细胞中 xCT 蛋白水平的 Western 印迹分析。（B）DAOY xCT-/- 细胞在有（左）或无（右）1 mM N-乙酰半胱氨酸处理 6 小时后的代表性显微图像。白色箭头指示呈圆形、“起泡”状的细胞，表明在光学显微镜下可见的铁死亡表型。放大倍数：40×。比例尺：10 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

脂质过氧化氢含量是衡量铁死亡最常见的指标。本文展示了在诱导铁死亡后，通过流式细胞术逐步分析细胞内脂质过氧化氢含量的操作流程。

铁与氧的相互作用是地球生命演化过程中不可或缺的一部分。然而，这种独特的化学性质至今仍令人着迷并……

我们研究的最终目标是为髓母细胞瘤等儿童癌症开发新的治疗方法。为此，我们的团队致力于建立突出疾病遗传背景的新模型系统，同时探索新的治疗途径。近年来，单细胞基因组学揭示了谱系承诺受损如何影响儿童癌症的临床预后、治疗反应，以及最终导致肿瘤内出现耐药细胞群体的形成。神经前体细胞分化状态的谱系似乎影响着儿童癌症的临床预后。目前主要的挑战在于理解肿瘤内这些高度可塑、缺失或功能不全的前体细胞，以及开发出针对这些疾病更高效且毒性更低的新型治疗手段。从这一角度来看，我们对铁死亡（ferroptosis）的研究显得极具前景。铁依赖性是癌细胞（也称为肿瘤干细胞）的主要弱点之一。铁作为必需元素具有双重作用，因其与活性氧反应可导致一种特定类型的细胞死亡，称为铁死亡。我们的数据明确表明，铁死亡对此类癌细胞具有巨大的抑制潜力。将野生型髓母细胞瘤细胞系接种于6孔板中进行培养。24小时后，向细胞中加入相应的铁死亡诱导剂，并将培养板置于37°C、5% CO₂条件下孵育。处理6小时后，在光学显微镜下观察细胞是否出现变圆现象。使用移液器在层流罩中吸去培养板中的培养基和悬浮细胞。用两毫升 PBS 洗涤细胞，轻轻摇晃后吸去 PBS。随后加入两毫升探针工作液，避光孵育培养板。用一微摩尔的erastin处理DAOY野生型细胞后，通过光学显微镜观察到细胞呈圆形并出现起泡现象，表明其具有铁死亡表型。首先，在层流罩中将诱导发生铁死亡的髓母细胞瘤细胞与body PC 11共同孵育，随后去除染色液。用两毫升PBS洗涤细胞后，加入150微升细胞解离试剂孵育细胞。为机械收获细胞，加入 250 微升流式细胞术缓冲液，轻轻敲击培养板。然后将细胞转移至带有滤膜帽的标记好的流式细胞术管中。接着打开 FACS 仪器。创建一个新实验，选择 FITC 滤光片和 488 纳米激光器。在“查看数据”中，选择细胞大小大于 12 微米，并对散点图设门。然后添加一个新的直方图，以 FITCA 为坐标轴，采用对数刻度。然后涡旋混匀试管中取出的样品，并将其上机至流式细胞仪。最后，记录10,000个前向散射单细胞事件。为染色死细胞，在流式细胞分析前立即加入碘化丙啶溶液。通过流式细胞术分析脂质氢过氧化反应，验证了经厄拉司汀处理的髓母细胞瘤细胞中发生铁死亡。

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