使用钢板固定技术稳定墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）股骨截骨术

我们研究四足动物的再生能力，以墨西哥钝口螈作为再生能力最强的模式物种，通过与青蛙和小鼠进行比较，揭示再生过程中的细胞与分子机制。转基因技术与基因组编辑技术的发展、墨西哥钝口螈基因组的组装，以及RNA-Seq、ATAC-Seq、空间转录组学和蛋白质组学的应用，使我们能够更深入地理解再生微环境，并将其与再生能力较弱的物种（包括人类）进行比较。我们已确定了再生肢体和脊髓中不同组织的细胞来源，并鉴定了胚基中初始细胞增殖和位置身份的关键调控因子。

在最近的一篇论文中，我们展示了墨西哥钝口螈的骨愈合过程经历了软骨内成骨，其细胞水平的变化与哺乳动物相似。与以往将墨西哥钝口螈骨折部位不固定或依赖邻近骨骼作为支撑的技术不同，本方案采用钢板对骨骼进行固定，从而能够创建可重复且对位良好的骨折模型，并实现与小鼠研究之间的可靠比较。该方案可实现骨折的稳定固定并控制骨痂大小，将钢板固定骨折的研究拓展至两栖动物领域。

尽管墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）具有极强的再生能力，能够在截肢后完全恢复肢体，但令人惊讶的是，它们无法愈合具有临界尺寸缺损的大面积骨骨折。我们的目标是确定导致退行性芽基形成的因子，以治疗临界尺寸缺损中的骨不连。首先，将经麻醉的墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）腹侧朝下放置在浸有0.03%苯佐卡因溶液的湿润纸巾上。

用浸有苯佐卡因的纸巾覆盖动物。使用环形镊子拉伸手术侧的后肢。用手术刀在股骨上方的外侧做一纵向切口，贯穿后肢大腿的整个长度。

小心地将肌肉和神经从手术部位移开，不要切割。轻轻地将Bode钳置于股骨下方以暴露手术区域。现在将一块坚固的7.75毫米四孔固定板沿股骨干放置，避免接触关节，并用钳子将其固定在对齐的位置。

使用四枚直径两毫米的钛合金螺钉将骨骼固定在接骨板上。在使用0.7倍磷酸盐缓冲液（PBS）和1%青霉素-链霉素溶液冲洗的条件下，手动钻孔，在骨骼上制备第一个用于植入螺钉的孔洞，随后将第一枚螺钉置入该孔中。

将锯导引装置安装到第一枚螺钉上，并与骨骼和接骨板对齐。使用锯导引装置进行钻孔并植入其余螺钉。确认接骨板与骨骼对齐后，取下锯导引装置，并使用螺丝刀将螺钉上的手柄折断取下。

在股骨下方放置一片灭菌的塑料薄膜，以防止截骨过程中软组织受损。然后将摆动线锯置于骨骼与保护薄膜之间。使用摆动线锯切割骨骼，在股骨上形成一个单一切口，宽度为 0.7 毫米。

取下锯子和保护膜，用0.7倍PBS和1%青霉素-链霉素冲洗手术部位。用无菌骨蜡覆盖板和螺钉的顶部，以保护皮肤和肌肉免受螺钉边缘的刺激。将肌肉和皮肤放置在骨蜡上方。

使用7.0号合成缝线，采用单纯间断缝合法关闭切口。术后为使动物苏醒，将其置于含有青霉素、链霉素和布托啡诺的新鲜人工池水水箱中。通过显微CT和组织学分析，可对骨组织、碎片位置、间隙大小以及愈合状态进行可视化观察。

值得注意的是，墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）在术后三周内未出现骨痂形成，这与哺乳动物形成鲜明对比。术后三个月可见软骨性骨痂，术后六个月出现骨化骨痂。