Name: 裂变酵母作为靶向细菌细胞骨架蛋白的抗菌药物筛选平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-26T14:35:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: 了解利用裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe作为异源宿主筛选靶向细菌细胞骨架蛋白FtsZ和MreB的抗菌化合物的方法。该细胞实验平台结合荧光显微镜技术，可鉴定影响细菌细胞分裂和DNA分配相关蛋白聚合的小分子，为新型抗生素开发提供研究基础。

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SMP、SR 和 AKS 感谢印度原子能部国家科学教育与研究中心提供的博士后资助。RS 感谢印度原子能部提供的内部经费支持，本研究还获得了印度生物技术部（DBT）向 RS 提供的研究资助（项目编号：BT/PR42977/MED/29/1603/2022）。作者们还感谢 V Badireenath Konkimalla 在本实验方案开发过程中提出的评论、建议和讨论。

1. 在 S. pombe 中表达GFP标记的细菌细胞骨架蛋白
注意：有关本研究中使用的所有质粒和菌株的信息，请参见表1。有关所有培养基成分的信息，请参见表2。
<ol>
	<li>进行克隆 E. coli 带有N端GFP融合的MreB（GFP-MreB）以及 S. aureus 携带C端GFP的FtsZ（SaFtsZ-GFP）进入 S. pombe 表达载体，pREP42，带有中等强度的硫胺素抑制型启动子 nmt4118,19 如前所述14,15. 从细胞中维持、扩增并分离质粒 E. coli 菌株（DH10β），如文中所述20,21. 
	注意：其他 E. coli 诸如DH5α、XL1Blue、TOP10等菌株，或其他常用于分子克隆的市售感受态细胞也可使用。</li>
	<li>将质粒 pREP42-GFP-EcMreB 和 pREP42-SaFtsZ-GFP 转化入 S. pombe
	<ol>
		<li>将质粒 pCCD3 (pREP42-GFP-EcMreB) 和 pCCD713 (pREP42-SaFtsZ-GFP) 转化入 S. pombe 菌株（h-leu1-32 ura4-18天）采用乙酸锂法22，如下述步骤所述。</li>
		<li>第1天 - 原代培养：接种一环新鲜划线培养的菌体 S. pombe 在3 mL灭菌的酵母提取物及补充剂（YES）液体培养基中培养，于30 °C在摇床中过夜（O/N）孵育。</li>
		<li>第2天：
		<ol>
			<li>继代培养：将约500 µL的初代培养物加入30 mL经高压灭菌的YES液体培养基中，于30 °C振荡培养3–4 h，直至OD600 达到 0.4 - 0.6。 
			注意：每次转化使用 30 mL。</li>
			<li>将30 mL培养液在2,500 x g下离心成团 g 室温下孵育6-8分钟。弃去上清液，用50 mL无菌蒸馏水（D/W）洗涤细胞。再次离心收集沉淀，弃去上清液。将细胞重悬于1 mL无菌蒸馏水（D/W）中，转移至2 mL离心管中。&#160;离心同上，弃去上清液。</li>
			<li>加入1 mL 0.1 M醋酸锂-Tris-EDTA（LiAc-TE）溶液，按上述方法离心。弃去上清液，用1 mL 0.1 M LiAc-TE溶液重悬沉淀。再次离心后弃去上清液，保留约100 µL溶液。</li>
			<li>加入10 - 20 µg载体DNA（鲑鱼精子DNA；变性后在冰上快速冷却）和2 - 3 µg需要转化的质粒DNA，轻轻混匀。室温孵育10分钟。</li>
			<li>加入 260 µL 40% PEG/LiAc-TE；轻轻混匀。在 30 °C 摇床或恒温混匀仪中孵育 60 分钟，轻柔混匀。加入 43 µL DMSO；轻轻混匀。</li>
			<li>42 °C 热激 10 分钟，使用恒温混匀仪。2,500 x g 离心收集沉淀 g 6-8 分钟，弃去上清液。用 1 mL 无菌去离子水重悬沉淀物，洗涤 1 次。</li>
			<li>离心，弃上清液，将沉淀重悬于200 µL无菌D/W中。取100 µL涂布于含5 µg/mL硫胺素（以抑制）的爱丁堡最小培养基（EMM）平板上 nmt41 启动子）以及氨基酸补充剂腺嘌呤（0.225 mg/mL）、组氨酸（0.225 mg/mL）和亮氨酸（0.225 mg/mL），但不含尿嘧啶（pREP42质粒的筛选标记）。 
			注意：也可将70 µL和130 µL分别接种至两个不同的培养皿中。由于转化效率在不同实验间可能存在差异，通过接种两种不同体积（70 µL和130 µL），可确保至少其中一个培养皿上获得单菌落。</li>
			<li>在30 °C下培养平板2-3天，直至菌落出现。挑取单个菌落与100 µL无菌去离子水混合，按上述方法涂布于含硫胺但不含尿嘧啶的新鲜EMM平板上。</li>
			<li>在30 °C下孵育2-3天，直至形成完整的菌苔。用接种环刮取生长的菌苔，并将其重悬于含有30%甘油的1 mL YES培养基中，置于冻存管内。</li>
			<li>将冻存管在液氮中快速冷冻，随后于 -80 °C 保存，以维持酵母菌种的冷冻状态。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>裂殖酵母中细菌细胞骨架蛋白的表达
	<ol>
		<li>无菌条件下，用接种环从甘油菌种中取一环，划线接种于新鲜的酵母专用平板上，以获得足量培养物用于后续实验。 
		注意：对于pREP42，我们使用含有腺嘌呤、组氨酸和亮氨酸的EMM琼脂平板（最小培养基），因为使用 S. pombe 菌株（h- leu1-32 ura4-D18）在无尿嘧啶培养基中培养（尿嘧啶作为筛选标记存在于pREP42中）。我们在琼脂平板中添加15–20 µM硫胺素（因pREP42含有硫胺素可抑制元件） nmt41 启动子）在平板上培养时抑制目的基因的表达。</li>
		<li>用接种环取少量划线区域的接种物，接种于5 mL缺乏硫胺素的酵母专用EMM培养基中，于30 °C振荡培养10 - 12小时。 
		注意：在不同物种中表达 FtsZ 和 MreB 时 nmt41 启动子在 S. pombe 可能有所不同，通常为16至30小时。GFP-EcMreB和SaFtsZ-GFP蛋白表达的最佳时间 S. pombe 分别为20 - 24 h和16 - 20 h（30 °C，无硫胺素）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
表达GFP标记的细菌细胞骨架蛋白的粟酒裂殖酵母（S. pombe）培养物的处理
注意：在96孔板中，对过夜培养的酵母菌液测试多种不同的药物分子。
<ol>
	<li>使用半自动化的96孔多通道移液仪，将50 µL过夜培养物转移至含有150 µL新鲜酵母EMM培养基的96孔板各孔中，接种新鲜培养物。</li>
	<li>使用半自动化的96孔多通道移液器反复吹打以充分混匀的同时，缓慢向正在生长的培养物中加入不同且逐步增加浓度的药物，每种浓度设置三个重复，示意图见图1。</li>
	<li>以已知药物作为阳性对照，分别为PC190723（针对S. aureus FtsZ）和A22（针对E. coli MreB），每种设置两个重复。 
	注意：如先前报道，PC190723和A22的使用浓度分别为56.2 µM17和72.6 µM14,17。同时，A22处理SaFtsZ和PC190723处理EcMreB分别作为阴性对照。</li>
	<li>根据药物的最低和最高浓度，使用DMSO作为溶剂对照，设置三种不同浓度。 
	注意：药物所溶解的溶剂用作溶剂对照。</li>
	<li>将对照组和处理组的培养物在30 °C下孵育6–10小时（直至细胞显示出细菌荧光蛋白的表达），然后使用落射荧光显微镜进行成像。</li>
</ol>
3. 聚合物的可视化
<ol>
	<li>在光学透明底96孔板（荧光成像用黑色孔壁）的每孔中加入20 µL浓度为1 mg/mL的刀豆球蛋白A，室温孵育20分钟。吸去液体，室温晾干10分钟。</li>
	<li>将 20 µL 细胞从培养板转移至相应的孔中，静置 10 分钟。用无菌 EMM 培养基洗涤细胞 3 至 4 次。</li>
	<li>使用待用的物镜（见步骤 3.6），在图像采集面板的导航模式下进行图像采集&#160;用于96孔板对齐和孔位覆盖的软件。在导航器中对齐孔的边缘。</li>
	<li>接下来，选择孔内覆盖参数，包括对孔内感兴趣区域进行多位置选择，并使用按需模式的自适应自动对焦控制，以在成像过程中保持样本聚焦。</li>
	<li>使用微分干涉差（DIC）和荧光成像。设置激发滤光片为475/28 nm，发射滤光片为525/48 nm，以观察酵母中表达的GFP标记细菌蛋白。以0.2 µm的步长获取贯穿酵母细胞厚度（5 µm）的Z轴层扫图像。</li>
	<li>使用配备100倍、1.4数值孔径油浸物镜和2,000 × 2,000像素sCMOS相机（像素尺寸6.5 µm × 6.5 µm）的倒置落射荧光显微镜采集图像。采用LED照明系统激发荧光染料。 
	注意：任何配备可自动定位96孔板的电动载物台且具有精确多点定位功能的落射荧光显微镜系统均适用。对对照组和药物处理组的细胞图像，应采用相同的曝光时间（通常为0.3–0.5秒）、1×1 binning模式以及15%–20%的照明强度进行采集，以最小化实验变量并保持一致性。</li>
</ol>
4. 使用 ImageJ 对图像进行定量分析
<ol>
	<li>处理细胞图像，并测量 FtsZ17 每个细胞的斑点数量及密度。对于 MreB，测量其密度和各向异性23，并使用 Fiji（v2.0.0-rc-69/1.52p）24 比较对照组与处理组细胞之间的差异。</li>
	<li>利用明场差分干涉（DIC）通道的图像，首先使用自由手绘工具勾勒单个酵母细胞轮廓，并在 ROI 管理器中保存为感兴趣区域（ROI）。此步骤目前尚未实现自动化，但近期开发的基于机器学习的工具25,26 可在未来尝试并整合应用。</li>
	<li>按照文献27所述方法，将细胞外部区域进行掩膜处理并填充为黑色。</li>
	<li>使用 Fiji 内置的 OPS 阈值 IJ1 分析宏（analyse macro）来统计斑点数量24。</li>
	<li>采用 Otsu 方法进行自动阈值分割，并对分割出的颗粒进行掩膜处理。通过宏运行“分析颗粒”（analyse particles）插件。</li>
	<li>在测量聚合物密度（即单位面积细胞内细胞骨架的含量）时，按所述方法处理图像，包括掩膜和骨架化步骤27,28。使用 lpx 插件中的 Lpx 2Dfilter 对图像进行骨架化处理。</li>
	<li>具体细节请参考最近发表的研究17。EcMreB 聚合体的定量分析方法如前文所述23，使用 FibrilTool29 通过各向异性量化空间组织结构，方法同前23。 
	注意：这些分析方法可用于定量其他经药物处理或未处理的细菌细胞骨架蛋白。</li>
</ol>

Identifying Drugs that Affect Polymerization of Bacterial Cytoskeletal Proteins

<ol><li>Antimicrobial Resistance Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+of+bacterial+antimicrobial+resistance+in+2019%3A+a+systematic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis.</a> Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).</li>
<li>Haselbeck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+essential+gene+identification+as+a+platform+for+novel+anti-infective+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharma+Des%22%5BJournal%5D)">Comprehensive essential gene identification as a platform for novel anti-infective drug discovery.</a> Curr Pharma Des. 8 (13), 1155-1172 (2002).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+small+molecule+that+inhibits+cell+division+by+blocking+FtsZ%2C+a+novel+therapeutic+target+of+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Discovery of a small molecule that inhibits cell division by blocking FtsZ, a novel therapeutic target of antibiotics.</a> J Biol Chem. 278 (45), 44424-44428 (2003).</li>
<li>Sanchez, S., Demain, A. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSanchez%2C+S+%22Antibiotics%3A+current+innovations+and+future+trends%22">Antibiotics: current innovations and future trends</a>. , Caister Academic Press. (2015).</li>
<li>Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prokaryotic+cytoskeleton%3A+a+putative+target+for+inhibitors+and+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The prokaryotic cytoskeleton: a putative target for inhibitors and antibiotics.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 73 (1), 37-47 (2006).</li>
<li>Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+bacterial+Z-ring%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeting the bacterial Z-ring.</a> Chem Biol. 15 (2), 93-94 (2008).</li>
<li>Kusuma, K. D., Payne, M., Ung, A. T., Bottomley, A. L., Harry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsZ+as+an+antibacterial+target%3A+status+and+guidelines+for+progressing+this+avenue%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">FtsZ as an antibacterial target: status and guidelines for progressing this avenue.</a> ACS Infect Dis. 5 (8), 1279-1294 (2019).</li>
<li>Kaul, M., Zhang, Y., Parhi, A. K., Lavoie, E. J., Pilch, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+RND-type+efflux+pumps+confers+the+FtsZ-directed+prodrug+TXY436+with+activity+against+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of RND-type efflux pumps confers the FtsZ-directed prodrug TXY436 with activity against Gram-negative bacteria.</a> Biochem Pharmacol. 89 (3), 321-328 (2014).</li>
<li>Casiraghi, A., Suigo, L., Valoti, E., Straniero, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+bacterial+cell+division%3A+A+binding+site-centered+approach+to+the+most+promising+inhibitors+of+the+essential+protein+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Targeting bacterial cell division: A binding site-centered approach to the most promising inhibitors of the essential protein FtsZ.</a> Antibiotics. 9 (2), 69(2020).</li>
<li>Piddock, L. J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug-resistance+efflux+pumps+-+not+just+for+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multidrug-resistance efflux pumps - not just for resistance.</a> Nat Rev. Microbiol. 4 (8), 629-636 (2006).</li>
<li>Käufer, N. F., Simanis, V., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe+correctly+excises+a+mammalian+RNA+transcript+intervening+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fission yeast Schizosaccharomyces pombe correctly excises a mammalian RNA transcript intervening sequence.</a> Nature. 318 (6041), 78-80 (1985).</li>
<li>Vyas, A., Freitas, A. V., Ralston, Z. A., Tang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe%3A+A+unicellular+micromammal+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Prot%22%5BJournal%5D)">Fission yeast Schizosaccharomyces pombe: A unicellular micromammal model organism.</a> Curr Prot. 1 (6), e151(2021).</li>
<li>Edwards, D. H., Thomaides, H. B., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuous+targeting+of+Bacillus+subtilis+cell+division+protein+DivIVA+to+division+sites+in+Escherichia+coli+and+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Promiscuous targeting of Bacillus subtilis cell division protein DivIVA to division sites in Escherichia coli and fission yeast.</a> EMBO J. 19 (11), 2719-2727 (2000).</li>
<li>Srinivasan, R., Mishra, M., Murata-Hori, M., Balasubramanian, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filament+formation+of+the+Escherichia+coli+actin-related+protein%2C+MreB%2C+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Filament formation of the Escherichia coli actin-related protein, MreB, in fission yeast.</a> Curr Biol. 17 (3), 266-272 (2007).</li>
<li>Srinivasan, R., Mishra, M., Wu, L., Yin, Z., Balasubramanian, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+cell+division+protein+FtsZ+assembles+into+cytoplasmic+rings+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Dev%22%5BJournal%5D)">The bacterial cell division protein FtsZ assembles into cytoplasmic rings in fission yeast.</a> Gene Dev. 22 (13), 1741-1746 (2008).</li>
<li>TerBush, A. D., Osteryoung, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+functions+of+chloroplast+FtsZ1+and+FtsZ2+in+Z-ring+structure+and+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct functions of chloroplast FtsZ1 and FtsZ2 in Z-ring structure and remodeling.</a> J Cell Biol. 199 (4), 623-637 (2012).</li>
<li>Sharma, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+of+salt+bridge-mediated+resistance+to+FtsZ+inhibitor+PC190723+revealed+by+a+cell-based+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">A mechanism of salt bridge-mediated resistance to FtsZ inhibitor PC190723 revealed by a cell-based screen.</a> Mol Biol Cell. 34 (3), ar16(2023).</li>
<li>Basi, G., Schmid, E., Maundrell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TATA+box+mutations+in+the+Schizosaccharomyces+pombe+nmt1+promoter+affect+transcription+efficiency+but+not+the+transcription+start+point+or+thiamine+repressibility%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">TATA box mutations in the Schizosaccharomyces pombe nmt1 promoter affect transcription efficiency but not the transcription start point or thiamine repressibility.</a> Gene. 123 (1), 131-136 (1993).</li>
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</ol>

所有作者均声明无利益冲突。

抗菌耐药性（AMR）是一项严重的全球健康威胁，迫切需要研发具有新作用靶点的新型抗生素。细菌细胞骨架已成为开发新型抗生素的有吸引力的靶点，针对细胞分裂蛋白FtsZ的小分子抑制剂（如TXA709）目前已进入I期临床试验30。已有多种方法被开发用于鉴定抑制FtsZ聚合的化合物7,31。我们近期利用真核裂殖酵母建立了一种基于细胞的检测方法，证明FtsZ稳定药物PC190723能够靶向HpFtsZ17。此外，我们还发现，尽管小檗碱和血根碱等药物可影响FtsZ的聚合，但它们也会影响酵母细胞的形态17。受这些研究和观察结果的启发，我们着手开发一种单步、基于细胞的检测方法，利用裂殖酵母表达平台筛选细菌细胞骨架的小分子调节剂。由于该筛选依赖于抑制GFP标记的细胞骨架蛋白的组装，因此具有类似荧光团特性的化合物可能产生假阳性结果。避免使用长通滤光片并选择窄带通滤光片，有助于减少由荧光小分子引起的假阳性。本文展示了利用配备96孔板载物台的落射荧光显微镜建立中通量筛选的具体步骤，可用于筛选靶向SaFtsZ或EcMreB的药物。该工作流程包括半自动化的图像采集与分析，未来可结合自动化液体处理系统和图像处理流程，轻松扩展为高通量筛选。
此外，该筛选方法也可用于其他细菌细胞骨架蛋白，例如含有肌动蛋白折叠结构的质粒维持蛋白 ParM32，以及在裂殖酵母中能够组装成多聚结构的任何蛋白。然而，在用于药物筛选之前，每种目标蛋白的最适表达水平均需预先标准化。对于 FtsZ 蛋白，我们发现 nmt41 是一种理想的启动子；而对于其他目标蛋白，则可尝试使用更强或更弱版本的 nmt1 启动子（启动子强度（及渗漏性）：nmt1 &gt; nmt41 &gt; nmt81），或使用其他组成型启动子，如酵母的 adh1 或 act118,33，以获得最佳的表达水平和多聚结构组装效果。此外，在使用游离型质粒时，细胞间质粒拷贝数的变异也会导致基因表达不均一。为克服这一问题，近年来已开发出多种可整合至裂殖酵母基因组的载体（SIVs，即稳定整合载体），其携带不同强度的启动子34。与本研究中所用的游离型载体相比，使用这些整合型载体可获得更均一且可定量的实验结果。SIVs 的应用可避免表达水平的高度异质性，即细胞间荧光强度的差异，因而更适用于高通量筛选。
此外，像PC190723这样的药物能够稳定FtsZ多聚体，导致与未处理细胞相比，FtsZ丝状结构更早组装。尽管该筛选方法适用于筛选抑制细菌细胞骨架蛋白聚合的药物，但由于终点时依赖对弥散荧光的视觉评估，因此针对稳定FtsZ多聚体药物的筛选需要进一步优化蛋白表达水平以及达到具有多聚体细胞最大比例所需的时间。因此，准确估算蛋白表达达到组装所需临界浓度所需的时间，并据此确定检测的终点时间至关重要。对于可能降低蛋白聚合所需临界浓度的药物，通常应选择这样一个时间点作为终点：在该时间点，大量未处理细胞表现出弥散性荧光，而药物处理的培养物则已显示出多聚体结构的形成。
该工作流程中的一个局限性同时也是耗时的步骤，即需要识别并分割单个细胞以进行定量图像分析。目前，在本方案中，识别单个酵母细胞并划定感兴趣区域（ROIs）以量化药物效应仍为人工操作。然而，我们预计，利用训练集（例如可在 ilastik35 中实现的算法）开发的最新机器学习算法，将能显著减少对人工干预的需求。
尽管我们在此使用的酵母平台有助于鉴定作用于细菌细胞骨架的潜在小分子化合物，但最终仍需通过标准的最低抑菌浓度试验以及动物模型中的药效评估来验证其抗菌活性。然而，应对全球范围内日益严重的抗菌药物耐药性（AMR）问题，最大的挑战仍在于革兰氏阴性菌的外膜通透性以及多种致病菌中存在的大量外排泵。此外，裂殖酵母中的外排泵也可能带来类似问题，导致筛选过程中需要更高的药物浓度。作为替代方案，可使用对药物高度敏感的裂殖酵母菌株（S. pombe MDR-supML），该菌株因缺失了包括四个转运蛋白基因和一个转录因子在内的七个多重耐药基因而表现出超敏特性，适合作为筛选宿主32,33。未来需要发展结合靶向抗菌药物发现并克服膜通透性等普遍性耐药机制的新技术，以应对日益严峻的抗菌药物耐药性问题。

目前用于治疗细菌感染的几乎所有抗生素都出现了广泛耐药性，这迫切需要开发新型抗生素。2019年的一份报告指出，耐药菌感染直接导致127万人死亡，在计入耐药菌感染并发症的情况下，相关死亡总数高达495万人1。尽管现有抗生素在临床实践中仍有效，但其作用靶点主要集中于细胞壁、DNA和蛋白质合成等有限的细胞过程。在过去半个世纪中，仅有不到30种蛋白质被商业化用作新型抗菌药物的靶点2,3。这种可用靶点的局限性极大地限制了新型抗生素或其衍生物的研发，以应对耐药细菌的挑战。因此，为克服日益严重的抗生素耐药问题，亟需开发具有新作用靶点和新作用机制的抗生素。
理想的抗菌靶点应是细菌细胞生长所必需的组分，在系统发育上多样化的物种中具有保守性，与真核生物的同源性最低，并且能够被抗生素所靶向4。自发现参与细菌细胞分裂和细胞形态维持的细胞骨架蛋白以来，这些蛋白已成为开发抗菌化合物的有前景的关键靶点5。这些蛋白对细菌的存活至关重要，在维持细胞形态（MreB、CreS）、细胞分裂（FtsZ、FtsA）以及DNA分离（ParM、TubZ、PhuZ、AlfA）等方面发挥关键作用，类似于真核细胞中的细胞骨架。其中，FtsZ在多种原核生物中表现出高度保守性，而MreB几乎存在于所有杆状细菌中。这类蛋白分布广泛且对细胞存活至关重要，使其成为抗生素研究中极具吸引力的靶标5,6,7。
必须采用多管齐下的方法，结合体内观察、体外相互作用和酶学实验，以充分验证细菌细胞骨架蛋白是否为潜在抑制剂的主要作用靶点7。目前许多可用于此目的的检测方法程序繁琐或成本较高，显著限制了其在筛选可能影响细菌细胞骨架的先导化合物中的广泛应用。在这些方法中，显微镜技术因其能够通过直接观察细胞形态变化来评估化合物的有效性，而成为一种极为高效且快速的方法。然而，靶蛋白与其他细胞骨架复合物的异源结合、脱靶结合引起的间接效应、膜电位的变化、化合物难以有效穿透细胞膜，以及外排泵（尤其在革兰氏阴性菌中）的存在，共同导致了细菌细胞形变的确切原因难以明确界定8,9,10。
裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe） 或称裂殖酵母，是一种杆状的单细胞真核生物。由于裂殖酵母在细胞周期与分裂、细胞结构组织以及染色体复制等细胞过程方面与包括人类在内的高等真核生物具有高度保守性，因此被广泛用作细胞生物学和分子生物学研究中的模式生物。11,12此外，Errington 及其同事在裂殖酵母中表达了定位于细胞极区的细菌细胞骨架蛋白 DivIVA，以证明 DivIVA 会富集于负曲率表面13再次，Balasubramanian 及其团队首次将裂殖酵母确立为一种细胞模型系统，以深入揭示机制、组装过程及动态特性 E. coli 肌动蛋白细胞骨架蛋白 MreB14 微管蛋白同源物FtsZ15他们还通过表观荧光显微镜证明了A22在酵母中表达时能有效抑制MreB的聚合。14此后，其他研究团队也成功利用裂殖酵母研究叶绿体FtsZ1和FtsZ2蛋白的组装特性。16最近，我们通过全面评估三种已知的FtsZ抑制剂——血根碱、小檗碱和PC190723——对两种致病菌来源的FtsZ蛋白的影响，初步验证了利用裂殖酵母作为细胞平台特异性筛选细菌细胞骨架抑制剂的可行性。 金黄色葡萄球菌 和 幽门螺杆菌17此外，这种单步细胞实验对于降低识别可能对真核细胞具有毒性的化合物的风险具有重要作用。
本报告中，利用裂殖酵母系统，我们提出了一种基于标准96孔板的系统性工作流程，用于对靶向金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）FtsZ蛋白和大肠杆菌（Escherichia coli）MreB蛋白的小分子抑制剂效应进行半自动化筛选与定量分析。本文中，我们建立并优化了该半自动化工作流程，使用已知的特异性靶向FtsZ和MreB的抑制剂PC190723与A22作为模型化合物。该工作流程采用配备电动高精度载物台的标准96孔板，并结合落射荧光显微镜进行自动图像采集，从而提升现有实验的标准化程度。因此，该方法可适用于合成化学文库的中通量及高通量筛选，并克服了上述部分技术挑战。

<table><tbody><tr><td>96孔CC2光学CVG无菌板，带盖，黑色</td><td>Thermo Scientific&amp;trade;</td><td>160376</td><td></td></tr><tr><td>96孔板</td><td>康宁&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;CLS3370</td><td></td></tr><tr><td>A22 盐酸盐</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>SML0471</td><td>溶于DMSO</td></tr><tr><td>腺嘌呤</td><td>FormediumTM</td><td>DOC0229</td><td>225 mg/L 培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>刀豆蛋白A&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>C5275-5MG</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>317275</td><td></td></tr><tr><td>爱丁堡最低培养基（EMM 琼脂或 EMM 肉汤）</td><td>FormediumTM</td><td>PMD0210</td><td>参见下文以了解成分</td></tr><tr><td>EDTA&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>epMotion&amp;reg; 96孔板配2位置滑块</td><td>Eppendorf</td><td>5069000101</td><td></td></tr><tr><td>组氨酸</td><td>FormediumTM</td><td>DOC0144</td><td>225 mg/L 培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Leica DMi8 倒置荧光显微镜</td><td>徕卡显微系统</td><td></td><td>德国公司</td></tr><tr><td>亮氨酸</td><td>FormediumTM</td><td>DOC0157</td><td>225 mg/L 培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>乙酸锂&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>517992-100G</td><td></td></tr><tr><td>PC190723</td><td>默克&amp;nbsp;</td><td>344580</td><td>溶于DMSO</td></tr><tr><td>聚乙二醇（PEG）</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>202398</td><td></td></tr><tr><td>硫胺素</td><td>Sigma</td><td>T4625</td><td>过滤除菌</td></tr><tr><td>Tris-盐酸盐</td><td>MP</td><td>194855</td><td></td></tr><tr><td>尿嘧啶</td><td>FormediumTM</td><td>DOC0214</td><td>225 mg/L 培养基，储存溶液于 36&amp;deg;C</td></tr><tr><td>YES（酵母提取物+补充剂）琼脂</td><td>FormediumTM</td><td>PCM0410</td><td>见下文以了解成分</td></tr><tr><td>YES（酵母提取物加补充剂）肉汤</td><td>FormediumTM</td><td>PCM0310</td><td>请参见下文以了解成分组成</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;酵母（&lt;em&gt;S. pombe&lt;/em&gt;) 培养基&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;酵母提取物 + 补充物（YES）&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>&lt;strong&gt;成分&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;g/L&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td></td><td>酵母提取物</td><td>5</td><td></td></tr><tr><td></td><td>葡萄糖</td><td>30</td><td></td></tr><tr><td></td><td>琼脂</td><td>17</td><td></td></tr><tr><td></td><td>腺嘌呤</td><td>0.05</td><td></td></tr><tr><td></td><td>L-组氨酸</td><td>0.05</td><td></td></tr><tr><td></td><td>L-亮氨酸</td><td>0.05</td><td></td></tr><tr><td></td><td>L-赖氨酸盐酸盐</td><td>0.05</td><td></td></tr><tr><td></td><td>尿嘧啶</td><td>0.05</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;爱丁堡最低培养基（EMM）&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>&lt;strong&gt;成分&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;克/升&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;浓度&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td>邻苯二甲酸氢钾&amp;nbsp;</td><td>3</td><td>14.7 mM</td></tr><tr><td></td><td>Na2HPO4&amp;nbsp;</td><td>2.2</td><td>15.5 mM</td></tr><tr><td></td><td>NH4Cl&amp;nbsp;</td><td>5</td><td>93.5 mM</td></tr><tr><td></td><td>葡萄糖</td><td>2% (w/v) 或 20 g/L</td><td>&amp;nbsp;111 mM</td></tr><tr><td></td><td>盐溶液（50倍浓缩储备液）</td><td>20 mL/L（v/v）</td><td></td></tr><tr><td></td><td>维生素（储存液 ×1000）</td><td>1 mL/L（v/v）</td><td></td></tr><tr><td></td><td>矿物质（储存液 ×10,000）</td><td>0.1 mL/L（v/v）</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;盐溶液 × 50&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>52.5 克/升 MgCl₂·6H₂O（0.26 M）&amp;nbsp;</td><td>52.5</td><td>0.26 M</td></tr><tr><td></td><td>0.735 mg/L CaCl₂·2H₂O（4.99 mM）&amp;nbsp;</td><td>0.000735</td><td>4.99 mM</td></tr><tr><td></td><td>50 g/l KCl（0.67 M）&amp;nbsp;</td><td>50</td><td>0.67 M</td></tr><tr><td></td><td>2 g/l Na₂SO₄（14.1 mM）</td><td>2</td><td>14.1 mM</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;维生素 × 1000&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>1 g/l 泛酸&amp;nbsp;</td><td>1</td><td>4.20 mM</td></tr><tr><td></td><td>10 g/l 烟酸&amp;nbsp;</td><td>10</td><td>81.2 mM</td></tr><tr><td></td><td>10 g/l 肌醇&amp;nbsp;</td><td>10</td><td>55.5 mM</td></tr><tr><td></td><td>10 mg/l 生物素&amp;nbsp;</td><td>0.01</td><td>40.8 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;矿物质 × 10,000&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>硼酸</td><td>5</td><td>80.9 mM</td></tr><tr><td></td><td>MnSO4&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>4</td><td>23.7 mM</td></tr><tr><td></td><td>ZnSO₄·7H₂O</td><td>4</td><td>13.9 mM</td></tr><tr><td></td><td>FeCl₂·6H₂O&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>2</td><td>7.40 mM</td></tr><tr><td></td><td>钼酸&amp;nbsp;</td><td>0.4</td><td>2.47 mM</td></tr><tr><td></td><td>KI&amp;nbsp;</td><td>1</td><td>6.02 mM</td></tr><tr><td></td><td>CuSO₄·5H₂O&amp;nbsp;</td><td>0.4</td><td>1.60 mM</td></tr><tr><td></td><td>柠檬酸&amp;nbsp;</td><td>10</td><td>47.6 mM</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;菌株/质粒&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;菌株&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;描述&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;参考文献&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>CCD190</td><td>&lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt; DH10&amp;beta;&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td>CCDY4&amp;nbsp;</td><td>MBY3532；CCDY346/pREP42-GFP-EcMreB</td><td>Srinivasan 等，2007</td><td></td></tr><tr><td>CCDY340</td><td>CCDY346/pREP42-SaFtsZ-GFP</td><td>Sharma 等，2023</td><td></td></tr><tr><td>CCDY346</td><td>MBY192 &lt;em&gt;裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）&lt;/em&gt; [ura4-D18, leu1-32, h-]</td><td>Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR)</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;质粒&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCCD3</td><td>pREP42-GFP-EcMreB</td><td>Srinivasan 等，2007</td><td></td></tr><tr><td>pCCD713</td><td>pREP42-SaFtsZ-GFP</td><td>Sharma 等，2023</td><td></td></tr></tbody></table>

以裂殖酵母作为靶向细菌细胞骨架蛋白的抗菌药物筛选平台

Fission Yeast as a Platform for Antibacterial Drug Screens Targeting Bacterial Cytoskeleton Proteins

细菌细胞骨架蛋白（如 FtsZ 和 MreB）执行细胞分裂和维持细胞形态等重要功能。此外，FtsZ 和 MreB 已成为新型抗菌药物研发的重要靶点。目前已开发出多种检测方法，用于筛选靶向这些细胞骨架蛋白的核苷酸结合与聚合过程的化合物，其中主要集中在 FtsZ。然而，许多检测方法操作繁琐或成本较高，且确定药物在细胞内的作用靶点通常需要多种技术手段。最后，药物对真核细胞的毒性也是一个突出问题。本文介绍一种单步细胞水平检测方法，用于发现靶向细菌细胞骨架的新分子，并减少对真核细胞可能具有毒性的假阳性结果。裂殖酵母适用于基于显微镜的高通量筛选，通过直观的形态观察可轻松识别任何影响 FtsZ 或 MreB 聚合的分子。本检测方法采用标准的 96 孔板，依赖于细菌细胞骨架蛋白在裂殖酵母等真核细胞中聚合的能力。尽管本文所述方案以裂殖酵母为系统，并使用金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的 FtsZ 和大肠杆菌（Escherichia coli）的 MreB，但该方法可轻松拓展至其他能在真核表达宿主中形成聚合物的细菌细胞骨架蛋白。本文所述方法将有助于进一步推动靶向细菌细胞骨架蛋白的新型抗菌药物的发现。

设置用于药物筛选的96孔板 
使用 S. pombe 表达C末端GFP标签融合蛋白 S. aureus 来自含有中等强度硫胺素可阻遏启动子的载体（pREP42）的 FtsZ nmt41此前已建立17 同样地， E. coli N端GFP标记的MreB也在其中表达 S. pombe14我们还证明了PC190723（一种特异性SaFtsZ抑制剂）和A22（一种MreB抑制剂）在酵母中表达时，能够特异性地作用于相应的细菌细胞骨架蛋白。14,17.
本文提出利用酵母表达系统，建立针对细菌细胞骨架蛋白的抗菌药物中、高通量筛选方法。配备电动载物台的落射荧光显微镜可实现对96孔板的自动化成像，且市售药物文库也普遍以96孔板形式提供。因此，我们倾向于采用96孔板进行药物筛选。孔板设置如 图1所示。第一行（图1A）为表达SaFtsZ-GFP的酵母培养物，第二行（图1B）为表达GFP-EcMreB的酵母培养物。前两行的前两列（A1:B2）设为培养基空白对照。前两行的后续六列（A3:B12）设为DMSO溶剂对照，包含三种不同浓度，每种浓度设两个复孔，对应药物稀释梯度。随后，将PC190723（56.2 µM）和A22（72.6 µM）分别加入表达SaFtsZ-GFP或GFP-EcMreB的酵母细胞中。其中PC190723和A22分别为FtsZ和MreB的阳性对照。其余所有孔（C1:F12）用于加入待筛药物（每种药物设三种浓度，两个复孔），以鉴定作用于细菌细胞骨架蛋白SaFtsZ或EcMreB的效应分子。将表达GFP标记的SaFtsZ或MreB的酵母培养物接种至96孔板中，培养至药物对蛋白聚合的影响可被观察到为止。
酵母细胞生长效应的评估 
将含有传代培养细胞的96孔板在30 °C下孵育6至10小时后，使用微孔板读数仪测定酵母培养物的光密度（OD）。OD值的测定有助于评估药物对真核酵母细胞的生长抑制作用，以及可能对人类细胞产生的有害效应。因此，该检测可用于基于药物在酵母系统中的毒性筛选多种化合物。然而，PC190723和A22均未表现出对酵母细胞的生长影响或毒性作用。表达SaFtsZ-GFP并经DMSO、PC190723或A22处理的培养物其OD600值分别为0.38 ± 0.03、0.44 ± 0.02和0.43 ± 0.06（N ≥ 4）。同样，表达GFP-EcMreB并经DMSO、PC190723或A22处理的培养物其OD600值分别为0.38 ± 0.04、0.44 ± 0.07和0.41 ± 0.08（N ≥ 4）。
药物对在 S. pombe 中表达的 SaFtsZ 和 EcMreB 组装的多聚结构影响的可视化 
为了评估药物对 SaFtsZ 或 EcMreB 聚合的影响，将上述含药物的 96 孔板中的酵母细胞等分试样转移至另一个带有光学透明玻璃底的 96 孔板中，该板适用于荧光成像。该 96 孔板也经刀豆球蛋白 A 涂层处理，以促进表达 GFP 标签的 SaFtsZ 或 EcMreB 的酵母细胞黏附。使用落射荧光显微镜对 96 孔板进行成像，覆盖图像采集软件预设位置下的全部 96 个孔（图 2）。在对照孔（DMSO 处理）中，于无硫胺条件下培养 16–18 小时后，表达 SaFtsZ-GFP 的酵母细胞显示出以斑点或斑块形式存在的多聚结构，分布于整个细胞中。然而，在无硫胺条件下培养 10–12 小时后，细胞仅表现出弥散性荧光或少量斑块，表明 FtsZ-GFP 的表达尚未达到聚合所需的临界浓度（图 3A）。相反，FtsZ 稳定性药物 PC190723 在培养 12 小时后，与 DMSO 对照组相比，显著增加了 SaFtsZ-GFP 的多聚结构（斑点或斑块）（图 3B），作为阳性对照。相比之下，经 A22 处理的细胞在 SaFtsZ-GFP 组装结构上未显示出差异（图 3C）。然而，与经 PC190723 处理的培养物不同，未处理培养物中的 SaFtsZ-GFP 仅在更长时间诱导后才形成斑块，表明 PC190723 可降低 SaFtsZ 聚合的临界浓度（图 3D）。同样，在 S. pombe 中表达的 GFP-EcMreB 沿裂殖酵母的纵轴形成线性排列的长丝状结构（图 4A）。虽然发现 PC190723 对 EcMreB 聚合无影响（图 4B），但用 A22 处理细胞导致荧光在整个酵母细胞胞质中弥散分布（图 4C）。其余 96 孔板的图像通过肉眼检查，以评估药物对 SaFtsZ 或 EcMreB 的任何稳定或抑制作用，视具体情况而定。
随后可使用 ImageJ 或 Fiji 中的图像分析工具及插件，对药物对细菌细胞骨架蛋白组装的影响进行定量分析，该方法此前已用于 SaFtsZ17 和 EcMreB21 的研究。通过在 96 孔板格式中实现自动化的图像采集，并结合自定义宏和图像处理脚本，可加快成像速度并加速药物效应的定量分析。因此，我们提出以单细胞真核酵母 S. pombe 作为宿主系统，可成功开展针对细菌细胞骨架蛋白的小分子化合物中、高通量筛选，最终推动新型抗生素的发现。
<img alt="S. pombe 中 FtsZ/MreB 蛋白的表达与分析；药物毒性检测；示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66657/66657fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：示意图，展示利用裂殖酵母细胞筛选靶向细菌细胞骨架蛋白 SaFtsZ 或 EcMreB 组装过程的药物。 金黄色葡萄球菌（S. aureus）的 FtsZ 和大肠杆菌（E. coli）的 MreB 被克隆至酵母表达载体 pREP42 中，分别带有 C-末端和 N-末端的 GFP 标签，并转化入 S. pombe 中用于表型及药物研究。培养物在 8–12 小时内生长。随后，将培养物转接到 96 孔板中，设置适当的对照组并加入待筛选的不同药物。接着，将 96 孔板在 30 °C 下孵育 6–8 小时，直至 OD600 达到 0.5–0.6，并使用酶标仪测量光密度，以评估药物对酵母细胞的毒性。另一块光学透明的玻璃底 96 孔板预先包被刀豆蛋白 A，用于黏附酵母细胞。该 96 孔板用于荧光显微镜下的观察和图像采集。所获得的图像随后进行分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66657/66657fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微成像装置示意图；孔板对齐、覆盖范围、自动对焦参数用于分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66657/66657fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：用于96孔板自动成像的图像采集软件示意图。 使用图像采集软件中的导航功能，通过标记边缘对96孔板进行对齐。根据需要选择每个孔的成像数量及其位置（随机或从孔中心）等孔覆盖参数。最后，设置图像参数，如所用滤光片组（DIC和FITC滤光片；激发波长475/28 nm，发射波长525/48 nm）、照明光强度百分比、自动对焦以及图像采集的曝光时间。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66657/66657fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细菌细胞分裂，荧光显微镜；不同处理条件下DIC及SaFtsZ-GFP的表达" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66657/66657fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：PC190723 和 A22 药物对表达 SaFtsZ-GFP 的影响的可视化 S. pombe S. pombe 未添加硫胺素的 SaFtsZ-GFP 表达培养物在 8 - 9 小时内培养于 30 °C 在DMSO和药物处理之前，将培养物置于96孔板中继续培养7 - 9小时 30 °C 在有药或无药条件下。 （A） 在DMSO对照组中，加入等量DMSO后，细胞表现出少量聚合结构。 （B） 在 PC190723 存在的情况下（56.2 µM)，与DMSO对照组相比，表达SaFtsZ的酵母细胞中聚合结构显著增加。 (C) MreB抑制剂A22（72.6 µM），对SaFtsZ-GFP结构无影响。 (D) 在缺乏PC190723的情况下，SaFtsZ-GFP组装需要更长时间的蛋白表达，因此在以下条件下培养的对照组培养物 30 °C 在含有DMSO的96孔板中传代培养12-15小时后也表现出FtsZ多聚体。比例尺为 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66657/66657fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="使用微分干涉相差显微镜和GFP-MreB荧光显微镜对细菌细胞进行可视化观察，不同处理条件下的结果" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66657/66657fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：PC190723 和 A22 药物对表达 GFP-EcMreB 的影响的可视化 S. pombe S. pombe 表达GFP-EcMreB的培养物在无硫胺素条件下于30 °C培养9 - 11小时 30 °C 在加入DMSO或药物（A22或PC190723）之前，将培养物置于96孔板中继续培养8 - 10小时，于 30 °C 含药物与不含药物作为对照。 （A） 在添加了等量DMSO作为对照的培养物中，细胞表现出沿酵母细胞长轴排列的EcMreB线性丝状结构。 （B） PC190723处理的培养物中GFP-EcMreB的组装未受影响56.2 µM). (C) 小分子A22（72.6 µM），一种已知的MreB聚合抑制剂，可阻止GFP-EcMreB在裂殖酵母细胞中的组装。比例尺为 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66657/66657fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
表1：本研究中使用的小鼠品系和质粒。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66657/Table%201%20_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2：本研究中使用的培养基和缓冲液的组成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66657/Table%202_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

此处使用裂殖酵母作为异源宿主，表达与GFP构成融合蛋白的细菌细胞骨架蛋白（如FtsZ和MreB），以观察其聚合行为。同时，通过荧光显微镜成像鉴定影响这些蛋白聚合的化合物。

细菌细胞骨架蛋白（如 FtsZ 和 MreB）具有多种重要功能，包括细胞分裂和细胞形态维持。此外，FtsZ 和 MreB……

我们的实验室致力于研究细胞骨架蛋白如何组装成动态结构，以调控细菌中的DNA分配和细胞分裂等功能。我们还致力于发现靶向这些细胞骨架蛋白的化合物，以开发新型抗生素。本实验方案是一种基于细胞的检测方法，其中细菌细胞骨架蛋白在真核酵母裂殖酵母（schizosaccharomyces pombe）的分子拥挤环境中发生聚合。通过这种方法，我们能够同时鉴定出那些直接影响细菌细胞骨架蛋白、聚合过程且可能具有毒性的分子。利用这种裂殖酵母平台，我们计划筛选大环类化合物文库，特异性靶向幽门螺杆菌（helicobacter pylori）和铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa）等病原菌的FtsZ蛋白。我们还计划将筛选范围扩展至产气荚膜梭菌（clostridium perfringens）中参与质粒分离的类肌动蛋白。首先，从甘油菌种中无菌划线接种一区裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）至新鲜的酵母专用平板上，以获得足够的培养物。将平板置于30°C培养48小时。48小时后，当平板上出现菌落时，用接种环挑取少量划线区域的菌体接种于5 mL缺乏硫胺素的酵母专用EMM培养基中，于30°C培养10至12小时。孵育结束后，使用半自动化的96孔多通道移液仪器，将50 µL培养物转移到含有150 µL新鲜酵母EMM的96孔板的每个孔中。在进行吸液和排液操作以充分混匀的同时，缓慢地将不同浓度梯度递增的药物分别加入已接种培养物的孔中，每种浓度设置三个重复孔。随后，加入已知的作用于细菌细胞骨架蛋白的靶向药物作为阳性对照，同时以DMSO作为溶剂对照。将对照组和药物处理的培养板在30摄氏度下孵育6至10小时。开始用20微升刀豆蛋白A（concanavalin A）包被光学透明底的96孔板的孔，室温孵育20分钟。然后吸去液体，静置晾干10分钟。将20微升来自孵育后培养板的细胞转移至刀豆蛋白A包被板的相应孔中，静置10分钟。随后，移除培养液，用无菌EMM洗涤孔内细胞3到4次。然后将该板置于由成像软件控制的倒置落射荧光显微镜下观察。为了成像细胞，选择所需的物镜。在软件的采集面板中使用导航模式进行96孔板的对齐和孔位覆盖。选择载体选项，然后对齐96孔板的孔边缘。接下来，选择孔板覆盖参数，包括对孔板中感兴趣区域进行多位置选择。在成像过程中，使用按需模式的自适应自动对焦控制，以保持样本始终处于焦点。然后，采用微分干涉差显微镜（DIC）和荧光模式采集图像。设置激发和发射滤光片以成像GFP标记的细菌蛋白。以0.2微米的步长获取穿过五微米厚酵母细胞的Z轴层扫图像。随后，在各孔板的选定位置采集图像。在使用DMSO处理的对照孔中，表达金黄色葡萄球菌FtsZ-GFP的酵母细胞在20至24小时后在整个细胞内形成斑点或斑块状的聚合结构。然而，在15至18小时时，细胞表现出弥散的荧光信号或少量斑块，表明FtsZ-GFP表达量不足以支持聚合。FtsZ-GFP稳定药物PC190723在17小时后显著增加了聚合结构的形成，作为阳性对照。相比之下，A22处理对FtsZ-GFP结构未产生影响。同样，大肠杆菌MreB-GFP在裂殖酵母细胞中沿其长轴形成线性排列的长丝结构，而PC190723对聚合过程无影响。用A22处理细胞后，荧光在酵母细胞的细胞质中呈弥散分布。

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